EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (2)

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BIOQUÍMICA BÁSICA DE MACROMOLÉCULAS
La bioquímica estudia los procesos que mantienen la vida
Quiénes participan ?
Cómo funcionan?
Para analizar esta complejidad, es necesario caracterizar las macromoléculas.
Para poder caracterizarlas, es necesario aislarlas de las complejas mezclas en que se encuentran.
Se dispone de técnicas	basadas en distintos principios para resolver estas cuestiones.
Cromatografía, electroforesis, sedimentación, espectroscopía, cristalización, entre otras.
Métodos de separación y caracterización de macromoléculas
Cromatografía
Cromatografía.
El método separativo con más ventajas
Adaptable a un amplio rango de compuestos debido a la variedad de principios de separación y de tipos de implementación experimental (capa fina, columna, membrana,gaseosa,etc).
Es útil tanto como método analítico de gran resolución como preparativo (el compuesto separado queda disponible para su utilización en nuevas etapas o final).
Permite el pasaje a escalas mayores de producción
Origen del término. Evolución de la técnica
(Mikhail Semenovich Tsweet, 1872-1919),utilizó por primera vez en 1906 el término "cromatografía". logró separar una mezcla de pigmentos de plantas (clorofilas) en una columna de carbonato de calcio
Martin y Synge desarrollaran una técnica mediante la cual se pudieran separar compuestos acuosos o hidrofílicos. En 1944 Consden, Gordon y Martin lograron separar mezclas complejas de aminoácidos en papel y fueron premiados con el Premio Nobel.
En 1959, Porath y Flodin introdujeron una nueva técnica llamada cromatografía de filtración de gel para separar componentes según su radio de Stokes (tamiz molecular)
.
De acuerdo a la disposición de la fase sólida hay distintos diseños experimentales: en columna, en capa fina o dispositivos de membrana
Columna:
lecho poroso empacado
Capa fina
Membrana
En cualquiera de los casos, el proceso se puede esquematizar de la siguiente manera:
Siembra de la mezcla de ANALITOS en la matriz equilibrada (FASE ESTACIONARIA)
Aplicación de un eluyente (FASE MÓVIL)
Recolección de los componentes en distintas fracciones
El diseño en columna es el mas difundido por su practicidad y posibilidades de implementación, sobre todo en escala analítica.
Existen numerosas variantes de cromatografías, las que pueden ser clasificadas según distintos criterios
Tipos de fases estacionaria	( sólida, líquida) y fase móvil ( gaseosa , líquida)
Fenómeno general involucrado : Partición o Adsorción
Principio de separación: según las interacciones puestas en juego
Clasificación de acuerdo al fenómeno general involucrado: 1- partición
2- adsorción
Partición entre dos fases inmiscibles Considerando las concentraciones del analito en ambas fases, se define una constante de equilibrio de distribución o partición:
Constante de equilibrio :	KD = Cs /Cm ; si tenemos en cuenta el volumen de cada fase, se pueden relacionar las masas del analito en las mismas, se define así, el Coeficiente de partición:
K= Ms/Mm	y así
Coeficiente de partición:
relacionarlo con la KD
K= Cs.Vs/Cm.Vm, K= KD. Vs/Vm
Cm
Cs
0.0
0.1
0.2
0.4
0.5
0.6
0.3
Cm
0
20
40
60
80
100
Cads
Adsorción
Cm (adsorbato f.m.) +CAdsL(Adsorbente libre)	Cs(ads.f.e.)
Cs	=	Q Kad Cm
Kad	= Cs /Cm.CAdsL
1+	Kad	Cm
Q = CAdsL + Cs
a Cm baja:
Cs/Cm ~cte
Si hay sitios puntuales de unión, en número, limitado, independientemente del tipo de interacción que predomina,
es de adsorción, pero igualmente se utiliza K
Ambos fenómenos, partición	y adsorción, ocurren según el tipo de matrices de fase estacionaria		y	fase móvil de la variante metodológica, algunas se explican mejor como partición, y otras, sobre todo cuando hay sitios específicos de interacción, responden al modelo de adsorción.
El tratamiento matemático para optimizar los diseños experimentales, se hace considerando	el coeficiente K, para todos los casos, como veremos más adelante.
Veamos un criterio más de clasificación, descriptivo de las interacciones puestas en juego entre los analitos y las fases, móvil y estacionaria, las que van a determinar una retención diferencial y posibilitar así la	separación .
	Cromatografía	Principio de separación
	Intercambio iónico	Carga
	Fase reversa	hidrofobicidad
	Hidrofóbica	hidrofobicidad
	Exclusión molecular	tamaño, forma (Rs)
	Afinidad
Covalente	interacción bio- específica
Formación y ruptura de grupos tiol
Clasificación de acuerdo al principio de separación
Veamos entonces como evaluar el resultado de un proceso cromatográfico, cualquiera sea su fundamento, es decir,
qué datos experimentales se obtienen,
cómo se expresa el resultado de la separación de componentes,
cómo se puede optimizar en función de las variables de las que depende.
Analizaremos los principios teóricos para el modelo de cromatografía sólido líquido que han sido desarrollados ampliamente explicitando las variables involucradas en el proceso
Cromatografía sólido líquido.
Principios teóricos
Definición :
Proceso dinámico de separación entre dos fases inmiscibles: estacionaria (sólida) y móvil (líquida, en nuestro caso).
En el proceso las moléculas viajan a distintas velocidades a través de la fase estacionaria , en función del balance entre las fuerzas de arrastre de la fase móvil y fuerzas de retención de la fase estacionaria
Como ejemplo, una mezcla de cinco componentes: A,B,C,D y E, se resuelve con el siguiente perfil de elución
Esta representación de datos experimentales constituye el CROMATOGRAMA
A medida que transcurre la fase móvil, registrada como volumen de elución o tiempo, se mide alguna propiedad que corresponda a los analitos	según sus propiedades , ( Absorbancia, radioactividad, etc) lo que permite identificar el momento de aparición de cada componente como un pico sobre la línea de base
Los parámetros de retención son:
KD (cte.de equilibrio de distribución o partición) K (coeficiente de partición)
Kad	(cte. de equilibrio de adsorción)
En general se utiliza K en la definición de los restantes parámetros de optimización. Se puede determinar a partir de datos experimentales (el tiempo de retención tr)
Parámetros cromatográficos
tr, K, KD, α, v, H, N, R
El tiempo de retención (o el volumen de elusión)
tr = tm (1+ K)
vsoluto
=	L / tr
;	tr = tm + ts
vm	= v = L / tm
La resolución
W = 4
De este modo podemos calcular la Resolución	(R) entre dos componentes utilizando los datos experimentales
Es la relación entre la diferencia de tiempos de retención	y el promedio del ancho de banda de ambos ( expresada en unidad de tiempo)-En la práctica, este valor debe ser igual o mayor a 1,5
tM
W
A
tRB
tRA
W
B
t
tM
WA
tRB
tRA
WB
t
tM
tRB
tRA
WA	WB
t
tM
tRB
tRA
WA	WB
t
Lo esperado es que haya buena eficiencia	E ( ancho de banda pequeño) y buena selectividad	S ( picos bien separados)
E +	E-
S +	S+
E +
E-
S -
S-
Desarrollando la expresión de la Resolución en base a la teoría de los platos teóricos, se llega a una expresión en función de los Coeficientes de partición	K	de los analitos y parámetros funcionales de la columna
Esto permite analizar como modificar esos factores para variar la Resolución
La optimización depende de tres factores relativamente independientes:
Selectividad	Capacidad	Eficiencia
Eficiencia: depende de H y L
Selectividad : depende de fase estacionaria y a veces de la móvil. Capacidad: si la fase estacionaria está en exceso , depende de la fase móvil
´
N
	2	
 1	K		2	
	1 K2	4
R 
La altura del plato teórico y el ensanchamiento de la banda (eficiencia)
HETP =	H
H =  2	/	L
H = L / N
Altura mínima para que se establezca el equilibrio entre ambas fases
N = 16 (tr / wtb) 2	número de platos teor.
La selectividad
α	= K	/K
B	A
{ H
Factores que influyen en la altura del plato teórico:Teoría de Van Deemter
Altura del plato teórico:
H = A + B/v	+ C v
A: Eddie diffusion (caminos no uniformes) B: difusión longitudinal
C: transferencia de masa fuera de equilibrioo equilibración lenta.
Se busca que esa “ altura del plato teórico” sea mínima, para que ocurra el mayor número de particiones en una dada dimensión de columna cromatográfica.
En general, cuanto más pequeñas uniformes y mejor empacadas la partículas de la fase estacionaria, menor H.
Cromatografías de aplicación	en separación y caracterización de macromoléculas
Tamiz molecular
Intercambio iónico
Hidrofóbica- Fase reversa
Seudoafinidad
Afinidad
Fundamentos de los distintos tipos de cromatografía
La fase estacionaria o matriz está constituida por:
Una matriz inerte:	base inorgánica (sílica, vidrio) o un polímero sintético (acrilamida, poliestireno) u orgánico . Los polímeros orgánicos en general son polisacáridos:
celulosa (glucosa β1-4), dextran (glucosa α 1-6 ramif 1-3),
agarosa (1-3 galactosa 1-4 (3,6) anhidro galactosa).
En la cromatografía de adsorción,	hay un grupo químico	unido covalentemente a esa matriz base, y de cuyas características va a depender la capacidad de retención.
Cromatografía de filtración por geles o Tamiz molecular	Size Exclusion)
Propiedad separativa:
Tamaño y forma (radio hidrodinámico o
radio de Stokes)
La matriz no posee grupos químicos específicos, por lo tanto no se producen interacciones intermoleculares con la misma
Está constituída por partículas porosas, de cuyo tamaño de poro depende la capacidad de tamizado o exclusión molecular
Volúmenes característicos
V0: volumen de exclusión ;	Vi:	volumen de líquido
embebido en las partículas
Vg: volumen del gel
Vt= V0 + Vi + Vg ;
Vt	: volumen total
Vt-V0 = Vi + Vg ~Vi
Condiciones importantes
El volumen de muestra en relación al de la columna
La geometría de la columna( debe tender a la máxima longitud y mínima sección)
Las condiciones de equilibrado y elusión son menos relevantes (son consistentes con la estabilidad de la muestra, condición deseada de obtención de las fracciones)
El rango de fraccionamiento
Se expresa como un rango de masas mínimo y máximo, dentro de los cuales se pueden resolver los componentes, pero en realidad depende de la forma y tamaño (Radio de Stokes)
Es diferente para proteínas globulares o polímeros no globulares
Sephacryl® 200-HR,
-5-250 kDa MW range (globular proteins)
-1-80 kDa MW range (dextrans)
Sephacryl® 300-HR
-10-1500 kDa MW range (globular proteins)
-1-400 kDa MW range (dextrans)
Proceso de separación y constante de distribución Kd
Las moléculas grandes que son totalmente excluídas de los poros eluyen primero en el volumen V0 ( Kd = 0).
Las moléculas pequeñas que penetran completamente el Vi, eluyen a un volumen
Ve= ( V0 + Vi ) ~ Vt ( Kd= 1).
Las moléculas intermedias, eluyen a un volumen
Ve = ( V0 + Kd Vi )
Kd = ( Ve- V0) / Vi	→
Kav = (Ve- V0)/ (Vt- V0)
Aplicaciones:
Separación (purificación)
Acondicionamiento de muestras (desalado,etc)
Determinación	de masas moleculares
Determinación
de masas moleculares
INTERCAMBIO IÓNICO
Variantes: Intercambio aniónico Intercambio catiónico
Cromatografía de intercambio iónico
Propiedad separativa:
Carga	y Distribución de la misma	en la macromolécula
De qué depende la carga en la macromolécula?
Del pH de trabajo en relación a sus propiedades como electrolito
Ej: para una proteína, depende de su punto isoleléctrico
Cromatografía de intercambio iónico
Si	los grupos químicos unidos covalentemente, están
cargados negativamente , es
de intercambio catiónico	y viceversa
carga -
carga -
	Medium
(X = matrix)	Nature	pH
range	Applications
	Anion exchangers			
	X-CH2N+(CH3)3	strong	2 - 11	nucleotides
	X-CH2NH+(CH3)2	intermediate	2 - 7	organic acids
	X-CH2CH2NH+ (CH3CH2)2
diethylamino-ethyl (DEAE)	weak	3 - 6	proteins
	Cation exchangers			
	X-SO3-	strong	2 - 11	amino acids
	X-COO-	intermediate	6 - 10	peptides
	X-CH2COO-
carboxymethyl (CM)	weak	7 - 10	proteins
Para las proteínas se usan los medios -débiles
Etapas del proceso
1-Equilibrado de la muestra y columna
2-Siembra y adsorción
3- Elusión
4-Regeneración
Condiciones importantes
Masa de proteínas en relación a la capacidad de la matriz .
Fuerza iónica (I) y pH	de equilibrado.
Fuerza iónica y pH de elusión y modo de elusión (isocrático o con variación de condiciones: pH , I o ambos)
Elusión con gradiente
la figura muestra la evolución de un gradiente lineal
El proceso en cromatografía de intercambio iónico y las condiciones de equilibrado y elusión
Equilibrado: pH conviene que sea una unidad por encima (aniónica) o debajo(catiónica) del pI de las proteínas a retener. I baja ya que las macromoléculas deben desplazar a los contraiones .
Unión: en las condiciones de equilibrado.
Elusión: aumento de I, aumento o disminución de pH (los contraiones desplazan a las macromoléculas)
Regeneración: alta I y luego lavado con buffer de baja I
M+X – 	M+ + X-
M+ + Y-  M+Y-
----------------------------
•
M+X -
+	Y-  M+Y - + X
Cromatografía de fase reversa y cromatografía hidrofóbica
Propiedad separativa: hidrofobicidad
Medio acuoso 1-Equilibrado: Alta fuerza iónica
2-Elusión: Fuerza iónica decreciente
Medio orgánico/aq
1-Equilibrado:
Bajo % de solvente orgánico
2-Elusión:
% creciente de solvente orgánico
Cromatografía de afinidad
Capacidad de retención:
Propiedad funcional (ligando bioespecífico) o química específica del componente.
Par de especificidad y afinidad elevada
Cromatografía de afinidad
	CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD		
	Ligando bioespecífico		Ligando pseudo-
bioespecífico
	Estrecha especificidad	Amplia especificidad	Moléculas no biológicas
	*Receptores	*Cofactores	*Iones metálicos
	*Inhibidores	*Lectinas	*Colorantes
	*Activadores		
	*Antígenos		
	*Anticuerpos		
	*Sustratos		
	PROPIEDAD	METAL
ESPECÍFICO	BIOESPECÍFICO
	Estabilidad del ligando	alta	baja
	Capacidad	alta	baja
	Condiciones de elusión	media	extrema
	Recuperación del
ligando	completa	incompleta
	Selectividad	baja-media	alta
	Costo	bajo	alto
En un solo paso se puede lograr la purificación
Condiciones importantes :
Capacidad de la matriz
Equilibrado y elusión: pH y fuerza iónica
Modos de elusión
1 y 2: Se modifica la composición del Buffer de elusión, pH, caotrópicos por ej.
3 y 4. Se utilizan competidores de la unión que desplazan la macromolécula, que eluye libre (3) o unida al competidor (4)
.
Las matrices con ligandos específicos generalmente no se pueden conseguir comercialmente, pero sí matrices activadas para unir el ligando de interés
La cromatografía de metal inmovilizado IMAC
MP---Ep--- Que ^^^^ Me :
MP: matriz polimérica
----: Enlace covalente
^^^^: Enlace de coordinación
Ep: brazo espaciador
Que: quelante (ej: iminodiacético) Me:	metal (Cu2+, Ni2+ , Zn2+ ,Co2+)
A través del Me, una proteína con grupos (parches) de histidina, triptofano,cisteína interacciona	con la fase estacionaria
Aplicación: separación en general y particularmente proteínas recombinantes con etiqueta
de polihistidina
NTA Ni
Etapas del proceso
1-Equilibrado de la muestra y columna
2-Siembra y adsorción
3- Elusión
4-Regeneración
Características
La especificidad de la retención depende del conjunto quelante-Metal y de la estructura tridimensional de la proteína (existencia de determinados residuos, ubicación espacial y entorno).
Debe impedirse la unión de las proteínas por interacciones iónicas (Adicionar NaCl)
Los metales de transición poseen afinidades y requerimientos estructurales diferentes para coordinar los grupos presentes en proteínas. La afinidad mayor es por residuos de histidina.
En general a mayor afinidad del metal por residuos histidina, menor es la especificidad: Cu>Ni≈Co>Zn
La elusión se efectúa normalmente por competencia con imidazol.
La misma matriz polimérica (Mp-Q) se puede utilizar con diferentes metales.
Muy utilizada en la purificación de proteínas recombinantes con etiquetas de polihistidinas.
	Condición de
partida	Técnica	Condición final
	Baja fuerza iónica,pH adecuado	Interc. Iónico	Alta fuerza ionica, cambio de pH
	Alta fuerza iónicaCrom. hidrofób.	Baja fuerza iónica
	Volumen pequeño de muestra	Filtración por geles	Muestra diluida
Cambio de buffer si se requiere
	Condiciones específicas de unión	Crom. de Afinidad	Condiciones específicas de elusión
Resumen de	condiciones cromatográficas
Bibliografía
Protein purification .Principles, high resolution methods and applications. Edited by Jan –Christer Janson and Lars Rydén. Second edition. 1998. JohnWiley &Sons, Inc.
The tools of the biochemistry. Terrance Cooper. 1977 John Wiley & Sons, New York
Protein purification. Principles and practice. Robert Scopes. 1982. Springer- Verlag, New York.