EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (2)

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Medida de la actividad enzimática. Métodos continuos y discontinuos 
 
Salvo para unas pocas proteínas que pueden ser detectadas por medidas 
espectroscópicas directas, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la 
reacción que cataliza, pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la 
reacción. Además, la caracterización de una enzima implica la determinación de su actividad 
en diferentes condiciones. Por esto, la medida de actividad enzimática es de importancia 
para la investigación y análisis de proteínas. 
 
La figura 1 muestra una curva típica de formación de un producto (P) en función del tiempo 
para una reacción catalizada enzimáticamente. Se observa que la velocidad disminuye con el 
tiempo, hecho que puede deberse a las siguientes causas: 
 Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima 
 El transcurso de la reacción produce una disminución significativa de la concentración 
de sustrato (S) 
 La reacción inversa puede comenzar a cursar y hacerse relativamente importante al 
aumentar la concentración de P 
 
 
La medida adecuada de la actividad de 
una enzima requiere que se determine la 
velocidad inicial, esto es, obtener la 
tangente al origen del gráfico mostrad en la 
figura 1. De esta manera, las diferentes 
causas que producen la disminución de la 
actividad con el tiempo son eliminadas. 
 
 
 
 
 
 
 
La figura 2 ejemplifica medidas 
experimentales de la formación de P en función 
del tiempo (como en la fig.1), determinadas a 
tres concentraciones diferentes de S. Puede 
observarse que la velocidad (v) que se 
obtendría en cada caso dependería del 
intervalo de tiempo que se tomara para 
medirla. 
 
En este ejemplo, si medimos v para cuando 
S=S1, obtendríamos el mismo valor, independientemente de haber elegido el intervalo 0-1 o el 
1-2. En cambio para S=S2, la v obtenida sería distinta según el intervalo elegido. Para estos 
dos casos, la v podría calcularse adecuadamente eligiendo el intervalo 0-1, donde la 
formación de P es función lineal con el tiempo. Para el ejemplo de la figura 2, la medida de v, 
Figura 1
Tiempo
0 2 4 6 8 10
P
0
2
4
6
8
 Figura 2
Tiempo
0 1 2 3 4 5
P
0
1
s1
s2
s3
 
cuando S=S3, usando el intervalo 0-1, no es enteramente confiable ya que se necesitan más 
puntos experimentales que verifiquen la condición de linealidad en la estimación de v 
realizada. 
Además de considerar la variación de la velocidad con el tiempo, hay que tener en cuenta 
que la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura, la fuerza 
iónica, el pH, la concentración de S, la cantidad de enzima en el medio de medida. Todos 
estos factores deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de 
actividad enzimática. 
La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la 
aparición de un P de la reacción en función del tiempo. La determinación cuantitativa de S o 
de P puede hacerse por diferentes métodos analíticos según el caso: espectrofotométricos 
(los más comunes), volumétricos, potenciométricos, radioquímicos, espectrofluorométricos. 
Independientemente del método utilizado, puede suceder que para, por ejemplo, una 
reacción enzimática: Sa + Sb P + Q, pueda medirse Q en presencia de los otros 
componentes de la mezcla de reacción. En este caso, la reacción enzimática podría seguirse 
continuamente en función del tiempo. En consecuencia, podrían obtenerse numerosos 
puntos experimentales (o trazos continuos si disponemos de un registrador automático) de la 
producción de Q en función del tiempo, a partir de un único medio de reacción. Esto es lo 
que se denomina método continuo de medida de la actividad enzimática. 
Los ejemplos típicos de métodos continuos empleados para medir actividad los 
constituyen las deshidrogenasas que usan NAD(P)/NAD(P)H como coenzima. Estos métodos 
se basan en que la forma reducida de la coenzima (NAD(P)H), pero no la forma oxidada 
(NAD(P)), absorbe a 340nm. 
 
Así, la actividad de la Lactato deshidrogenasa: 
Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+ 
 
 
podría seguirse por un método continuo midiendo la disminución de absorbancia a 340nm, 
con lo que se obtendría la curva mostrada en la figura 3. 
 
 
En ciertos casos, aunque no haya una 
propiedad analítica diferencial de un S o de un 
P que permita su dosaje continuo, aún puede 
medirse la actividad de una enzima por un 
método continuo si se acopla otra reacción 
enzimática a la de la enzima en cuestión. Por 
ejemplo, la actividad de la piruvato quinasa 
(PK) podría medirse en forma continua por un 
método que utilice a la LDH como enzima 
acoplada de forma que se dose el piruvato 
producido por acción de la PK: 
 
 
 
Fosfoenolpiruvato + ADP piruvato + ATP (PK) 
Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+ (LDH) 
Si las cantidades de LDH y de NADH agregadas al medio de reacción son los 
suficientemente elevadas, la disminución de la absorbancia a 340nm va a medir la velocidad 
de producción de piruvato por parte de PK. 
Figura 3
Tiempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
A
bs
 3
40
nm
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
En otros casos, la medida de la actividad de una enzima no puede hacerse 
determinando continuamente un dado S o P en presencia de los demás componentes del 
medio de medida y es necesario separar el compuesto a cuantificar, para lo cual se requiere 
detener la reacción enzimática. En estos casos se utilizan métodos discontinuos, en los 
que la medida de S o de P requiere partir de un medio de reacción diferente. Por ejemplo, la 
actividad de la ADPglucosa pirofosforilasa: 
ADPGlc + PPi Glc1P + ATP, 
puede medirse usando PPi marcado con [32P] y midiendo la formación de ATP radioactivo. Si 
no se separa el ATP formado del PPi que no reaccionó no se observa cambio de la 
radioactividad en el medio de reacción. Para determinar cuánta radioactividad está en forma 
de ATP es necesario detener la reacción enzimática y separar el ATP del PPi. De esta forma, 
para tener una curva de ATP formado en función del tiempo, es necesario preparar tantos 
medios de reacción como puntos experimentales se deseen. 
Un método discontinuo puede comprender también aquel en el que el dosaje de un S 
o P no implique su separación del medio de reacción, sino su reacción química en 
condiciones que afectan la actividad de la enzima. Por ejemplo, la actividad de la 
Fosfoglucosaisomerasa: 
Glc6P ↔ Fructosa6P 
podría medirse dosando Fru6P por el método de Roe. Pero las condiciones del método de 
dosaje hacen que necesariamente se detenga la reacción enzimática con cada medida de 
Fru6P. Se requiere nuevamente de un medio de medida de actividad por punto experimental 
de cantidad de Fru6P producida. 
Nótese que, en general, el uso de un método continuo brinda con mayor facilidad un 
número elevado de medidas de variación de S o P en función del tempo (inclusive puede 
tenerse un trazo continuo) que un método discontinuo. Por esto, y teniendo en cuenta lo 
antes mencionado sobre la variación de v en función del tiempo, al usar un método 
discontinuo para medir actividad enzimática hay que ser particularmente cuidadoso para 
estar seguro de medir velocidades iniciales.