Enzimas de restricción

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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y ESCENA DEL CRÍMEN 
Reporte de Prácticas de Laboratorio
RESUMEN.
Los fragmentos de restricción de longitud polimórfica son un tipo de polimorfismo que resulta de la variación en la secuencia de ADN reconocida por las enzimas de restricción. Es por ésto que la práctica de enzimas de restricción y la de escena del crimen que tiene un enfoque en los RFLPs, se complementan bien. Así mismo, las enzimas de restricción son aquellas que pueden reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, ésto va a tener múltiples utilidades.
La electroforesis va a ser un elemento esencial en la elaboración de éstas prácticas, es el método utilizado para observar el ADN, el ARN y las proteínas y comparar sus longitudes relativas. Esta observación es indirecta. Un solo segmento de ADN y las docenas, cientos o miles de nucleótidos que lo componen son demasiado pequeños para verlos. Sin embargo, el despliegue cuidadoso de esta técnica y la interpretación cuidadosa del patrón de bandas de fragmentos pueden revelar las diferencias más pequeñas en las secuencias de ADN que explican la variación genética entre los seres vivos.
Biología Molecular de la Célula 
Introducción
Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos ensayos útiles en investigación, desde la determinación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP), así como en la construcción de vectores con ADN recombinante y clonación de secuencias de ADN provenientes de humano, virus, bacterias y demás microorganismos de interés para la generación de conocimiento o para su aplicación en el área de ciencias biológicas. (Enzimas De Restricción | Biología Molecular. Fundamentos Y Aplicaciones En Las Ciencias De La Salud | AccessMedicina | McGraw Hill Medical, n.d.)
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas de restricción, son enzimas que cortan una molécula de ADN en un lugar particular. Son herramientas esenciales para la tecnología del ADN recombinante. En donde la enzima "escanea" una molécula de ADN en busca de una secuencia particular, generalmente de cuatro a seis nucleótidos. Una vez que encuentra esta secuencia de reconocimiento, se detiene y corta los hilos. Esto se conoce como digestión enzimática. En el ADN de doble cadena, la secuencia de reconocimiento está en ambas cadenas, pero corre en direcciones opuestas. Esto permite que la enzima corte ambas hebras. 
La mayoría de los plásmidos utilizados para la tecnología recombinante tienen secuencias de reconocimiento para varias enzimas de restricción. Esto permite que quién esté realizando el experimento elija entre varios lugares para cortar el plásmido con una enzima de restricción. Las enzimas de ligación se pueden usar para clasificar y pegar nuevas secuencias genómicas. 
Estos plásmidos mutados o recombinados pueden crecer en células bacterianas y usarse para una serie de propósitos, incluida la adición de genes. (Guruatma "Ji" Khalsa, 2010,)
Los análisis de fragmentos de restricción de longitud polimórfica, se refieren a las diferencias (o variaciones) entre las personas en sus secuencias de ADN en sitios reconocidos por las 
enzimas de restricción. Tal variación da como resultado fragmentos de ADN de diferentes tamaños (o longitudes) producidos al digerir el ADN con una enzima de restricción. Los RFLP se pueden usar como marcadores genéticos, que a menudo se usan para seguir la herencia del ADN.
Esto va a ser útil porque se va a poder aprovechar este hecho para buscar diferencias entre individuos si tienen ese sitio de enzima de restricción o no. Entonces, una sola diferencia de 
base entre dos personas podría resultar en la presencia o ausencia de ese sitio de restricción. Entonces, si aíslas ese trozo de ADN que rodea ese sitio de dos personas, una de ellas será cortada por la enzima y de la otra no. Y eso da como resultado un polimorfismo, o diferencia entre esas dos personas. Por lo general, los vemos, o los monitoreamos, aislando el ADN, cortándolo con esa enzima de restricción bacteriana y ejecutándose en un gel mediante electroforesis. 
 En un individuo, cuando no tiene el sitio de la enzima, verá una banda, y el individuo que sí tenga el sitio de la enzima, verá dos bandas, que representan los dos productos divididos. Entonces, estas diferencias en las secuencias de ácidos nucleicos y los sitios de unión de las enzimas de restricción sólo significan que hay una diferencia en la secuencia entre esas dos personas. Es un polimorfismo que podríamos usar para seguir la herencia del ADN. y ejecutarlo en un gel mediante electroforesis. (Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), 2023)
Las sondas RFLP se utilizan con frecuencia en el mapeo del genoma y en el análisis de variaciones (genotipado, análisis forense, pruebas de paternidad, diagnóstico de enfermedades hereditarias, etc.). 
(Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), n.d.)
Para llevar a cabo éste tipo de análisis se necesita una extracción de ADN a partir de material biológico, utilizando técnicas físicas y químicas. La extracción consiste en la separación y purificación del ADN con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo. (Checa Rojas, A. (2016)
Objetivos
· Entender la información brindada sobre los usos de la técnica de análisis de fragmentos de restricción polimórfica (RFLPs).
· Poder realizar la identificación en base a una muestra si es el DNA del asesino con un patrón de bandeo similar al de la muestra hemática de la empuñadura.
· Habituarnos a métodos de separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa
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· Cortar el DNA de pGLO aislado en varios fragmentos usando enzimas de restricción.
· Separar los fragmentos por su tamaño usando electroforesis en geles de agarosa. 
· Determinar el tamaño de cada fragmento.
Hipótesis
Se podrá determinar el tamaño molecular con ayuda de la electroforesis en un gel de 
agarosa, con una recta patrón de DNA de peso molecular.
Metodología
Digestión pGLO/Enzimas de restricción
Los tubos serán marcados de la siguiente manera: 
D = DNA sin enzima 
B = DNA digerido con BamHI 
E = DNA digerido con EcoRI 
H = DNA digerido con HindIII
Después, a cada tubo se le agregaron 10 microlitros de DNA de pGLO, 1.5 microlitros de amortiguador de digestión, y dos microlitros de enzima de acuerdo al siguiente esquema:
Posteriormente, a cada tubo tuvo que ser mezclado dando pequeños golpes al fondo del tubo, ser centrifugados por algunos segundos para poder bajar el líquido. Luego se pusieron a incubar los tubos a 37 grados Celsius por 60 minutos.
Recorrido éste tiempo, después de la incubación se le agregó a cada uno de los tubos tres microlitros de amortiguador con carga GelRed, y en el proceso siempre se procuró cambiar de punta de micropipeta cada vez que se realizaba el procedimiento, para que de esta manera se evitará la contaminación cruzada. 
Se depositó cinco microlitros de marcador de peso molecular en un tubo limpio y agregamos 1 ML de gel red, los tubos se mezclaron bien.
Después de todo esto, se acudió a la nuestra cámara de electroforesis, retiramos los peines y se colocó la bandeja dentro de la cámara de electroforesis; así, 
la cámara de electroforesis se llenó hasta que se cubrieron los pozos. Se tomaron 10 microlitros de cada una de las muestras, seis microlitros de marcador de peso molecular con Gelred y se colocaron en los pozos de la siguiente manera. 
Imagen 1.
Una vez colocadas las muestras, se taparon con los electrodos y se conectó a la corriente aplicando 100 voltios por 30 a 40 minutos verificando que las muestras corrieran hacia el lado positivo de la cámara. Una vez acabado, se desconectó el equipo, se retiró la bandeja para observación de DNA, y por último, el gel pudo ser inmediatamente visualizado bajo la lámpara de luz UV. 
Escena del crimen
Antes de realizarel experimento se tuvo la precaución de preparar el gel de agarosa para que así se tuviera tiempo de realizar la práctica, la preparación del gel de agarosa se hizo de la siguiente manera:
Se prepara un gel de agarosa al 1% en amortiguador TAE 1x, y se dejó solidificar el gel
Primero, los tubos fueron etiquetados de la siguiente manera:
Tubo MH: muestra hemática de la empuñadura del arma 
. Tubo S1: sospechoso 1
Tubo S2: sospechoso 2 (De nuestro equipo)
Tubo S3: sospechoso 3 
Tubo S4: sospechoso 4
Tubo S5: sospechoso 5
Tubo S6: sospechoso 6
Se colocó en cada tubo 10 microlitros de la muestra de DNA, y 10 microlitros de la mezcla de enzimas de restricción. Se mezcló el contenido con pequeños golpes y se centrifugó todas las muestras por algunos segundos a máxima velocidad. Posteriormente se incubaron todas las muestras a 37 grados Celsius durante 45 minutos. 
Colocamos el gel en la cámara de electroforesis y se añadió la cantidad de amortiguador necesaria para cubrir el gel. Una vez transcurrido el tiempo de incubación agregamos 5 microlitros de amortiguador con carga con GelRed a cada una y se agitan con pequeños golpes centrifugándolas por unos segundos a velocidad máxima. 
En el primer carril del gel de agarosa se colocaron 10 microlitros de marcador de 
masa molecular de dna. Posteriormente se colocaron 10 20 microlitros de cada una de las muestras de la siguiente manera:
Imagen 2.
Se cerró la cámara de electroforesis, se conectaron los electrodos a la fuente de poder y encendería para graduar el voltaje hasta 100 voltios durante 30 o 40 minutos, una vez transcurrido ese tiempo se retiró el gel para observarlo en el transiluminador.
Resultados.
Para el procedimiento de enzimas de restricción se construyó una curva de tal forma que en el eje de las ordenadas se colocaron los valores del tamaño de los fragmentos del marcador molecular y en el eje de las abscisas la distancia de migración de cada banda resultando de la siguiente forma::
Tabla 1. Distancia de migración del Mpb en función al tamaño de los fragmentos del marcador
La gráfica 1 fue realizada con el programa de hojas de cálculo Excel el cual facilitó la obtención del tamaño de los fragmentos de interés a través de una línea de tendencia con comportamiento exponencial derivado del mismo gráfico. Además también proporciona la ecuación de dicha línea de tendencia con la que prácticamente solo se necesita sustituir la variable x por el valor de la migración de la banda problema en mm:
En el caso de la práctica de escena del crimen se siguió el mismo método exceptuando por los valores de entrada para la creación de la curva y la migración de las bandas problema
Tabla 2. Distancia de migración del Mpb en función al tamaño de los fragmentos del marcador.	Comment by Diego Antonio Rojas Palma: Poner la descripción de acuerdo a esta parte
El tamaño aproximado de los fragmentos de restricción se muestran en la siguiente tabla:
Gráfica 1. Curva resultante de graficar los datos de la tabla 1.	Comment by Diego Antonio Rojas Palma: 1 reacción en totalMariana Valentina Medina Mata reaccionó con 😭 a la/s 2023-05-31 23:08 p. m.Tabla 3. Tamaño de los fragmentos de restricción.
Digestión pGLO/Enzimas de restricción
Imagen 4.
Escena del crimen
 
El tamaño de los fragmentos de restricción para este apartado se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 3. Tamaño de los fragmentos de restricción
Discusión
Un tipo de polimorfismos resultante de la variación en las secuencias de DNA, los fragmentos de restricción polimórfica, son reconocidos por las enzimas de restricción, con este enfoque, se puede complementar de una buena manera la práctica y la técnica utilizada. 
Esta práctica se desarrolló con el objetivo de determinar el tamaño de los fragmentos de DNA que estamos estudiando, se logró con ayuda de un marcador de peso molecular, que es cualquier característica heredable que ayuda a identificar las diferencias entre organismos.
Durante el desarrollo de esta práctica, se utilizaron diferentes enzimas, en el caso de este quipo se utilizó EcoRI, que será el encargado de adherirse a las secuencias, y las otras enzimas utilizadas por el resto del grupo fueron BamHI Y Hind 111.
EcoRI tiene la capacidad de reconocer y cortar sitios específicos y produce extremos sobresalientes de la cadena sencilla.
7Imagen 7. Obtenida de:https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase
La mayoría de las enzimas dejan un fragmento de los nucleótidos que no están apareados, que es el extremo cohesivo, con EcoRI sucede, y esto ayuda porque en la clonación se mantienen los dos fragmentos de DNA justos.
Para la digestión con dichas enzimas mencionadas anteriormente, en los carriles (8), se colocaron las muestras y se utilizó un marcador muestra para guiarse del peso molecular, y así también poder determinar su tamaño, y determinar el número de pares de bases para analizar. 
Se trabajó con DNA plasmídico de pGLO, y funcionó de la siguiente manera:
Cuando corría el gel, los fragmentos cortos viajaban más rápido por medio de los poros de la matriz, por lo que los más cortos se encontrarán cerca del lado positivo, y los largos se encontrarán cerca de los pozos.
Relacionado al corrimiento de los geles, los más cortos son los que viajan más rápido, por lo tanto, son aquellos que se encontrarán más cerca del lado positivo, y, para los que son de mayor longitud se quedarán cerca de los pozos.
Existen factores que pueden alterar la migración del DNA, como lo son la concentración de agarosa, la conformación del DNA, etc.Imagen 8. Obtenida de: https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis
En la práctica de escena del crimen, es importante retomar que las enzimas son muy sensibles a la temperatura. A bajas temperaturas, la mayor parte de las enzimas muestra poca actividad porque no hay suficiente cantidad de energía para que tenga lugar la reacción catalizada. A temperaturas más altas, la actividad enzimática aumenta a medida que las moléculas reactantes se mueven más rápido para generar más colisiones con las enzimas, es por esto que incubamos las muestras a 37 grados centígrados. 
En ambas prácticas se utilizó GelRed como colorante para intercalar las bases del DNA y estos son fluorescentes ante la luz UV.
Imagen obtenida de Imagen 9. Obtenida de: https://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/practica_7.pdf
En este caso, para la escena del crimen de las bandas resultantes tras realizar la electroforesis se nos muestra se puede apreciar la distinción y distribución en cuanto a las enzimas que realizaron los cortes de todas solamente hay 2 que poseen un parentesco que es la banda número 1 y la banda número 3 con esto podemos deducir y darnos una idea de quién es el asesino ya que uno es una muestra de sangre y la otra es la muestra recolectada.
Conclusión
Los RFLPs, o conocidos como los fragmentos de restricción de longitud polimórfica, se definen como una variación de una secuencia de DNA que se reconoce con enzimas de restricción, enzimas bacterianas que utilizan los científicos para cortar la molécula de DNA en lugares específicos, y normalmente para visualizarlos se utiliza la electroforesis en gel. Se utiliza como marcadores de localización de DNA genómico. Tienen una gran importancia debido a que con ello se pueden localizar pedazos de DNA que se pueden modificar con ayuda de las enzimas de restricción, esto, para que después se pueda unirse y hacer un corte en él, y así, puede crear diferencias entre las bases, y se pueden aislar pedazos de DNA.
Las diferencias en las secuencias y donde se unen las enzimas nos quiere decir que existe una diferencia entre secuencias de 
dos personas, no necesariamente que en una pueda no existir una enfermedad, sino que puede tratarse de un polimorfismoque se puede estudiar relacionado a la herencia.
Las enzimas de restricción son proteínas aisladas a partir de las bacterias que cortan secuencias de DNA en lugares específicos, y se obtiene una secuencia conocida en cada extremo, estas se emplean en métodos como la tecnología del DNA recombinante, y la modificación genética, reconocen pares de bases, y se genera una secuencia palindrómica.
Referencias.
 Facultad de Ciencias. (2013). MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA I. Colegio de Profesores Departamento de Biología Celular.
Enzimas de restricción | Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud | AccessMedicina | McGraw Hill Medical. (n.d.). https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473§ionid=102743841
Guruatma "Ji" Khalsa. (2010, April 12). Restriction Enzymes. ASU - Ask A Biologist. Retrieved May 26, 2023 from https://askabiologist.asu.edu/restriction-enzymes
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). (2023). Genome.gov. https://www.genome.gov/genetics-glossary/Restriction-Fragment-Length-Polymorphism
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). (n.d.)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrflp/
Checa Rojas, A. (2016, 22 de Junio ) Extracción de ADN. Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Mayo 31, 2023
Las enzimas de restricción y la ADN ligasa (artículo) | Khan Academy. (s. f.). Khan Academy. https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase
Electroforesis en gel (artículo) | Khan Academy. (s. f.). Khan Academy. https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a
/gel-electrophoresis
Consejo de educación técnico profesional, “Factores que afectan a la actividad enzimátca”. Química bio-orgánica. 2020. https://uruguayeduca.anep.edu.uy/sites/default/files/inline-files/Factores%20que%20afectan%20la%20actividad%20enzim%C3%A1tica.pdf
Instituto Nacional de Salud, Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN, Lima 2003, https://bvs.ins.gob.pe/insprint/SALUD_PUBLICA/NOR_TEC/38.pdf
Universidad del País Basco, Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Caracterización electroforética de ADN plasmídico, https://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/practica_7.pdf