Identificación bacteriana II

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 
Facultad de Medicina 
Departamento de Microbiología 
 
PRÁCTICAS DE LABORATORIO 
 
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA II 
 
 
Maye Bernal Rivera 
Profesora Asociada 
 
PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS 
 
Para la lectura, interpretación e identificación del crecimiento bacteriano, primero que 
todo se sigue un estudio cualitativo que comprende los siguientes parámetros: 
 
 
A. Características Macroscópicas de las colonias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cultivos Puros 
 
 
 
 
Medios Líquidos 
 
• Enturbiamiento: parejo, 
en ondas, cordones 
suspendidos 
 
• Capas superficiales 
 
• Precipitados: 
polvoriento, granuloso, 
viscoso. 
 
• Pigmentos difusibles 
 
 
Medios Sólidos. Estudio de Colonias: 
 
Tamaño: puntiforme, pequeño, mediano, grande, 
extendidas en velo, invadiendo toda la superficie del 
medio. 
Forma: circular, alargada, irregular, filamentosa, rizoide, 
fusiforme. 
Bordes: enteros, dentados, lobulados, rizoides. 
Superficie: lisa, rugosa. 
Levantamiento: plana, convexa, acuminada, umbilical 
Consistencia: mucoide, friable, seca, viscosa 
Transparencia: transparente, traslucida, opaca 
Color: blanco, amarillo, gris, verde, rojo, etc. 
 
 
 
 
Cultivos Mixtos 
 
 
 
 
B. Cambios Producidos en el medio 
 
• Pigmentos difusibles (bacterias pancromóforas) que cambian el color del medio: verde, 
amarillo, rojo, marrón, etc. 
• Olor: algunas bacterias emiten olores característicos, como a frutas, chocolate, queso, 
etc. 
• Hemólisis: alfa, beta, beta prima y gamma (no hemolíticas). 
• Metabolismo 
 
Cambios producidos en el medio 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pigmentos 
 
 
 
 
 
 
C. Características Microscópicas de las colonias 
 
Las características microscópicas de las colonias se estudian 
mediante la coloración de Gram, una coloración compuesta, 
que permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: 
Gram Positivas y Gram Negativas. 
 
La coloración fue desarrollada en 1884 por Hans Christian Joachim 
Gram, farmacólogo, patólogo y eminente profesor de Medicina 
Interna. Esta coloración posiblemente es el procedimiento más 
trascendental para el diagnóstico bacteriológico jamás 
desarrollado. 
 
 
Además de la afinidad, esta coloración permite establecer: 
 
a. Morfología: cocos, bacilos, espirilos, cocobacilos, vibrios, etc. 
b. Agrupación: en pares, cadenas, tétradas, racimo, sarcina, empalizada, caracteres, etc. 
 
c. Afinidad: gram positiva o gram negativa 
d. Otras estructuras: A veces la coloración de Gram permite observar cápsulas, pero hay 
coloraciones específicas para determinar la presencia de otras estructuras bacterianas, por 
ejemplo: 
• Cápsula (Tinta China, Hiss) 
• Esporos (Shaeffer Fulton) 
• Flagelos (Leiffson) 
• Gránulos metacromáticos (Van Stoltemberg, Loeffler ) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
D. Pruebas bioquímicas 
 
Posteriormente se hacen pruebas bioquímicas que permiten el estudio del 
metabolismo para la identificación de género y especie. 
 
E. Pruebas Biológicas 
 
El uso de animales para el aislamiento y la identificación de agentes patógenos está 
limitado a laboratorios de experimentación, ya que hoy en día se cuenta con equipos 
automatizados, pruebas inmunológicas, por técnicas moleculares y de 
nanotecnología, para llegar al diagnóstico etiológico del agente infeccioso. 
 
F. Pruebas Inmunológicas 
 
Se basan en la utilización de anticuerpos específicos para la detección de antígenos 
presentes en las bacterias (polisacáridos capsulares, proteínas flagelares y otros 
Coloración de Gram 
 
Procedimiento: 
 
1. Cristal Violeta 1 minuto 
- Lavar con agua corriente 
2. Lugol 1 minuto 
- Lavar con agua corriente 
3. Alcohol Acetona 5 segundos 
- Lavar con agua corriente 
4. Safranina 30 segundos 
- Lavar con agua corriente 
 
 
Ver: 
https://drive.google.com/drive/folders/1QQfmzWiy2foswrMaGt1RPIt
TqJKoUz_d?usp=sharing 
varios componentes de la pared celular). La detección puede hacerse en la bacteria 
completa o libre, en antígenos solubles. 
 
G. Otras pruebas diagnósticas 
 
• Pruebas de Biología Molecular: estas pruebas se han convertido hoy en día en el 
criterio principal para la clasificación taxonómica, identificación bacteriana y 
diagnóstico etiológico en enfermedades infecciosas y en estudios epidemiológicos; 
basadas en el grado de relación entre las secuencias de los ácidos nucleicos, mediante 
análisis bien sea del DNA o RNA de los microorganismos. 
 
• Nanotecnología: cada día aumenta la implementación de esta tecnología de punta, que 
utiliza la detección escanométrica de formaciones de DNA por el método de sondas 
hechas de nanopartículas, la cual detecta formaciones del DNA combinadas, 
específicas para cada bacteria permitiendo su identificación inmediata. Emplea 
detección de oligonucleótidos blanco, etiquetados con nanopartículas. 
 
• FilmArray™: este es un sistema de PCR multiplex que integra la preparación, 
amplificación, detección y análisis de agentes patógenos (virus y bacteiras) en 
muestras. 
Ver: https://www.youtube.com/watch?v=tRH1OFiegjY 
 
• MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization): Este sistema emplea la 
técnica de espectrometría de masas con el fin de identificar género, especie y cepa del 
agente patógeno. 
 
Ver: https://www.youtube.com/watch?v=0jeFpXHZ8W0 
 
• GeneXpert: Este sistema es un sistema automatizado que realiza amplificación de 
ácidos nucleicos empleando cartucho para diagnóstico de agentes como tuberculosis 
y SARS-CoV2. 
Ver: https://www.youtube.com/watch?v=mIsBLmjus6Q 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Materiales 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivos específicos 
 
• Conocer el procedimiento de la coloración de Gram 
• Reconocer las diferentes características morfológicas bacterianas 
• Identificar los diferentes tipos de agrupación bacteriano 
• Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas. 
• Conocer cultivos mixtos 
• Aprender a distinguir los tipos de hemólisis 
 
 
- Cultivos bacterianos (3 Tubos, 3 cajas) 
- Láminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente 
- Colorantes para gram 
- Microscopio y aceite de inmersión 
- Faringocultivo 
 
Gota de solución salina + colonia del agar sangre 
Procedimiento 
 
 
1. Estudio Macroscópico y Cambios producidos en el medio 
 
Se observan cambios en los medios de cultivo tales como: 
- Presencia y tipo de hemólisis en agar sangre 
- Pigmentos difundidos al medio en agar nutritivo 
- Cambios de color por reacciones de fermentación en el agar MacConkey. 
 
2. Estudio Microscópico 
 
Se debe realizar un frotis a partir del caldo y a partir de una colonia del agar sangre. 
 
a. Identificar la lámina: Destinar un tercio de la lámina para identificarla, utilizando 
marcador de vidrio o cinta de enmascarar (si la lámina es esmerilada, usar lápiz) 
 
 
 
b. Hacer el frotis: 
 
 
A partir de caldo: esterilizar el asa, 
enfriarla dentro del caldo, sacudirla 
contra la pared del tubo, sacar una 
“asada” y distribuirla en forma circular, 
cerca al sitio de identificación de la 
lámina. Dejar secar a temperatura 
ambiente 
 
 
A partir de agar: colocar una gota de 
solución salina estéril en el costado 
distal de la identificación, esterilizar el 
asa, enfriarla en el borde del agar, 
tocar la superficie central de la colonia 
y homogenizar con la gota de solución 
salina, en forma circular. Dejar secar a 
temperatura ambiente 
 
 
 
c. Fijar al calor: flamear unas dos o tres veces, controlando la temperatura de la lámina 
en el dorso de la mano para evitar que se quemen las células bacterianas 
 
d. Colorear con Gram (ver técnica arriba) 
 
Caldo 
e. Secar con papel absorbente: secar el reverso de la lámina, colocar el papel sobre la 
mesa de trabajo, voltear la lámina y hacerle una ligera presión 
 
f. Dejar secar completamente: colocar en posición vertical hasta que esté 
completamente seca. 
 
g. Adicionar aceite de inmersión: dejarcaer una gota sobre el área de la preparación. 
 
h. Observar al microscopio: enfocar en 10X y observar en 100X 
 
i. Informar la morfología, afinidad y agrupación en caso de ser específica y 
predominante. 
 
 
3. Faringocultivo: Lectura e interpretación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ACTIVIDAD 
 
1. Escriba los pasos a seguir para el estudio de las colonias bacterianas. 
 
2. ¿Qué importancia tiene la identificación de la morfología, tipo de agrupación y 
afinidad de tinción de Gram como herramienta diagnóstica? 
 
3. De ejemplos de 5 medios de cultivos utilizados (diferentes a los descritos en el 
cuadro de la parte I) que se utilicen en el laboratorio de Microbiología para el 
aislamiento bacteriano en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. 
 
4. ¿Cómo se define un portador sano?, escriba dos ejemplos diferentes a “Mary 
Mallon” 
 
5. ¿Cómo debe solicitarse un faringocultivo de rutina y uno para patógenos 
específicos? 
 
6. ¿Como debe informarse un faringocultivo? 
 
7. Describa los pasos para realizar la coloración de Gram. 
 
 
• Observar la superficie del agar sangre para determinar si es un 
cultivo mixto o puro. 
 
• Observar a trasluz para buscar colonias betahemolíticas. 
 
• Observar el agar chocolate para determinar si el cultivo es mixto o 
puro. 
 
8. Escriba 5 entidades que puedan diagnosticarse mediante la coloración de Gram. 
 
9. Escriba 5 entidades en las que la coloración de Gram, no tenga utilidad. 
 
10. Enumere otras metodologías que se utilicen para hacer el diagnóstico etiológico.