Cocos Gram Positivos

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 
Facultad de Medicina 
Departamento de Microbiología 
 
PRÁCTICA VIRTUAL DE LABORATORIO 
 
COCOS GRAM POSITIVOS 
 
 
INTRODUCCIÓN 
Los cocos Gram positivos - excluyendo las enterobacterias - son los microorganismos más 
frecuentemente aislados de muestras de pacientes, y se han involucrado como agentes 
importantes en procesos de enfermedades infecciosas desde el año 1836. Se encuentran 
ampliamente distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora microbiana normal de la piel 
y las mucosas tanto en el ser humano como en animales. Las infecciones en el hombre se 
producen por contacto directo con individuos infectados o portadores sanos, por heridas o por 
penetración a través de piel y mucosas mediante objetos cortopunzantes, trauma o 
procedimientos quirúrgicos. También se generan estados patológicos por la acción de toxinas 
producidas por cepas de algunas especies. 
 
Cuando se obtienen muestras clínicas en pacientes con ciertas entidades patológicas en las 
cuales los microorganismos Gram positivos pueden ser los agentes causales, se siguen procesos 
rutinarios de laboratorio para la identificación del patógeno y se realizan pruebas de 
susceptibilidad. Esta serie de pasos se resumen en el siguiente esquema: 
OBJETIVO 
Correlacionar las herramientas del laboratorio clínico en el diagnóstico de Cocos patologías 
causadas por bacterias Gram Positivas. 
 
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G É N E R O S T A P H Y L O C O C C U S 
Los estafilococos son células esféricas Gram positivas 
dispuestas en grupos semejantes a racimos de uvas en 
medios sólidos, o en pares, cadenas o tétradas en medios 
líquidos. Crecen bien en medios simples y, de acuerdo con 
la especie, producen diferentes pigmentos: blanco, amarillo 
y dorado. Algunas de ellas también producen beta 
hemólisis. Son catalasa positiva, inmóviles, no esporulados 
- con raras excepciones -, no encapsulados y son aerobios 
o anaerobios facultativos. 
 
Diagnóstico de Laboratorio 
Las colonias de estafilococo son fáciles de reconocer. Son 
relativamente grandes y tienen de 2 a 3 mm o más, dependiendo de la 
edad del cultivo. Las colonias son circulares, convexas, de superficie 
lisa, bordes enteros, cremosas, blancas, amarillas o doradas. 
Para iniciar la identificación, además de las características de 
crecimiento tanto en medio líquido como sólido y la coloración de 
Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del 
género estreptococo, el cual carece de esta enzima. Para identificar 
especies se utilizan diferentes pruebas bioquímicas dentro de las 
cuales están las siguientes: 
Modificado de: OpenStax Microbiology 1980 Dr. Richard Facklam 
https://cnx.org/contents/5CvTdmJL@4.4 
ASM MicrobeLibrary.org 
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• Catalasa 
Principio: la catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) 
en agua y oxígeno según la siguiente reacción: 
 
2H2O2 → 2H2O + O2 (burbujas de gas) 
 
La prueba catalasa se usa con frecuencia, para diferenciar miembros de la familia 
Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae. 
 
Procedimiento: con palillo de madera se transfiere parte del centro de una colonia a la 
superficie de un portaobjetos y se agrega una gota de H2O2 al 3%. 
Resultados 
 
- Positiva: aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia. 
- Negativa: pocas burbujas pequeñas después de 20 a 30 segundos. 
*Falsas Positivas: los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe tenerse cuidado 
de no tomar eritrocitos del agar sangre junto con el material de la colonia. 
 
 
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• Coagulasa 
Principio: La coagulasa es una proteína con una actividad similar a la protombina, capaz 
de convertir el fibrinógeno en fibrina. Esto da como resultado la formación de un coágulo 
visible en los sistemas apropiados. Se utiliza para identificar Staphylococcus aureus de 
otras especies. La coagulasa se presenta en dos formas, ligada y libre y para 
determinarlas se utilizan dos procedimientos: en lámina y en tubo; si la prueba en lámina 
da positiva, no hay necesidad de hacer la prueba en tubo. 
 
Prueba en lámina: se coloca una gota de plasma, se agrega la colonia en estudio y 
posteriormente se mezcla. 
Resultados Positivo: La presencia de aglutinación o formación de grumos 
 Negativo: No se observa aglutinación, permanece emulsionada la colonia 
 
Prueba en tubo (Coagulasa libre): se agrega la colonia en estudio al tubo de ensayo y se 
incuba a 35°C por 4 horas. Si no hay presencia de coágulo, se debe reincubar por 24 
horas a temperatura ambiente. 
 Resultados Positivo: formación de un coágulo. 
 Negativo: permanece líquido el plasma. 
 
 
 FACULTAD DE MEDICINA - UN 
 
 
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• Manitol 
 
Principio: el microorganismo utiliza al manitol como sustrato y lo incorpora por la vía 
Embden-Meyerhoff-Parnas, que tiene como productos finales ácidos, los cuales 
disminuyen el pH en el medio de cultivo. Esto se detecta mediante el viraje del indicador 
rojo de fenol a amarillo. 
 
Procedimiento: Se siembra la colonia en el caldo y se incuba por 24 horas. 
 
Resultados: Positivo: El indicador del medio vira a amarillo 
 Negativo: El medio conserva su color rojo. 
 
 
 FACULTAD DE MEDICINA - UN 
 
• DNAsa 
Principio: Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa, que es capaz de clivar 
los enlaces fosfodiester internos de la molécula de DNA. Para evidenciar la presencia de la 
enzima, se inunda el medio con ácido clorhídrico normal, el cual precipita la molécula del 
ácido, pero no sus polímeros. 
 
Procedimiento: Sembrar por estría gruesa la colonia en estudio en el agar DNA e incubar a 
35ºC por 24 horas. Pasado este tiempo, inundar la superficie del medio con HCL 1 Normal, 
esperar 2 minutos. 
 
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Resultados 
Positivo: la formación de un halo transparente alrededor de la siembra indica presencia de 
DNAsa. 
Negativo: la formación de un precipitado alrededor de la siembra indica ausencia de la enzima 
 
 
Modificado de https://microbiologyinfo.com/deoxyribonuclease-dnase-test/ 
 
 
• Novobiocina 
 
Principio: Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y 
resistentes al antibiótico Novobiocina. Staphylococcus saprophyticus es una de las especies 
resistentes, la más frecuente en humanos, causante de infecciones del tracto urinario. Por lo 
tanto, esta prueba proporciona una identificación presuntiva confiable de esta especie. 
 
Procedimiento: Se debe preparar la suspensión (equivalente al estándar 0.5 de McFarland) del 
microorganismo en agua destilada. Se siembra con escobillón en forma masiva sobre la placa 
de Mueller Hinton y se coloca con la pinza un disco de novobiocina en el centro. Se incuba por 
24 horas a 35°C. 
 
Resultados 
Sensible: Halo de inhibición > 16 mm Resistente: Halo de inhibición < 12 mm 
 
 
 
 
 
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 NOVOBIOCINA FACULTAD DE MEDICINA - UN 
 
 
Algoritmo de Identificación 
GÉNERO Staphylococcus 
 
 
 
 
 ASM MicrobeLibrary.org FACULTAD DE MEDICINA – UN FACULTAD DE MEDICINA – UN 
 
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G É N E R O S T R E P T O C O C C U S 
Los estreptococos son células esféricas uovaladas Gram positivas dispuestas en pares o 
cadenas cortas o largas. Son más exigentes que 
los estafilococos, no crecen en medios simples, y 
por el contrario, requieren de factores de 
crecimiento como la sangre y sus derivados. 
Producen diferentes tipos de hemólisis, 
característica que permite clasificarlos en beta-
hemolíticos, alfa-hemolíticos o no hemolíticos. No forman pigmentos, son catalasa negativa, 
inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios y anaerobios 
facultativos. 
 
 
FACULTAD DE MEDICINA - UN 
 
Diagnóstico de Laboratorio 
Las colonias de estreptococos son variables, dependiendo de la especie. Para iniciar la 
identificación, además de las características de crecimiento tanto en medio líquido como sólido y 
la coloración de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del género 
estafilococo, el cual produce esta enzima. 
Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas bioquímicas dentro de las cuales están las 
siguientes: 
FACULTAD DE MEDICINA - UN 
 
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• Bacitracina 
Principio: Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones (0.04U) de 
Bacitracina. 
Procedimiento: Sembrar la colonia masivamente en cuadrícula sobre una placa de agar 
sangre, colocar un disco de bacitracina y presionar suavemente. Posteriormente incubar a 
35°C por 24 horas. 
 
Resultados: 
Sensible: cualquier halo de inhibición alrededor del disco 
Resistente: crecimiento alrededor del disco 
 
 
FACULTAD DE MEDICINA – UN 
 
 
• CAMP 
 
Principio: Se basa en que Streptococcus agalactiae produce un factor llamado CAMP 
(factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida 
por algunas cepas de Staphylococcus aureus productoras de ß lisina. 
Procedimiento: Sembrar sobre la placa de agar una estría de estafilococo ß lisina positivo. 
Perpendicular al estafilococo, hacer una estría con la colonia en estudio e incubar a 35°C por 
24 horas. 
 
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• Optoquina 
 
Principio: el clorhidrato de etildihidrocupreína (optoquina) a muy bajas concentraciones, 
inhibe en forma selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae. La optoquina 
puede inhibir a otros estreptococos del grupo viridans, pero solo a concentraciones más 
altas. 
Procedimiento: Sembrar la colonia masivamente en cuadrícula sobre una placa de agar 
sangre. Colocar un disco de Optoquina y presionar suavemente. Incubar a 35ºC por 24 horas. 
Resultados 
Sensible: aparición de un halo de inhibición > 16 mm de diámetro 
Resistente: crecimiento alrededor del disco o halos < 16 mm 
 
 
FACULTAD DE MEDICINA – UN 
 
 
Resultados Positivo: presencia de zona de hemólisis en forma de flecha 
 Negativo: Ausencia de la hemólisis en flecha 
 
 
Modificado de ASM MicrobeLibrary.org 
 
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• Solubilidad en Bilis 
 
Principio: Se basa en la capacidad de determinadas especies bacterianas de lisarse en 
presencia de sales biliares, las cuales disminuyen la tensión superficial y destruyen la 
célula. Este fenómeno es especialmente evidente sobre colonias de S. pneumoniae 
Prueba en tubo: Se debe preparar la suspensión (equivalente al estándar 0.5 de McFarland) 
del microorganismo en solución salina estéril. Dividir la suspensión en dos tubos iguales, 
en uno añadir solución salina y al otro desoxicolato de sodio al 2% (sales biliares). Incubar 
a 35°C – 37°C durante 2 horas. Si el tubo se aclara o pierde turbidez, el resultado es 
positivo. 
 
Modificado de https://microbiologyinfo.com/bile-solubility-test-principle-reagents-procedure-and-result-interpretation/ 
 
Prueba en placa: Aplicar una gota de la solución de desoxicolato de sodio al 10% 
directamente sobre la colonia de la cepa sospechosa. Mantener la placa a temperatura 
ambiente (25°C a 27°C) durante 15 minutos o hasta que se seque el reactivo de la sal de 
bilis. El resultado es positivo si las colonias desaparecen o aparecen como colonias 
aplastadas. 
 
Modificado de: https://co.pinterest.com/pin/758434393471419925/?nic_v2=1a6KW9tMu 
 
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Algoritmo de Identificación 
GÉNERO Streptococcus 
 
 FACULTAD DE MEDICINA – UN FACULTAD DE MEDICINA – UN 
 
 
 
 
 
G É N E R O E N T E R O C O C C U S 
Los enterococos son células esféricas Gram positivas 
dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual que los 
estreptococos, requieren de factores de crecimiento 
como la sangre y sus derivados. Son capaces de 
desarrollarse en medios que contienen altas 
concentraciones de NaCl (6.5%) y de bilis (40%). Pueden 
producir hemólisis de tipo alfa, beta o ser no hemolíticos. 
No forman pigmentos, son catalasa negativa, inmóviles, 
no esporulados, con formación de cápsula variable. Son 
aerobios y anaerobios facultativos. 
Obtenido de JULIET L., CHRYSTAL. (2002). Estudio de 
susceptibilidad in vitro de Enterococcus spp. Revista chilena de 
infectología, 19(Supl. 2), 111-115. 
https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182002019200009 
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Diagnóstico de Laboratorio 
Las colonias de enterococos son variables, dependiendo de la 
especie. Para iniciar la identificación, además de las características 
de crecimiento tanto en medio líquido como sólido y la coloración 
de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite 
diferenciarlos del género estafilococo, el cual produce esta enzima. 
Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas bioquímicas 
dentro de las cuales está: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FACULTAD DE MEDICINA - UN 
 
• KF 
 
Principio: Determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en un medio inhibidor y 
fermentar un carbohidrato produciendo un cambio de color. 
Procedimiento: Sembrar por doble picadura y estría en la superficie del agar KF e incubar a 
35°C por 24 horas. 
 
Resultados Positivo: El medio vira a amarillo 
 Negativo: el medio permanece del color original 
 
FACULTAD DE MEDICINA - UN 
 
 
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• Agar bilis esculina 
 
Principio: Los enterococos son microorganismos con capacidad de hidrolizar la esculina 
en esculetina y glucosa. La esculetina reacciona con una sal de hierro cambiando el color 
del medio a castaño oscuro o negro. Por otro lado, la adición de bilis al medio inhibe el 
crecimiento de la mayoría de los estreptococos, razón por la cual este agar se utiliza para 
diferenciar entre las bacterias de los géneros Enterococcus y Streptococcus, dado que los 
enterococos son capaces de crecer en presencia de un 40% de bilis. 
 
Procedimiento: Siembra en el medio e incubación en condiciones de aerobiosis, a 35° a 
37°C hasta por 72 horas 
 
Resultados Positivo: se observa un oscurecimiento del medio de cultivo 
 Negativo: medio permanece igual 
 
 
Modificado de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bile_esculin_agar_test.jpg 
 
 
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Algoritmo de Identificación 
GÉNERO Enterococcus 
 
 
 FACULTAD DE MEDICINA - UN