P08. ELISA

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E.P de Ingenieria Biotecnologica	 UCSM		Inmunología Básica
PRACTICA Nº 8
ENSAYO POR INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA)
 DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS CITRULINADOS
1. OBJETIVOS
· Cuantificar cualitativamente los niveles de anticuerpos contra proteínas y péptidos citrulinados (Anti-CCP).
· Comprender el fundamento de la técnica ELISA como técnica de diagnóstico inmunológico.
2. INTRODUCCION
La artritis reumatoide (AR) es la enfermedad articular más frecuente, con una prevalencia mundial estimada en 0,5-1% (Dejaco et al., 2006). La prueba serológica de apoyo diagnóstico más tradicional para esta enfermedad ha sido la determinación del factor reumatoide, la cual adolece de una baja especificad diagnóstica. A pesar de que el factor reumatoide puede ser encontrado hasta en el 80% de los pacientes que sufren AR, es conocido que otras enfermedades autoinmunes, y aún hasta un 5-30% de personas sanas de edad avanzada, pueden presentar este marcador serológico. Algunos otros autoanticuerpos que se encuentran en los pacientes con AR poseen menor sensibilidad diagnóstica, pero mayor especificidad para detectar esta enfermedad. Entre estos autoanticuerpos están el denominado "factor perinuclear" y los anticuerpos anti-keratina. Al estudiar la especificidad molecular de estos autoanticuerpos, se encontró que reconocen una proteína producida en las etapas avanzadas de la diferenciación de las células epiteliales durante la queratinización, llamada filagrina (Kuhn et al., 2006).
Durante el procesamiento de la filagrina, algunos de sus residuos de arginina son eliminados por enzimas de la familia de las peptidilarginina deiminasas (PADs), que los convierten de esta manera en residuos de citrulina (Fig.1). El suero de los pacientes con AR posee frecuentemente anticuerpos que reconocen regiones citrulinadas de la filagrina, así como de al menos dos proteínas más que presentan este tipo de modificación postraduccional, como lo son la fibrina y la vimentina citrulinadas. Interesantemente, existe evidencia de que los autoanticuerpos que reconocen proteínas citrulinadas no solo tienen un interés diagnóstico, sino que pueden jugar un papel patogénico en modelos de artritis reumatoide experimentales (Kuhn et al., 2006), a diferencia del factor reumatoide.
Las primeras pruebas serológicas dirigidas a detectar anticuerpos contra filagrina citrulinada utilizaron esta proteína, obtenida en forma recombinante y posteriormente modificada in vitro. Sin embargo, algunas de las limitaciones de esta estrategia fueron la dificultad en obtener un contenido reproducible de citrulina en este antígeno, afectando la estandarización de la prueba. Sumado a esto, se demostró que en los sueros de pacientes con AR y aún en individuos sanos, pueden hallarse autoanticuerpos contra la filagrina no citrulinada, que podían conducir a resultados falsamente positivos. Un adelanto importante en el desarrollo de estas pruebas sobrevino al introducirse el uso de un péptido sintético citrulinado, derivado de la filagrina. Esto simplificó la detección de los anticuerpos contra proteínas citrulinadas y mejoró sustancialmente la estandarización, en comparación con el uso de la proteína completa. Mediante la ciclización del péptido, se encontró que el epítopo que contiene citrulina queda óptimamente expuesto, llevando a una mejor sensibilidad de la técnica. Los primeros estudios basados en el uso de un péptido cíclico citrulinado (CCP) describieron una sensibilidad diagnóstica de 68% con una especificidad para AR de 97-98% (Pruijn et al., 2005). Mediante técnicas de tamizaje realizadas sobre bibliotecas especiales de péptidos citrulinados se introdujo el uso de nuevas generaciones de CCP que han permitido elevar la sensibilidad diagnóstica para AR hasta 80% (similar a la que provee la determinación del factor reumatoide), con una especificidad del 98%. Un conjunto de estudios apoyan la conclusión de que la detección de anticuerpos contra CCP provee un mejor apoyo diagnóstico para distinguir la artritis reumatoide de otras enfermedades. Adicionalmente, se ha encontrado que la detección de anti-CCP, cuya presencia en individuos sanos es menor del 1%, es un marcador temprano para el desarrollo de AR. El seguimiento de un grupo de individuos que presentaron la prueba positiva, en ausencia de manifestaciones clínicas, mostró que posteriormente una proporción desarrolló la enfermedad. Esta utilidad pronóstica es sumamente valiosa, dado que le posibilita al clínico apoyar sus decisiones terapéuticas en la implementación de un control farmacológico temprano de esta enfermedad, antes de que se presenten lesiones erosivas avanzadas en las articulaciones.
Fig. 1 La conversión de un residuo de arginina en citrulina es catalizada por enzimas de la familia de las peptidilarginina deiminasas (PADs). Estas enzimas poseen polimorfismos genéticos que podrían tener alguna influencia en la predisposición para generar proteínas citrulinadas en distintos individuos, las cuales podrían inducir la respuesta autoinmune causante de artritis reumatoide.
3. REACTIVOS Y MATERIALES
a. REACTIVOS
· CALIBRADORES Y CONTROLES: Los reactivos están listos para ser usados. Mezclar cuidadosamente antes de usar.
· CONJUGADO ENZIMÁTICO: El conjugado está listo para ser usado. Mezclar cuidadosamente antes de usar.
· BUFFER PARA MUESTRA: El buffer está listo para su uso.
NOTA: Solo debe ser usado junto con la muestra. 
· BUFFER DE LAVADO: El Buffer está concentrado 10X, tomar 5ml de Buffer de Lavado y diluirlo en 45 ml de Agua Destilada. Este es estable desde su preparación por 4 semanas a condiciones de 2°C a 8°C.
· SOLUCIÓN CROMÓGENO / SUSTRATO: La solución está lista para usarse. Cerrar la botella inmediatamente después de su uso, esta solución es fotosensible.
· SOLUCIÓN DE PARADA: Lista para su uso.
· PLACAS RECUBIERTAS CON ANTÍGENO: Lista para su uso, almacenar de 4°C a 8°C. 
b. MATERIALES
· Muestra de Sangre 
· Tubos Vacutainer Seco (Tapa roja)
· Algodón 
· Etanol al 70% 
· Ligadura 
· Jeringas de 3 cc 
· Descartador de punzocortantes 
· Timer
· Micropipetas Automáticas de 20ul, 200ul a 1000ul.
· Tips para micropipetas de 20ul, 200ul a 1000ul
· Tubos Eppendorf de 1.5ml.
· Papel Toalla.
4. METODOLOGIA
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA.
· Con la ayuda de una Jeringa descartable o Vacutainer, extraer una muestra de sangre por Venopunción del antebrazo, tomándose todas las medidas de Bioseguridad en la obtención de la muestra.
· Recolectar 3ml de Sangre.
· Depositar la muestra dentro del tubo seco (tapa roja) o con anticoagulante (EDTA y/o Heparina) , centrifugar y separar el suero o plasma del paquete globular.
DESARROLLO
a. Preparación de la muestra de suero o plasma.
· Tomar 10 ul del suero o plasma a analizar y diluirlo en 1.0ml de Buffer de muestra, obteniendo una dilución 1:101.
b. Incubación de la muestra
· Transferir 100 ul de los CONTROLES (positivo y negativo) y la MUESTRA PROBLEMA diluida previamente en los pocillos de la placa, asignar un pocillo por control y muestra.
· Dejar incubar a temperatura ambiente (18°C a 25°C) por 60 minutos.
c. Lavado de las muestras
· Con la ayuda de una pipeta de 1000 ul, añadir a cada pocillo con la 1ra solución (punto a) 300 ul de Buffer de Lavado.
· Esperar 30 segundos y descartar por inversión de la placa el contenido (realizar este paso cuidadosamente para evitar contaminación en los pocillos), secar la placa con la ayuda de papel absorbente.
· Repetir los procedimientos anteriores por 3 veces.
d. Incubación del conjugado
· Tomar 100ul de la ENZIMA CONJUGADO (Peroxidasa IgG anti humano) y depositarlo dentro de los pocillos de trabajo con la ayuda de una micropipeta.
· Dejar incubar por 30 minutos a temperatura ambiente (18°C a 25°C).
· Concluidos los 30 minutos realizar el lavado de los pocillos repitiendo los pasos del punto b (Lavado de Muestras).
e. Incubación del sustrato
· Tomar 100ul de la solución CROMÓGENO SUSTRATO con la ayuda de micropipeta y añadir dentro de los pocillos de trabajo
· Dejar incubar por30 minutos a temperatura ambiente (18°C a 25°C).
· La incubación se realizará protegiendo las muestras de la luz (lugar oscuro).
f. Solucion stop
· Con la ayuda de una micropipeta, tomar 100 ul de SOLUCIÓN DE PARADA y añadir a cada pocillo de trabajo.
· Esta solución será añadida sobre la solución CROMÓGENO SUSTRATO.
g. Medición de la muestra por espectrofotometría
· La medición fotométrica de la intensidad de color de las muestras se leerán a 450nm en un espectrofotómetro.
5. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
· Las absorbancias obtenidas de la lectura del equipo, serán extrapoladas en una curva de calibración previamente realizada (Cuadro N° 1).
· Los resultados a reportarse son emitidos con las siguientes unidades RU/ml.
· Se considerará un RESULTADO POSITIVO cuando el resultado sea >5 RU/ml.
· Se considerará un RESULTADO NEGATIVO cuando el resultado sea <5 RU/ml.
Cuadro N° 1 Curva de Calibración de Anti-CCP.
6. RESULTADOS
Se recolectó la muestra de sangre de una compañera que anteriormente manifestó Hepatitis B y se preparó la muestra de plasma. Posteriormente, se utilizó el Kit Elisa de 96 Det. para la detección cualitativa de HBsAg en suero o plasma humano. Se siguieron los pasos recomendados en el prospecto y se seleccionaron 6 micropocillos de análisis los cuales fueron etiquetados de izquierda a derecha como: 3 pocillos de test (con plasma), 2 pocillos de control (+ y -) y 1 pocillo con glucosa. Luego, se agregaron 50 ul de conjugado HRP-HBsAb a cada pocillo, se mezclaron suavemente y sellaron. Se llevó a la incubadora a 37°C durante 90 minutos, terminado el tiempo estimado, se lavaron con 350 ul de tampón y se desechó la solución la solución de lavado. El lavado se repitió por 4 veces. Se agregaron 100 ul de sustrato TMB en cada cubeta y se incubó a 37°C por 20 minutos. Finalemte, se detuvo la reacción agregando 100 ul de Solución de Parada y se observo que todos los pocillos cambien de color a azul a amarillo.
Plasma (+)
Control (-)
Control (+)
Glucosa (+)
En la figura, se puede observar que los pocillos Test tienen un color amarillo tenue muy similar al Control (+), lo que significaría que la persona evaluada es positiva para la Prueba de ELISA RecombiLISA HBsAg.
7. CUESTIONARIO
1) Mencionar cuál es la importancia del Dosaje de Anti-CCP.
La prueba de anticuerpos anti-CCP se usa para diagnosticar la artritis reumatoide. Se suele usar junto con o después de una prueba del factor reumatoide (FR). Los factores reumatoides son otro tipo de autoanticuerpo. Las pruebas de FR solían ser la prueba principal para el diagnóstico de la artritis reumatoide.
2) Menciona y describe otras técnicas empleadas en el dosaje de Anti-CCP
Los anticuerpos que más se han asociado con la AR son: los anticuerpos anti factor perinuclear (AFP) y antiqueratina (AKA), ambos dirigidos contra filagrina citrulinada; anticuerpos anti-Sa, los cuales reconocen vimentina citrulinada y anticuerpos contra péptidos cíclicos citrulinados (anti-PCC)6.
3) Describa y grafique brevemente las reacciones inmunológicas que ocurren en la reacción para el dosaje de Anti-CCP.
4) Mencione las diferencias clínicas que existen entre la prueba de Anti-CCP y Factor Reumatoideo.
Los anti-CCP muestran una ventaja para el diagnóstico, pues son más específicos para diagnosticar AR que el FR, ya que sólo se presentan en un 2 a 5% de los pacientes con otra enfermedad reumática distinta de AR.