PRACTICA N8 - Pigmentos Biliares

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UNIVERSIDAD CATÓLICA SANTA MARÍA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS, BIOQUÍMICAS Y BIOTECNOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA
CURSO: BIOQUÍMICA APLICADA
DOCENTE: JULITZA LINDSEY PAREDES FUENTES
GRUPO: 1- “C”
PRESENTADO POR:
GONZALES LOAIZA GRECIA SHIRLEY
HUALPA RODRIGUEZ PAOLA FABIOLA
MARTINEZ CANDIA VYCTORIA LUZ
MOROCCO BASTIDAS VALENTINA FABIANA
PINTO AMESQUITA DANIELA ALEJANDRA 
 AREQUIPA-2021
PRACTICA N° 8
PIGMENTOS BILIARES: HIPERBILIRRUBINEMIAS
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
 1.- Determinación de la bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguíneo
 2.- Identificación de pigmentos biliares en la orina (Reacción de Gmelin)
INTRODUCCION
Los pigmentos biliares son un grupo de compuestos derivados del grupo Hemo. Generalmente son coloreados y se encuentran en la sangre, siendo eliminados en la bilis, pasando al contenido intestinal de donde pueden ser parcialmente reabsorbidos constituyendo ésta una circulación enterohepática. Se eliminan en las heces y en la orina. 
El principal pigmento biliar es la bilirrubina, la cual deriva del grupo Hemo de la hemoglobina (que contiene a la protoporfirina IX). En el hombre se forman diariamente 250ª 400 mg. de bilirrubina; de esto aproximadamente el 75 % provienen del grupo hemo de la hemoglobina y el resto del grupo hemo de otras hemoproteínas (catalasa, peroxidasa, citocromos, etc.) que tienen un recambio más lento en el organismo, comparado con el recambio que sufre la hemoglobina; lo que hace que en la práctica, las alteraciones en los niveles de bilirrubina se consideren relacionadas al grupo hemo de la bilirrubina.
La Hemoglobina de los eritrocitos es degradada en el sistema retículo endotelial (RES) del bazo, hígado y médula ósea, principalmente. La fracción globina es separada del hemo y este forma primero la biliverdina y luego es reducida a bilirrubina, la que luego pasa a la sangre excretándose principalmente en la bilis y muy pocas cantidades en la orina. En el intestino la bilirrubina se convierte en bilinógenos (d-urobilinógeno, mesobilirrubinógeno y estercobilinógeno), los que también pueden ser oxidados a bilinas (d-urobilina, i-urobilina y estercobilina), las que por ser compuestos coloreados, contribuyen a dar color a las heces. 
Se denominan hiperbilirrubinemias a las enfermedades que cursan con aumento en la concentración de bilirrubina en el suero sanguíneo. Este aumento puede ser a predominio de la bilirrubina indirecta (no conjugada)o directa (conjugada); en cuyo caso se hablará de hiperbilirrubinemias a predominio indirecto o a predominio directo respectivamente. Sin embargo, resulta más apropiado agrupar las hiperbilirrubinemias en atención al mecanismo de su producción y desde este punto de vista, se describen cuatro categorías:
 I.- Hiperbilirrubinemias por sobreproducción de bilirrubina
 II.- Hiperbilirrubinemias por menor captación hepática de bilirrubina
 III.- Hiperbilirrubinemias por alteración en la conjugación hepática de la bilirrubina 
 IV.- Hiperbilirrubinemias por alteraciones en la excreción de bilirrubina
Para la tipificación de las hiperbilirrubinemias se han descrito diversos análisis de laboratorio. Entre estos podemos destacar : 
a) Determinación de bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguíneo
b) Identificación de pigmentos biliares (bilirrubina) en la orina
c) Excreción urinaria de urobilinógeno
d) Medida de la actividad transaminásica (TGP y TGO) en suero
e) Medida de la actividad glucoronil transferásica del hígado
f) Medida de la actividad fosfatásica alcalina del suero
g) Prueba de la bromosulftaleína 
De todas estas determinaciones sólo se practicarán las dos primeras en la presente práctica y se usarán como muestra el suero sanguíneo y la orina de un paciente ictérico y de una persona aparentemente normal. 
EXPERIMENTO 1
DETERMINACIÓN DE LA BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA EN EL SUERO (Método: Malloy Evelyn.)
 
Objetivos:
1. Determinar las bilirrubinas en el suero de un paciente con ictericia.
2. Determinar las bilirrubinas en el suero de un sujeto aparentemente normal
3. Comparar el resultado obtenido en ambas determinaciones.
Procedimiento 
1. En 4 tubos de prueba rotularlos como I, II, III y IV, medir lo siguiente:
	
	I
	II
	III
	IV
	Suero diluido (1/10)
	2,0
	2,0
	2,0
	2,0
	Agua destilada
	2,5
	2,5
	---
	---
	Metanol
	---
	---
	2,5
	2,5
	Reactivo de Erhlich
	0,5
	---
	0,5
	---
	Reactivo blanco
	---
	0,5
	---
	0,5
2. Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos.
3. Leer en el fotocolorímetro utilizando filtro verde
4. Con anterioridad a la práctica se preparó un sistema estándar, midiendo 2,5 ml de una solución de bilirrubina (0.004 mg/ml), se añadió luego 2.5 ml de metanol y 0.5 ml del reactivo de Erhlich. Se midió la absorbancia en las condiciones señaladas para el suero (2 y 3) y se obtuvo una lectura de 0.224.
5. Utilizar el procedimiento descrito tanto para el suero del paciente ictérico y el suero normal 
Fundamento del método.
M
M
M
M
V
V
P
P
OH
HO
N
N
N
N
CH2
CH
CH
H
H
B I L I R R U B I N A
Acido Sulfanílico Diazotizado
N = NCl
HSO3
P
M
M
V
HO
N
N
CH2Cl
CH
P
M
M
V
OH
N = N
HSO3
N
N
CH
COMPLEJO DE COLOR ROJO
Figura Nº 8.- Diazo reacción de Ehrlich
Expresión de los resultados: (Paola)
1. ¿Cuál es la cantidad de bilirrubina usada en el estándar? 
2. Calcular el Factor de Calibración en mg:
Absorbancia del Estándar: 
Concentración del Estándar: 
Factor de calibración:
3. ¿Cuál es el volumen neto de suero usado? 
Factor de calibración porcentual: 
 
4. Completar la siguiente tabla: (Paola)
	
	ABSORBANCIAS
	CONC. BILIRRUBINAS
	
	I
	II
	III
	IV
	BT
	BD
	BI
	Suero Normal
	0.055
	0.04
	0.068
	0.038
	0.675
	0.338
	0.338
	Suero A
	0.201
	0.048
	0.234
	0.056
	4.005
	3.443
	0.563
	Suero B
	0.052
	0.034
	0.430
	0.046
	8.64
	0.405
	8.235
	Suero C
	0.194
	0.058
	0.292
	0.052
	5.4
	3.060
	2.34
5. Interpretación de resultados. (Paola)
Teniendo en cuenta los valores normales para las bilirrubinas, que se señalan a continuación, indique qué pacientes tienen hiperbilirrubinemia y a qué tipo de predominio pertenecen.
VALORES NORMALES:
Bilirrubina total	 → 	0.4 – 1.0 mg %
Bilirrubina Directa	 → 	0.2 – 0.4 mg %
Bilirrubina Indirecta → 	0.2 – 0.6 mg % 
· El paciente A presenta un aumento en la concentración de la bilirrubina directa, por lo que se puede decir que es una hiperbilirrubinemia a predominio directo o conjugado, también denominada una ictericia obstructiva.
· Por otro lado, el paciente B presenta un aumento en los valores de concentración de la bilirrubina indirecta, es decir, una hiperbilirrubinemia indirecta o no conjugada, específicamente una ictericia hemolítica.
· Por último, el paciente C presenta aumento en los valores de bilirrubina directa e indirecta, por lo que se puede sospechar de una ictericia hepática.
6. Completar la siguiente tabla indicando si los valores de la concentración de bilirrubina directa (BD) y de la bilirrubina indirecta (BI), están aumentados (A), normales (N) o disminuidos (D). (Paola)
	
	Bilirrubina directa (BD)
	Bilirrubina Indirecta (BI)
	Hiperbilirrubinemia
(a predominio)
	MUESTRA A
	A
	N
	Obstructiva
	MUESTRA B
	N
	A
	Hemolítica
	MUESTRA C
	A
	A
	Hepática
EXPERIMENTO 2
IDENTIFICACIÓN DE PIGMENTOS BILIARES EN LA ORINA (Reac. de Gmelin)
La Reacción Gmelin se realiza en la orina e identifica la presencia de biliverdina y bilirrubina. El reactivo de Gmelin, es una mezcla de ácido nítrico conteniendo trazas de ácido nitroso. La positividad de la reacción se hace observando en la interfase formada entre las dos fases que se constituyen al hacer la reacción una sucesión de colores que empezando por el color amarillo, este luego pasa a color verde, azul, violeta, rojo, naranja y luego nuevamente amarillo. Esta sucesión de colores, se explica porque si hay presencia de bilirrubina en la orina esta se oxida a biliverdina, luego se rompen los enlaces metílicos entre los pirroles dando otros derivados coloreadosde oxidación.
Normalmente, la orina de una persona sana no dará positiva esta reacción ya que hay muy poca cantidad de bilirrubina en la orina normal, por lo que la positividad a esta reacción estará demostrando presencia anormal de bilirrubina en orina. 
Objetivos
1. Realizar la reacción de Gmelin en una orina colúrica
2. Realizar la reacción de Gmelin en una orina normal y comparar el resultado obtenido con el correspondiente a la orina colúrica
Método
Identificar la presencia de bilirrubina en la orina utilizando la acción oxidante del ácido conteniendo trazas de ácido nitroso (reacción de Gmelin).
Procedimiento
1. En un tubo de prueba medir 2 ml de orina
2. Con una pipeta hacer llegar hasta el fondo del tubo, 2 ml de ácido nítrico-nitroso, tratando que se formen dos capas
3. Observar los cambios de coloración que ocurren entre ambas capas
4. Hacer la reacción utilizando la orina patológica y una orina normal
 
INTERROGANTES 
1. ¿Qué contiene el reactivo de Ehrlich? (Grecia)
Este reactivo está realmente formado por la mezcla de ácido clorhídrico concentrado y el de p-dimetilamino benzaldehído.[1]
2. ¿Por qué no se prepara un tubo blanco para la determinación de bilirrubinas por el método de Malloy Evelyn? Tenga en cuenta que los tubos 2 y 4 no corresponden a los blancos que Ud. está acostumbrado a preparar. (Grecia)
· Porque se tendría que utilizar más agua en el blanco más el reactivo que es incoloro lo cual no saldría una absorbancia.
· Su interferencia estaría en el suero
3. ¿Qué bilirrubina es la que se determina en el tubo Nº 3 y por qué? (Daniela)
Es la bilirrubina indirecta o no conjugada, porque entre los ingredientes que tiene ese tubo se encuentra el metanol y este tipo de bilirrubina es insoluble en agua por eso es necesario el uso del ya mencionado.
4. Dan positiva los bilatrienos (biliverdina) la reacción de Gmelin. Fundamente su respuesta. (Valentina)
si ya que es una prueba bioquímica que se utiliza para determinar la presencia de pigmentos biliares en la orina . Una de las razones del porque da positivo es que no es sensible, lo tanto indica la presencia de pigmento biliares. para diferenciar los anillos de diferentes colores entre las dos capas son visibles si hay pigmentos biliares presente, ya que se oxidan a varios productos químicos.
5. ¿El urobilinógeno da positiva la reacción de Gmelin? (Vyctoria)
No. Ya que la reacción de Gmelin indica la presencia de bilirrubina y biliverdina en la orina, además, como se sabe el urobilinógeno es el producto de la acción de las bacterias intestinales sobre la bilirrubina, que cambian su estructura, por lo que no podría dar positivo la reacción, debido a que no habría bilirrubina en la orina porque se transforma a urobilinógeno (el cual se encuentra en una mínima cantidad en la orina porque la mayor parte se excreta en las heces). En este sentido, si se quisiera evaluar la presencia de este último compuesto mencionado, se debería usar otro método. [2]
6. ¿Qué tipo de bilirrubina es la que se encuentra en la orina en cantidades trazas en una persona normal? (Daniela)
La bilirrubina detectada en la orina es la bilirrubina conjugada ya que es la única soluble que puede atravesar los filtros glomerulares del riñón, normalmente su presencia no es detectable en la orina porque es convertida previamente a urobilinógeno en el intestino.[3]
7. ¿A qué se llama ictericia? (Grecia)
Es la coloración amarilla de la piel y mucosa debido al exceso de bilirrubina en sangre que migra hacia tejidos extravasculares.[4]
8. ¿Cumplen el rol fisiológico los pigmentos biliares? (Valentina)
si ya que el conocimiento de la fisiología de los pigmentos biliares nos permite entender el mecanismo de sus acumulación excesiva en el suero sanguíneo y de los tejidos , también saber las acumulaciones que se manifiestan clínicamente, como la ictericia. 
9. Señale las causas más comunes de un aumento de bilirrubina tipo directa. (Vyctoria)
El aumento de bilirrubina directa se da por lo general por el bloqueo de los conductos hepáticos (tubo que transporta la bilis desde el hígado y la vesícula biliar hasta el duodeno) [5], debido a enfermedades como el cálculo biliar o el cáncer de la cabez del páncreas. Así, la obstrucción impide la excreción de diglucurónido de bilirrubina. Asimismo, se puede hacer mención de enfermedades hepáticas como el síndrome de Dubin-Johnson y síndrome de Robor que alteran el transporte y excreción, la cirrosis biliar como obstrucción de la vía biliar intrahepática, y la hepatitis.[6]
10. Defina los siguiente términos: (Valentina)
· Ictericia: La piel , las escleras y las mucosa, coloracion amarillenta, como consecuencia de una elevacion anormal en la concentracionserica de bilirrubina que es una sustancia quimica de color amarillo que contiene la hormoglibona.
· Coluria: Como connsecuencia de la presencia de bilirrubina en la orina de color oscuro. Se produce cuando hay alguna enfermedad hepática que impide su eliminación normal de la bilirrubina por el intestino. 
· Acolia: es la falta de coloración de las heces debido a la ausencia de pigmentos derivados de la bilirrubina en su estructura.
11. ¿Se encontrarán pigmentos biliares en las heces de una persona que tenga una obstrucción total del colédoco a causa de un cálculo? ¿Por qué? (Vyctoria)
No, porque si hay una obstrucción, los pigmentos biliares no serán capaces de llegar al duodeno ni desecharse como normalmente se hace por medio de las heces como urobilina, en vez de eso, se regurgitarán hacia las venas y al hígado, apareciendo en la sangre y en la orina. Además, las heces presentarán un color pálido, lo que indicaría la falta de los pigmentos biliares. [6]
12. Consultando la bibliografía correspondiente indique los hallazgos bioquímicos que se encuentran en la ictericia obstructiva, ictericia hemolítica y en la ictericia hepatocelular (hepatitis viral por ejemplo). (Daniela)
· La ictericia obstructiva: se produce como consecuencia de la interrupción o la dificultad al flujo de bilis en cualquier punto entre el canalículo biliar y el duodeno. Se caracteriza por hiperbilirrubinemia directa y elevación de enzimas de colestasis.[7]
· La ictericia hemolítica: se produce como resultado de la hemólisis o la degradación acelerada de los glóbulos rojos, lo que lleva a un aumento de la producción de bilirrubina.[8]
· La ictericia hepatocelular: se produce como resultado de una enfermedad o lesión hepática. [7]
REFERENCIAS:
1. Reactivo de Ehrlich - PDT - DL Forense [Internet]. Dolforense.com. 2021 [citado el 21 de octubre de 2021]. Disponible en: https://dlforense.com/producto/reactivo-de-ehrlich-pdt-caja-de-10/
2. Jinich H. Fisiología y Patología de los Pigmentos Biliares. Acta Médica [Internet]. 1965 [cited 30 October 2021];8(1):37-51. Available from: https://www.binasss.sa.cr/revistas/amc/v8n1/art4.pdf
3. Todo lo que tienes que saber sobre Bilirrubina en orina [Internet]. Tuotromedico.com. Pulsomed S.A.; 2019 [cited 2021 Nov 1]. Available from: https://www.tuotromedico.com/temas/bilirrubina-orina.htm#:~:text=La%20bilirrubina%20detectada%20en%20la,a%20urobilin%C3%B3geno%20en%20el%20intestino
4. Ictericia [Internet]. Cun.es. [citado el 21 de octubre de 2021]. Disponible en: https://www.cun.es/enfermedades-tratamientos/enfermedades/ictericia 
5.Diccionario de cáncer del NCI [Internet]. Instituto Nacional del Cáncer. [cited 30 October 2021]. Available from: https://www.cancer.gov/espanol/publicaciones/diccionarios/diccionario-cancer/def/conducto-coledoco
6. Murray R, Kennelly P, Bender D, Botham K, Rodwell V, Weil A. Bioquímica ilustrada. 29th ed. McGraw-Hill; 2013.
7. Tejedor Bravo M, Albillos Martínez A. Diagnóstico diferencial de la ictericia obstructiva. Medicine - Programa de Formación Médica Continuada Acreditado [Internet]. 2012 Apr [cited 2021 Nov 1];11(8):514–8. Available from: https://www.medicineonline.es/es-diagnostico-diferencial-ictericia-obstructiva-articulo-S0304541212703402#:~:text=La%20ictericia%20obstructiva%20se%20produce,elevaci%C3%B3n%20de%20enzimas%20de%20colestasis.
8. Gillott C. La ictericia: Todo lo que necesita saber [Internet]. Medicalnewstoday.com. Medical News Today; 2019 [cited 2021 Nov 2]. Available from: https://www.medicalnewstoday.com/articles/es/324091