PRACTICA N 14 - BIOQUIMICA

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PRÁCTICA Nº 14: DIGESTIÓN
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Hidrólisis enzimática del almidón. Acción de la amilasa salival.
2. Digestión de triglicéridos de la leche.
3. Digestión de la ovoalbúmina. Acción de la pepsina y tripsina.
OBJETIVOS.
1. Conocer la manera como actúa la amilasa salival sobre el almidón
2. Reconocer el requerimiento de sales biliares para una acción eficiente de la lipasa
pancreática sobre los triglicéridos.
3. Evaluar la necesidad de condiciones óptimas de pH para la buena actividad de pepsina
y tripsina para la degradación de proteínas.
INTRODUCCIÓN.
La digestión y absorción, son las etapas previas que deben experimentar los carbohidratos,
lípidos y proteínas, que son los principales componentes de la dieta del hombre, para ser
incorporados al organismo.
De las sustancias que componen los alimentos, sólo, el agua, las sales inorgánicas, las
vitaminas, algunos lípidos y monosacáridos pueden ser utilizados directamente por el
organismo. La mayoría de los componentes que se ingieren en la dieta deben ser sometidos a
un proceso de degradación que se conoce con el nombre de digestión. Durante este proceso
las moléculas complejas presentes en los alimentos son descompuestas en sustancias más
simples, que el organismo puede incorporar y utilizar. Esta degradación se cumple mediante
reacciones de hidrólisis, catalizadas por enzimas presentes en los jugos digestivos.
Cuando se obtienen por la digestión, moléculas sencillas, éstas ingresan a la circulación
sanguínea mediante un proceso de absorción a nivel de la mucosa intestinal. Este proceso no
es simplemente una difusión de sustancias de bajo peso molecular a través de las membranas
celulares permeables, sino que éste es el resultado de un proceso selectivo.
Hidrólisis enzimática del almidón.
El almidón es un hidrato de carbono ampliamente distribuido en las plantas, donde se
encuentra constituyendo gránulos envueltos en una fina membrana de celulosa. Estos
gránulos no son solubles en el agua, pero al romperse la pared de celulosa por trituración o
por calentamiento, se libera el almidón soluble. Si la solución en caliente es muy
concentrada, al enfriarse se transforma en un gel. El almidón es en realidad una mezcla de
dos polisacáridos: Amilosa y amilopectina. La amilosa es un polímero lineal formado por
moléculas de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa 1 – 4 . La amilopectina es un
polímero ramificado constituido por moléculas de glucosa, que se unen por enlaces alfa 1 – 4
y alfa 1 – 6. La hidrólisis de los enlaces glicosídicos del almidón es catalizada por ácidos, así
como por enzimas, dentro de estas últimas, podemos mencionar a la amilasa salival.
La amilasa salival, es una endoamilasa que hidroliza los enlaces a 1 – 4, presentes en el
interior de la molécula del almidón, obteniéndose como productos fundamentalmente
maltosa. Se producen además escasos residuos de maltotriosa, glucosa y unas estructuras
ramificadas llamadas dextrinas límite, que presentan enlaces a 1 – 6, los cuales no son
hidrolizados por la amilasa salival. En la degradación del almidón por la amilasa salival se
obtienen los siguientes intermediarios:
El control de la degradación del almidón se realiza mediante las reacciones del yodo y del
Benedict cualitativo; la primera es positiva para los polisacáridos, mientras que la segunda
identifica al azúcar reductor que se forma.
Obtención de la amilasa salival:
a) Enjuagarse la boca con agua de caño.
b) Mantener en la boca unos 20 ml de agua destilada tibia durante 2 minutos y vaciarla
luego en un beaker.
c) Filtrar esta solución por una gasa y mantenerla en hielo hasta el momento de usar.
Preparación de la solución de digestión.
a) Colocar 25 ml. de una solución de almidón soluble al 1 % en un Erlenmeyer pequeño
y añadir 3 ml de la solución de amilasa salival.
b) Tomar inmediatamente una alícuota con la cual se deberá realizar la reacción de yodo
y Benedict, representando esta muestra, el tiempo cero.
c) El resto de la solución de digestión, se le incuba a 37 ºC por 30 minutos, tomando
alícuotas cada 30 segundos para la reacción de Yodo y cada 5 minutos para la
reacción de Benedict.
Reacción de Yodo.
● Rotular 10 tubos y medir en cada uno de ellos:
● HCl 0.05 N 2.50 ml.
● Solución de Yodo 0.25 ml.
● Solución de digestión 0.25 ml.
● Dejar en reposo, observar e interpretar los resultados:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
tiempo
(min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Observ
Color
azul
marino
azul morado violeta rosado coral bermellón naranja amarillo marfil
Conclusiones: En este primer experimento, podemos observar e interpretar que las muestras
en los tubos sufren una variación notable de coloración directamente proporcional al tiempo
en el que se analizó. En el minuto 0 determinamos, a través del lugol, la presencia de almidón
con esa coloración azul marino que, con el paso de cada minuto; va perdiendo esa fuerte
coloración por acción de la amilasa salival, demostrando así que el almidón se degrada hasta
que la muestra adquiere una tonalidad marfil, indicando la degradación de almidón a azúcares
reductores incapaces de formar el complejo que retiene al yodo y le da coloración.
Reacción de Benedict.
● Rotular 6 tubos y medir en cada uno de ellos:
● Reactivo de Benedict 2.50 ml.
● Solución de Digestión 0.25 ml.
● Colocarlos en baño hirviente por 5 minutos.
Observar los resultados e interpretar.
Tubo 1 2 3 4 5 6
Tiempo
(min)
0 5 10 15 20 25
Observ
Color
- + ++ +++ +++ ++++
Conclusiones: Para la reacción de Benedict a partir del sustrato y la enzima, podemos
determinar a través de la formación del precipitado (óxido cuproso Cu2O)en relación
directamente proporcional al tiempo de espera, que la amilasa salival ha degradado el
almidón separándolo en azúcares con poder reductor
Digestión de los Triglicéridos de la leche.
Los lípidos se caracterizan por ser insolubles en el agua, lo cual constituye un problema para
la digestión, ya que los sustratos no son fácilmente accesibles a las enzimas digestivas de la
fase acuosa. Además, si los lípidos ingeridos se hidrolizan en constituyentes más simples,
estos tienden a agregarse en complejos mayores, lo cual dificulta su absorción. Estos
problemas se pueden superar mediante el aumento del área lipídica y por solubilización de los
productos de hidrólisis con detergentes.
La digestión de las grasas, en el organismo ocurre por acción de las lipasas, las cuales
requieren de un agente solubilizante, las sales biliares y de una proteína la colipasa que
permite la inter reacción de la lipasa con los triglicéridos que se encuentran en la parte interna
de la micela.
Fundamento.
La digestión de los Triglicéridos da como resultado: b - monoglicéridos, diglicéridos y ácidos
grasos, estos últimos pueden ser determinados por titulación con hidróxido de sodio.
Procedimiento.
a) Colocar en 2 Beakers 10 ml de leche y 1 ml de extracto de lipasa (solución de
pancreatina), en cada uno de ellos.
b) A uno de ellos se le añade 1 ml de agua y al otro 1 ml de bilis. Mezclar rápidamente.
c) De cada beaker se toma 2 ml. y se colocan en 2 beakers respectivamente y se añaden
dos gotas de fenolftaleína y se titula con NaOH 0.01 N hasta la aparición de una
coloración rosada débil.
d) Anotar los ml. gastados y hacer los cálculos.
e) La mezcla que quedó después de retirar los 2 ml. se incuba en baño maría a 37 ºC por
una hora.
f) Transcurrido el tiempo de incubación, tomar nuevamente 2 ml de cada beaker de
incubación y titularlos del modo antes descrito.
Determinar el Nº de mEq de ácidos grasos provenientes de la digestión de 100 ml. de
leche pura.
ml. de NaOH 0.01 N
gastados
meq. de Ac. grasos / 100 ml
de leche pura
Leche + agua Leche + bilis Leche + agua Leche + bilis
Muestra Basal 0.65 0.70 0.325 0.35
Muestra Incubada 0.75 2.50 0.375 1.25
𝑋 𝑚𝐸𝑞 = 𝑣𝑜𝑙 𝑔𝑎𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑥 0. 001 𝑚𝐸𝑞/𝑚𝐿
XmEq-----2mL
Y mEq-----100 ml
Digestión de la ovoalbúmina.
Pepsina y tripsina son enzimas quehidrolizan enlaces peptídicos, que se encuentran en el
interior de la molécula de proteína. Pepsina hidroliza enlaces peptídicos en los cuales
participan los aminoácidos aromáticos y leucina y que aportan el grupo amino para formar el
enlace peptídico. Tripsina hidroliza los enlaces peptídicos en los cuales el grupo carboxilo
es aportado por la arginina o lisina.
El sustrato utilizado para estudiar estas dos enzimas es la ovoalbúmina, proteína globular
presente en la clara del huevo.
Parte experimental.
a) Tomar 4 tubos de ensayo y medir en cada uno de ellos 5 ml de albúmina de huevo.
b) Incubar en baño de agua a 37 ºC durante 5 minutos.
c) Después de este periodo de incubación añadir los siguientes reactivos, como se indica
a continuación:
Tubo Nº 1 2 3 4
Tripsina 0.5 ml. 0.5 ml. ------- -------
Pepsina ------- ------- 0.5 ml. 0.5 ml.
Buffer fosfato pH 8.6 ------- 3.0 ml. 3.0 ml. -------
HCl 0.1 N 4.5 ml. ------- ------- 4.5 ml.
Agua destilada ------- 1.5 ml. 1.5 ml. -------
d) Mezclar bien; continuar la incubación a 37 ºC
e) Observar cada 10 minutos la turbidez o aclaramiento de cada tubo. Incubar por 20
minutos.
Tubos 1 2 3 4
10 min. - + - +
20 min. - ++ - ++
30 min. - +++ - +++
INTERPRETACIÓN
La tripsina actúa en un medio básico, por lo tanto, el tubo más aclarado es el 2.La pepsina
actúa en un medio ácido por lo que el tubo con mayor aclaramiento fue el tubo 4.
INTERROGANTES.
1. Explique por qué los diferentes tubos toman esas coloraciones, tanto en el
experimento del lugol como en el de Benedict.
En la prueba de lugol se pudo ver un color azul intenso, esto se debe a la presencia de
carbohidratos, como el almidón, ya que como se sabe el yodo en presencia de
carbohidratos, reacciona con estos dando este color. Por otro lado de tiene la prueba
de Benedict ayuda en la identificación de azúcares reductores por lo que toma esa
coloración marrón, también queda aclarar que esta coloración aparece solo si se
obtiene más de 4% de azúcares reductores.
2. ¿Qué color dan con el yodo las estructuras del almidón? ¿Qué ocurriría, si se
calienta la muestra coloreada en baño maría hirviente?
El yodo al momento de reaccionar con una muestra la cual posee estructuras de
almidón se colorea de un azul intenso, en presencia del calor este pierde su color ya
que se rompen las estructuras formadas, pero esto se puede solucionar ya que si se
enfría recupera su color.
3. ¿Qué enzimas se encargan de romper los enlaces 1 – 6 ?α
Un enlace alfa 1-6 se rompe por la actividad alfa 1-6-glucosidasa, que posee la misma
enzima desramificadora.
4. ¿Dónde se completa la digestión de los oligómeros residuales, luego de la acción
de las amilasas? ¿Qué enzimas participan?
La digestión completa de los oligómeros residuales se da en el yeyuno, y las enzimas
las cuales hidrolizan estos compuestos son las enteropeptidase junto al pH igual a 7,
este proceso es posible.
5. ¿Qué es un azúcar reductor?
Los azúcares reductores son aquellos que poseen su grupo carbonilo (grupo funcional)
intacto entre estos tenemos glucosa, lactosa, fructosa, maltosa, galactosa, manosa, y
que a través del mismo pueden reaccionar con otras moléculas; los azúcares no
reductores al contrario no poseen su grupo carbonilo libre y entre estos tenemos
sacarosa, trehalosa.
6. ¿En qué consiste la intolerancia a la lactosa? ¿Por qué se presentan sus
síntomas?
La intolerancia a la lactosa se origina cuando el intestino delgado no produce la
cantidad suficiente de lactasa que te permite digerir el azúcar de la leche (lactosa),
esta insuficiencia trae consigo síntomas, en los niños incluyen diarrea y aumento de
peso insuficiente, mientras que los síntomas en adultos incluyen hinchazón
abdominal, cólicos, diarrea, flatulencia y náuseas.
7. ¿Cuál es el rol de las sales biliares en la digestión de los triglicéridos?
Las sales biliares (ácidos biliares) son el principal componente orgánico de la bilis.
- La bilis ayuda a la digestión y ayuda a las enzimas en su cuerpo para
descomponer las grasas en ácidos grasos, que pueden introducirse en el cuerpo
a través del tracto digestivo. La bilis contiene:
- Principalmente colesterol.
- Solubilizar los lípidos y las vitaminas liposolubles ingeridos y, de esta manera,
facilitar su digestión y su absorción
8. ¿Cómo explica los resultados del experimento de digestión de los triglicéridos de
la leche?
Existe una mayor titulación con NaOH y por eso el efecto de las sales biliares dan un
mayor gasto en el tubo B. Y en cuanto a la incubación en 37º la muestra incubada
presenta mayor gasto porque permanece más tiempo en 37º
9. ¿Cómo explica los resultados del experimento de digestión de la ovoalbúmina?
En el experimento se utilizó 4 tubos en los cuales se colocó 5 ml de albúmina de
huevo, tras haber sido colocados los reactivos se mandó a incubación, viendo así que
en el tubo uno y en el tubo 3 no presenta turbidez, esto se debe gracias a que el
reactivo no logro hidrolizar a la albúmina de huevo. Después en el tubo 2 y en el tubo
4 se pudo ver que la turbidez de la muestra aumentaba a medida que pasaban los
minutos en la incubadora, ya que en estos 2 tubos se utilizó una enzima la cual se
encarga de hidrolizar proteínas, en este caso la albúmina de huevo.
10. Además de pepsina y tripsina, ¿qué otras enzimas participan en la digestión de
las proteínas?¿Cuáles son sus sustratos?
Enzimas pancreáticas como, quimiotripsina, aminopeptidasas y carboxipeptidasas.
- El principal sustrato de la quimotripsina incluye el triptófano, tirosina,
fenilalanina y metionina, que son hidrolizados en el carboxilo terminal. La
quimotripsina se rompe detrás de aminoácidos aromáticos. Al igual que
muchas proteasas, la quimotripsina también hidroliza enlaces éster.
- La aminopeptidasa hidroliza el terminal amino de los residuos básicos y
también es conocida como arginina aminopeptidasa (ArgAP) porque en
investigación se emplea la Arg-β-naftilamida como sustrato artificial, ya que
es el más conveniente para determinar esa actividad enzimática.
- El sustrato de las carboxipeptidasas, es otra proteína que posee el extremo
carboxilo libre. La enzima tiene preferencia por aminoácidos aromáticos,
aunque puede cortar con casi todos, excepto si el último aminoácido es la
prolina ya que la reacción química consiste en la hidrólisis del último enlace
peptídico en la que el protón del agua se añade al lado amino y el oxhidrilo al
carbonilo del enlace.
EXPERIMENTO CASERO:
HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN
El objetivo del experimento es verificar la acción de la amilasa salival sobre el almidón.
Materiales:
● Maicena
● Lugol o tintura de iodo
● Agua desgasificada 400mL
● 3 vasos de vidrio pequeños
● 1 jeringas de 10mL
● 15 ml de la amilasa salival
Procedimiento:
Se mezcló en un recipiente 10 g de maicena con agua tibia 400 ml y se disolvió rápidamente,
hasta que la maicena esté diluida por completo.
Luego se tiene que tomar 15 ml de agua y mantenerlo en la boca por 4 minutos para obtener
la solución.
A los dos recipientes de vidrio que contienen el almidón, se le agrega los 4 ml de la solución
salival.
Al primer recipiente se le agrega 2 gotas Lugol.
El segundo recipiente se deja actuar por 5 minutos, luego se le agrega 2 gotas de Lugol.