Práctica 4 Digestión de las proteínas e inhibición de las enzimas digestivas proteica(1) (2)

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Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas
Primera Unidad
PRACTICA N°4
 - DIGESTION DE LAS PROTEINAS E INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PROTEICAS --
ACCION DE ENZIMAS DIGESTIVAS PANCRETICAS SOBRE LA CASEINA
INTRODUCCION:
La digestión de las proteínas, o degradación hasta aminoácidos se inicia en la boca, en mínima cantidad, se continua en el estómago con la pepsina; pero es el páncreas que produce enzimas que cumplen un rol principal en este proceso conociéndose como enzimas proteolíticas. Entre estas se tiene a: tripsina, quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; y las de origen intestinal: aminopeptidasas, dipeptidasas. Estas mismas enzimas se pueden clasificar a su vez como endopeptidasas: pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas y exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. 
La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y es específica de los enlaces peptídicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. La quimotripsina es específica para los enlaces peptídicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una especificidad amplia, ataca a los residuos de aminoácidos alifáticos neutros pequeños, como la glicina, alanina y serina. Las exopeptidasas catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos, uno a la vez, desde los extremos de péptidos. Las carboxipeptidasas, secretadas en el jugo pancreático, hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptídicas. Todas ellas son sintetizadas como zimógenos y son activadas al ser liberadas a la luz del intestino para que actúen sobre las proteínas
La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces, que provienen de la carne de los alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa, existe hipoproteinemia, con retardo marcado del crecimiento.
La técnica de reacción con la ninhidrina se fundamenta en que se produce compuestos coloreados que sirven como base para la cuantificación de todos los aminoácidos. A simple vista podemos distinguir una coloración que va de azul a violeta intenso. Ya con la ayuda de equipos podemos evaluar la intensidad de la luz midiendo la absorción con longitud de onda de 540 nm. Aminoácidos secundarios como la prolina forman productos ligeramente distintos, estos son amarillos y su máxima absorción es a 440 nm.
COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE:
Demuestra la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche, determinando responsablemente los productos (aminoácidos) mediante su reacción con la ninhidrina.
MATERIAL Y EQUIPOS
Material: de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimetradas.
Equipos: baño maría, olla para baño de agua hirviendo.
Reactivos:
· Caseina al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8.
· Buffer fosfato 0,1 M pH 8.
· Solución de extracto pancreático.
· Solución acuosa de ninhidrina al 0,25% saturada con butanol.
· Acido tricloroacético al 10%.
PROCEDIMIENTO
1) Sistema A: Acción hidrolítica de las enzimas digestivas proteasas: Armar el siguiente sistema de incubación.
	COMPONENTES (ml)
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I
	II
	III
	Caseina al 1%
	1.0
	1.0
	--
	Buffer fosfato 0.1M pH 8.0
	1.0
	1.0
	1.0
	Solución de extracto pancreático
	1.0
	--
	1.0
	Agua Destilada
	--
	1.0
	1.0
	Mezclar y colocar en baño maría a 37 ºC por 30 minutos.
	Transcurrido el tiempo, armar el sistema B.
2) Sistema B: Control de la acción digestiva de las proteasas mediante la reacción con ninhidrina: Armar el siguiente sistema.
	COMPONENTES (ml)
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I
	II
	III
	Incubado anterior (Sistema A)
	0.5
	0.5
	0.5
	Ninhidrina
	1.0
	1.0
	1.0
	Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición), durante 3 a 5 minutos.
	Observar en cada tubo si aparece o no una coloración que va de azul a violeta intenso.
3) Sistema C: Valoración de la caseína residual mediante su precipitación con ácido: Armar el siguiente sistema.
	COMPONENTES (ml)
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I
	II
	III
	Resto del incubado del Sistema A
	0.5
	0.5
	0.5
	Ácido tricloroacético al 10% (gota a gota)
	1.0
	1.0
	1.0
	Agitar continuamente.
	Observar en cada tubo si se produce o no la aparición de un precipitado proteico.
RESULTADOS:
Sistema B: Control de la acción digestiva de las proteasas mediante la reacción con ninhidrina:
 Interpretar los resultados en base a la competencia.3
2
1
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I
	II
	III
	Color final: Azul a violeta intenso / Incoloro / Casi incoloro
	Azul a violeta intenso
	Incoloro
	Casi incoloro*
	Acción digestiva de las proteasas: SI / NO
	SI
	NO (——)
	NO
Sistema C: Valoración de la caseína residual mediante su precipitación con ácido:
 Interpretar los resultados en base a la competencia3
2
1
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I
	II
	III
	Precipitado proteico: SI (+ / +++) / NO
	NO
	SI (+++)
	SI (+)
	Caseína residual: SI (+ / +++ / NO
	NO
	SI (+++)
	NO (——)
	Acción digestiva de las proteasas: SI / NO
	SI
	NO (——)
	NO
EFECTO DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE LA ACCIÓN PROTEOLITICA DE LA TRIPSINA
INTRODUCCION:
La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas. Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialmente digeridas, con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos.
Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición. Por ejemplo, el frijol de soya contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas. Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor, ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de soya aumenta considerablemente si se somete a cocimiento en ebullición por varios minutos.
El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento, el gisipol, con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas. Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina, la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína, secretada a la luz intestinal.
La técnica para determinar el efecto de la soya hervida y cruda sobre la acción proteolítica de la tripsina se fundamenta en lo siguiente. El inhibidor de tripsina es una de las peptidasas encontradas en la soya. Este inhibidor es el único polipéptido que forma complejo estable y enzimáticamente inactivo con la tripsina gracias a la compatibilidad de sus enlaces peptídicos con el sitio activo de esta última, reduciendo la disponibilidad celular. La soya también tiene lipooxigenasa, ureasa, hemaglutinina y factor antitiroideo. El inhibidor de la tripsina es termolábil, por lo cual la soya hervida pierde su capacidad de inhibir a la tripsina.
COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE:
Demuestra el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre la acción proteolítica de la tripsina, efecto que desaparece cuando la soya es hervida, determinando responsablemente los productos (aminoácidos) mediante su reacción con la ninhidrina.
MATERIAL Y EQUIPOS:
Material: de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimetradas.
Equipos: centrífuga, baño maría, olla para baño de agua hirviendo.
Reactivos:
· Buffer fosfato 0,1 M pH 8.
· Solución de ninhidrina 0,25% saturada con butanol.
· Solución de tripsina 20 mg%
· Proteína de soya cruda 30%
· Proteína de soya hervida 30%
· Etanol absoluto.
PROCEDIMIENTO
1) Sistema A: Efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre la acción proteolítica de la tripsina: Armar el siguiente sistema de incubación.
	COMPONENTES (ml)
	TUBOS DEENSAYO
	
	I
	II
	III
	IV
	Buffer fosfato 0.1M pH 8.0
	2.5
	2.5
	2.5
	2.5
	Proteína de soya cruda al 30%
	0.5
	0.5
	--
	--
	Proteína de soya hervida al 30%
	--
	--
	0.5
	0.5
	Solución de tripsina al 20%
	0.2
	--
	0.2
	--
	Se mezclan y colocan todos los tubos en baño maría a 37 ºC durante 60 minutos.
	Transcurrido el tiempo, se agrega:
	Etanol absoluto (ml)
	2.0
	2.0
	2.0
	2.0
	Se mezclan y todos los tubos se centrifugan a 2500 rpm, durante 10 minutos.
	Observar los resultados en cada tubo. Verificar si se produce o no la aparición de un precipitado proteico
2) Sistema B: Control del efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre la acción proteolítica de la tripsina mediante la reacción con ninhidrina: Armar el siguiente sistema.
	COMPONENTES (ml)
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I
	II
	III
	IV
	Sobrenadante anterior
	1.0
	1.0
	1.0
	1.0
	Ninhidrina al 0.25%
	1.0
	1.0
	1.0
	1.0
	Se somete a todos los tubos a baño de agua hirviendo durante 5 minutos.
	Observe los resultados en cada tubo. Verificar si aparece o no una coloración que va de azul a violeta intenso
RESULTADOS
Sistema A: Efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre la acción proteolítica de la tripsina:
2
3
4
1
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS DE ENSAYO
	
	1
	2
	3
	4
	Precipitado proteico: SI (+ / ++) / NO
	SI (++)
	SI (+)
	NO
	SI (+)
	Efecto inhibidor del extracto de soya: SI / NO
	SI
	NO
	NO
	NO
	Acción proteolítica de la tripsina: SI / NO
	NO
	NO (——)
	SI
	NO (——)
Interpretar los resultados en base a la competencia, considerando si se produce o no la aparición de un precipitado proteico como evidencia del efecto inhibidor del extracto de soya, y de la acción proteolítica de la tripsina.
Sistema B: Control del efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre la acción proteolítica de la tripsina mediante la reacción con ninhidrina:
3
2
4
1
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS DE ENSAYO
	
	1
	2
	3
	4
	Color final: Azul a violeta intenso / Incoloro / Casi incoloro
	Incoloro
	Incoloro
	Azul a violeta intenso
	Casi incoloro*
	Efecto inhibidor del extracto de soya: SI / NO
	SI
	NO
	NO
	NO
	Acción proteolítica de la tripsina: SI / NO
	NO
	NO (——)
	SI
	NO (——)
Interpretar los resultados en base a la competencia, considerando si aparece o no una coloración que va de azul a violeta intenso como evidencia del efecto inhibidor del extracto de soya, y de la acción proteolítica de la tripsina.
DISCUSIÓN:
El estudiante discute o analiza los resultados. Para ello los interpreta comparándolos y verificándolos respecto al marco teórico (principios teórico-prácticos, teorías y leyes que existen para la temática de los resultados) que se encuentra principalmente en libros, y con respecto a los antecedentes (trabajos de investigación alusivos al tema) que se encuentran fundamentalmente en artículos publicados. El marco teórico y los antecedentes se encuentran en las referencias bibliográficas, las cuales deben ser citadas en la discusión.
CONCLUSIONES:
El estudiante, en base a lo realizado en la discusión, elabora conclusiones cortas y puntuales las cuales se enuncian según las competencias a alcanzar en la presente práctica.
Nota: Mínimo deben elaborarse 3 conclusiones por tema.
PREGUNTAS DE APLICACIÓN.
1) ¿Cuáles fueron los objetivos de la práctica?
2) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
3) Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos
4) Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos.
5) Elabore un esquema mostrando dos ejemplos de transaminación e identifique los componentes que interviene.
6) Elabore un esquema mostrando dos ejemplos de desaminación e identifique los componentes que interviene.
7) ¿Cuál es la acción de la soya sobre la digestión de la proteína?
8) ¿Cuál es la razón de utilizar ninhidrina en el experimento de la digestión de las proteínas?
9) ¿Qué ocurre si se trata con el calor la soya?
10) ¿Por qué el ovomucoide de la clara de huevo inhibe la acción de la tripsina?
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta Edición, Editorial Omega, España, 2011
3) ...
Nota: Mínimo deben revisar y consignar 3 referencias bibliográficas, las cuales deben estar citadas en la discusión. Emplear las normas Vancouver.