Práctica 7- Inhibidores de la cadena respiratoria (5)

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Bioenergética y metabolismo de glúcidos, lípidos, aminoácidos, proteínas y nucleótidos
Segunda Unidad
PRACTICA N° 07
 - INHIBIDORES DE LA CADENA RESPIRATORIA --
INTRODUCCION:
La cadena transportadora de electrones es un proceso que se produce en la membrana interna mitocondrial, que mediante reacciones bioquímicas de la Fosforilación Oxidativa producen adenosín trifosfato (ATP), que es el compuesto energético que utilizan los seres vivos mediante reacciones de óxido-reducción. Las fuentes de energía como la glucosa son inicialmente metabolizados en el citoplasma y los productos obtenidos son llevados a la matriz mitocondrial donde continua el metabolismo en el ciclo de Krebs. Los electrones se transportan desde moléculas poco oxidantes como el NADH Y FADH2 hasta el oxígeno. Una vez que los electrones son entregados al oxígeno, se forma agua. Debido a que la cadena sólo transporta electrones, los protones son bombeados hacia el espacio entre las membranas, lo que crea un gradiente de protones con una carga muy positiva fuera de la matriz y una carga muy negativa adentro. Este gradiente obliga a los protones a volver a entrar a la mitocondria por una enzima llamada ATP sintasa que, con la fuerza de entrada de los protones, forma ATP y agua metabólica.
Los inhibidores de la respiración son sustancias que inhiben el transporte de electrones en la cadena respiratoria, y de acuerdo al lugar donde actúan pueden reunirse en cuatro grupos principales; aquellos que bloquean el paso de electrones a nivel del complejo I (NADH-deshidrogenasa) como los barbitúricos, piericidina A (antibiótico), rotenona (insecticida); los que bloquean el complejo II (Succinato-deshidrogenasa), el malonato; los bloqueadores del complejo III (citocromo b y c1) como la Antimicina y los que impiden el paso de electrones del complejo IV (Citocromo-oxidasa) con el oxígeno, como el cianuro, monóxido de carbono. Existen otros compuestos denominados desacopladores de la fosforilación oxidativa. Estos agentes debilitan o destruyen completamente el firme acoplamiento normal entre oxidación y fosforilación. Con el desacoplamiento aumentan las velocidades de oxidación mientras que la fosforilación disminuye, quiere decir que disminuye la producción de ATP, lo cual da como resultado la producción de calor extra que puede manifestarse en forma de calor, afectando de forma indirecta a muchos procesos celulares como el transporte de iones y la permeabilidad de la membrana. Los agentes desacopladores aumentan la permeabilidad de las membranas mitocondriales internas frente a los protones. Entre los desacopladores comunes se cuentan el 2,4-dinitrofenol, la termogenina, entre otros.
COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE:
Demuestra la actividad de la cadena respiratoria, la acción de un indicador de óxido-reducción y el efecto de inhibidores, empleando con responsabilidad enzimas de óxido-reducción presentes en las células de un homogenizado hepático.
PROCEDIMIENTO:
1) Obtención del homogenizado hepático:
· Sacrificar un cobayo y separar el hígado colocándolo en un vaso de precipitación con solución salina a 0ºC y cortarlo en trozos pequeños.
· Colocar los trozos de hígado en un mortero conteniendo aproximadamente 1 gramo de arena y 5 mL de buffer fosfato pH 7,0. Homogenizar hasta obtener una pasta fina y volver a agregar 5 mL del mismo buffer.
· Centrifugar el homogenizado a 4000 rpm por 5 minutos, luego separar el sobrenadante y conservarlo en un tubo de ensayo sumergido en hielo. Rotularlo como HH (homogenizado de hígado).
2)	Sistema de incubación con el sustrato oxidable succinato: Armar el siguiente sistema de trabajo:
	COMPONENTE / TUBO
	I
	II
	III
	IV
	V
	Homogenizado hepático (HH) mL
	1
	1
	1
	1
	1
	Succinato de sodio (mL)
	1
	-
	1
	1
	1
	Malonato de sodio (mL)
	-
	-
	1
	-
	-
	Cianuro de potasio (mL)
	-
	-
	-
	1
	-
	Bicloruro de mercurio (mL)
	-
	-
	-
	-
	1
	Azul de metileno (mL)
	1
	1
	1
	1
	1
	Agua destilada (mL)
	1
	2
	-
	-
	-
· Agitar los tubos y añadir 0,5 mL de aceite mineral suavemente por las paredes de cada tubo.
· Incubar a 37°C durante 30 minutos.
· Observar, registrar e interpretar los resultados en base a la competencia, según exista o no decoloración del indicador en cada uno de los tubos: Azul (oxidado) → Incoloro (reducido).
RESULTADOS:
Valoración cualitativa del efecto de inhibidores de la cadena respiratoria:
V
I
IV
III
II
Interpretación: En base a la competencia, según exista o no decoloración del indicador azul de metileno en cada uno de los tubos.
Azul (oxidado) → Incoloro (reducido). El succinato se oxida al ceder los H+ y e– al indicador (que se reduce)
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS
	
	I
	II
	III
	IV
	V
	Color inicial
	Azul
	Azul
	Azul
	Azul
	Azul
	Color final 
	Incoloro
	Azul
	Incoloro
	Incoloro
	Azul
	Ocurrió óxido-reducción: (SI / NO)
	SI
	NO
	SI
	SI
	NO
	Ocurrió inhibición: (SI / NO)
	NO
	NO (‒‒)
	NO
	NO
	SI
DISCUSIÓN:
El estudiante discute o analiza los resultados. Para ello los interpreta comparándolos y verificándolos respecto al marco teórico (principios teórico-prácticos, teorías y leyes que existen para la temática de los resultados) que se encuentra principalmente en libros, y con respecto a los antecedentes (trabajos de investigación alusivos al tema) que se encuentran fundamentalmente en artículos publicados. El marco teórico y los antecedentes se encuentran en las referencias bibliográficas, las cuales deben ser citadas en la discusión.
CONCLUSIONES:
El estudiante, en base a lo realizado en la discusión, elabora conclusiones cortas y puntuales las cuales se enuncian según las competencias a alcanzar en la presente práctica.
Nota: Mínimo deben elaborarse 3 conclusiones por tema.
CUESTIONARIO:
1) ¿Cuál es la estructura de la cadena respiratoria y explique su funcionamiento? 
2) ¿Explique el fundamento de la Teoría Quimiosmótica de Mitchel?
3) Fundamente porque se usó el succinato de sodio en la práctica.
4) Explique los mecanismos de inhibición que ejercen el malonato, bicloruro de mercurio y cianuro.
5) ¿Explique el funcionamiento de la fosforilación oxidativa y cómo actúan los desacopladores?
REFERENCIAS:
1) Rodwell V, Bender D, Botham K, Kenelly P, Weil A. Harper Bioquímica ilustrada, 30 ed.	Mc Graw Hill 2016. Cap.11, 12,13. Pg 113-138
2) Chávez E, Martínez F, Flores O. Oxidaciones biológicas y bioenergética: Martinez F, Pardo J, Riveros H. eds. Bioquímica de Laguna y Piña 8 ed, 2018; 393-416
3) Da Poian A, Castanho M. Integrative Human Biochemistry. A texbook for Medical Biochemistry. New York. 2015; pg 194-216
Nota: Mínimo deben revisar y consignar 3 referencias bibliográficas, las cuales deben estar citadas en la discusión. Emplear las normas Vancouver.
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