Apuntes 2 inmunología básica

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Desarrollo y maduración de los LB
La expresión de los factores de transcripción nos va a dar este linaje.
BCR
Va a ir madurando de acuerdo a la expresión de diferentes proteínas.
Pro-B cell: Expresión de calnexina sirve como un andamio de soporte para otras proteínas como ig alfa e ig beta (proteínas importantes porque una vez que se exprese el BCR va a permitir una señalización intracelular) estos heterodímeros conectan al BCR con el interior de la célula. No hay BCR sino un Pro-BCR. Cuando comienza a madurar pasa al otro.
Pre-B cell: Pasa el pro BCR al pre BCR tiene la característica de expresar una cadena pesada del receptor, es la primera que se expresa, heterodímeros presentes, sin calnexina, comienza a ocurrir el proceso de recombinación VDJ para la maduración del BCR. Una vez que la cadena pesada es expresada comienza la expresión de una cadena ligera que pasa a un linfocito B inmaduro.
Inmature B cell: Tiene ya un BCR funcional.
Recombinación somática: Se combinan 3 segmentos génicos para hacer un solo gen.
Mecanismo por el cual se va a llevar la producción y maduración de BCR. Este mecanismo tiene la función de generar diversidad del sistema inmunológico, tiene un 1011 BCR. El genoma humano tiene alrededor de 25,000 genes. Tiene esa capacidad de generar una gran diversidad por el mecanismo de recombinación somática.
Tiene lugar en los cromosomas y genes que van a codificar para las cadenas de inmunoglobulinas de BCR (es una inmunoglobulina anclada a la membrana).
Cromosoma 14: 3 regiones de variabilidad, 2 regiones de diversidad, 2 de unión y varias variables, todo eso codifica para la cadena pesada.
Cromosoma 3: 3 regiones de variabilidad, 2 de unión y 1 variable para cadena ligera. No hay región de diversidad.
Cromosoma 22: 3 regiones de unión y 3 variables. Dos cromosomas codifican para cadena ligera.
Elementos necesarios para la recombinación somática
Primero debe haber una secuencia de 7 nucleótidos (heptámetro), 9 nucleótidos (nonámero) + espaciadores, los 3 en total se les conoce como secuencias señalizadoras de la recombinación (SSR). Unos números están al revés porque son complementarios.
También es necesario enzimas Rag1 y 2 que van a unir a los 3 elementos anteriores.
Tenemos la región variables y de unión, las enzimas rag se van a unir a las secuencias señalizadoras porque las reconocen, funcionan como tijeras que van a cortar esos segmentos, las secuencias son complementarias y el genoma se dobla para que se una. Se forma una horquilla. La enzima Tdt va a tapar los huecos para sellar esa unión, por los espacios vacíos que generan los cortes, es transferasa que va a transferir nucleótidos. Para cadena pesada es VdT también interfieren los rag. El gen de la cadena pesada es VDJ.
Generación de la diversidad
La cadena ligera se encuentra en dos cromosomas y cadena pesada en un solo cromosoma.
La recombinación VDJ puede producir 3,369,600 tipos de BCR.
Para alcanzar la diversidad mencionada debe pasar por otros mecanismos que van afinando.
Inmunodeficiencia combinada severa
Se produce por varios mecanismos, uno afecta directamente a la recombinación VDJ. Ocasiona que no haya recombinación y por tanto no maduración.
Ampliación de la diversidad inmunológica: Hipermutación somática
La recombinación VDJ se lleva a cabo en etapas tempranas en médula ósea.
Esta se lleva acabo cuando el linfocito B ya es maduro y se encuentra con un antígeno, el linfocito B se activa y va a provocar que se genere mayor diversidad, existe una serie de mutaciones, hipermutación somática. La enzima responsable es AID (deaminasa de citidina inducida por activación), va a cambiar bases nitrogenadas por diferentes procesos, inducen mutaciones en las regiones variables del receptor del linfocito B. 
Médula Ósea
Pro B: Actividad genética para madurar, van a expresar E2A: va a producir proteínas que van a producir un BCR y un compromiso hacía este estirpe celular. Este gen induce la activación de otros genes: EBF y PAX-5 que aseguran el compromiso celular hacia el linaje de los linfocito B, proteínas únicas del linfocito B. La expresión del gen PAX-5 va a producir la expresión de CD19 y los heterodímeros Ig α e Ig β. Se encuentra en todo su desarrollo, CD19 muy específica de linfocitos B.
Los heterodímeros son quien le da el soporte y señalización al BCR. Se expresa la calnexina que le da soporte a los heterodímeros.
¿Si no hay expresión de CD19 y heterodímero? Problemas en el desarrollo de linfocitos B.
Una vez que se expresa heterodímeros y CD19, comienza la expresión de RAG1 y RAG2 que son genes activadores de la recombinación.
Pre B: La recombinación VDJ va a ocurrir primero para la cadena pesada. Cuando esto pasa, el linfocito pasa a Pre B, se elimina la calnexina y ya hay un pre-BCR.
Se expresa dos cadenas ligeras subrogadas (falsas), asociación con los heterodímeros, inicio de la recombinación de la cadena ligera, se expresa RAG1 y RAG2 para la cadena ligera VJ.
LB inmaduro: Una vez todo lo anterior pasa a LB inmaduro, ya se completo el proceso de maduración en médula, ya un BCR combinado y ahora ver si es funcional.
Cada célula pasa por diferentes puntos de control para asegurar que es funcional, los linfocitos pre y pro B tienen ciertas características diferentes. Pro B son proliferantes y Pre B no son proliferantes. 
Inducción de la tolerancia: La unión del BCR a autoantígenos conduce a la muerte celular o la inactivación. Fas (receptor de muerte celular) induce a muerte celular, presente elevada en etapas inmaduras, y Bcl-2 (factor antiapoptótico) es una proteína que permite la sobrevivencia. La inducción de la tolerancia se lleva a cabo entre Pre B y linfocito B maduro.
Si la célula es potencialmente dañada activa la producción de Fas inhibiendo Bcl2, parte del mecanismo de inducción de la tolerancia.
Dentro de la inducción esta: La tolerancia central en la médula ósea y la tolerancia periférica.
Central: La unión del BCR con autoantígenos, en el ambiente estromal de la médula ósea y si lo reconoce se lleva a cabo la inactivación. Si se identifica que reconoce los autoantígenos, se lleva a anergia (inactivación, se queda en pausa, envejece y muere) o apoptosis.
¿Cuál fue el experimento o hallazgo para poder descubrir la tolerancia central?
En ratones, produjeron LB, le hicieron linfocitos B especifico contra la lisozima de huevo, un segundo ratón hizo que produjeran lisozima de huevo, cruzaron a los dos ratones para que las crías tuvieran células B contra lisozima de huevo y se produjera lisozima de huevo. Estas células son autorreactivas porque está reconociendo algo propio del ratón. Se dieron cuenta que hubo LB silenciados o anérgicos IgM bajo e IgD bajo y en la periferia no hubo LB que reconocieran a la lisozima.
Edición del receptor
Aparte de los mecanismos de apoptosis y silenciamiento antes de anergia o apoptosis, le da un chance de corregir, edición del receptor, internaliza su BCR, lo elimina, se activan los genes de VDJ de nuevo y se recombina la cadena ligera, solo se edita la cadena ligera, si es efectiva la edición puede seguir avanzando y si no se va a apoptosis. 
Inducción de tolerancia
Únicamente la inmadura puede abandonar la Médula si hay una selección positiva central.
Cuando sale de la médula el BCR está parcialmente maduro, cuando reconoce un antígeno pasa la vía de señalización.
Maduración periférica de los LB
Lo que se sabe de esta maduración es en lo ratones, ocurre de manera similar en humanos.
Una vez que sale de la médula se dirige al bazo donde se encuentra el linfocito transicional 1 pasa al transicional 2 que se diferencia a etapas maduras. El BCR es una ig anclada a la membrana que puede ser de clase IgM e IgD. Pasa de IgM a IgD, comienza a cambiar la expresión conforme a avanza la maduración, es un rasgo de madurez.
Se van expresando otras proteínas LB inmaduro, expresa CD19, CD24, estas proteínas nos permiten identificarlas en las diferentes etapas de maduración. Los marcadores identifican a estas proteínas. Conforme va madurando va perdiendo la expresión deesas proteínas, CD19 continua. Nosotros podemos identificarlas por la expresión de sus diversas proteínas.
Diferenciación de los LB
Dentro del bazo, los transicional 1 llegan recién y se establecen, no son proliferantes y propensos a la apoptosis, tienen que pasar por la tolerancia periférica.
El transicional 2 puede proliferar y puede expresar factores anti apoptóticos, entran a ciclo celular. Puede diferenciarse a Linfocito B de zona marginal o folicular.
¿De qué manera el LB transicional 2 puede madurar a marginal o folicular? (Pregunta de tarea).
La transición de 1 a 2 es por la expresión de ciclina en LB-T2 que promueve el ciclo celular. Expresan factores antiapoptóticos (A1/Bfl1 en LBT2 y no en LBT1). El microambiente del bazo juega un papel importante en la maduración de los LB. El 1 puede pasar a 2 (madurar), si hay señales débiles contra el cuerpo (reacción a lo propio, pero débil).
La proteína BAFF (factor de activación de los linfocitos B), si hay señales del BCR que son fuertes este pasa a una muerte celular, si son débiles puede madurar.
¿Cuándo se une el BCR con un autoantígeno? Se activa la vía de señalización de apoptosis, aún en presencia del factor. Selección negativa.
¿Si reconoce el LB un autoantígeno con mucho BAFF? Va a ganar y va a madurar produciendo una enfermedad autoinmune, autoinmunidad.
Los ratones fueron modificados para ver que pasa cuando no expresan BAFF, mutaciones en genes que codifican ese factor. No producen esta proteína. Ratones deficientes de proteína BAFF, se observaba un incremento en los transicionales 1 y disminución en los transicionales 2. Importante la proteínas para madurar a BAFF-2. Hay ratones que se le sobreexpresa el gen para BAFF, menos transicionales 1 y muchos transicionales 2, pueden salir a la periferia en etapa inmadura y producir autoinmunidad. 
Humano vs Ratón
En el centro germinal donde se producen los anticuerpos para que salgan al torrente cuando ya se activó el LB. LB foliculares tienen la característica de migrar a órganos linfoides y llevan a cabo la reacción de centro germinal para producir anticuerpos de diferentes clases.
LB de zona germinal no migran, se quedan en la zona marginal del bazo, captan a antígenos de la circulación y no producen reacción de centro germinal. Solo expresan IgM.
LB reguladores: Regulan la respuesta inmunológica. Producen IL 10 y TGFB. Ubicación: Cavidad pluriplaneal, en el bazo y la circulación.
La maduración se puede dividir en médula ósea y Bazo (eventos moleculares de recombinación VDJ, los mecanismos de tolerancia central y los mecanismos de maduración en el bazo).
Complejo de señalización del Receptor de Antígeno de Células B (BCR)
Señalización entre células: autocrina, paracrina (células secretora hacia célula diana adyacente) y endocrina (las hormonas viajan por el sistema circulatorio a células diana distantes).
Señalización celular
Una molécula o una sustancia llega a un receptor y una vez que la recibe va a encender un circuito dentro de la célula. 
Toda sustancia (ligando) que llegue a un receptor, se une a un receptor de la célula diana que inicia una vía de señalización intracelular para que se active una respuesta. Un ligando siempre se une a un receptor, son específicos. Una célula que no es diana no tiene receptor para ligando.
Cuando el ligando se une al receptor inicia la transducción de señales al interior de la célula, se inicia con activación de proteínas que se llama fosforilación. Las proteínas que se fosforilan reciben el nombre de proteincinasas, se van a fosforilar y se van a activar, la activación va a ser en cascada hasta que llegué la respuesta al núcleo celular.
Primero tenemos una proteína desfosforilada (inactiva) con sitios que pueden ser fosforilados, por medio de una molécula de ATP, pierde fosfato y se une al sitio de fosforilación de la proteína y ya se encuentra fosforilada, la proteína cambia su conformación.
Un dominio es un sitio donde se va a unir una proteína. Dominio cinasa se encuentra mucho en células del sistema inmune. Unión de antígeno con anticuerpo es un enlace no covalente.
En una la cinasas es parte del receptor y en otra se une la cinasa de manera no covalente. 
Las fosfatasas van a desfosforilar para desactivar a la proteína fosforilada.
Receptores acoplados a proteínas G: Se encuentran por lo general para hormonas. La proteína G se encuentra compuesto por y, B y alfa. 
Llega la hormona, estimula al receptor acoplado a proteína G que va activar, que va a hacer que se separan las proteínas que va activar.
Las proteínas tienen ciertos dominios que van a servir como un andamio que van a permitir que se unan los grupos fosfatos.
Segundos mensajero intracelulares:
Los primeros son las que se están fosforilando, segundos que van a permitir una señal más eficaz y efectiva.
Las vías de las MAP-kinasas que es un importante vía (es un ejemplo).
El calcio también funciona como un segundo mensajero. La calmodulina cuando no tiene calcio esta desactivada y con calcio se acopla a ella que permite que se unan otras proteínas para seguir activando la vía de señalización
Problemas con Ca se puede haber afectada la vía de señalización.
El ligando se une al receptor, manda señal para fosforilar, las proteínas tirosinas cinasas (PTK) que va a ir activando hasta llegar al núcleo, las proteínas cinasas pueden activar la salida del calcio (segundo mensajero).
La señalización intracelular activa factores de transcripción (es el objetivo de la señalización celular). 
Un factor de transcripción va activar secuencia de genes específicos para que se traduzcan a una proteína, dependiendo la señal.
El factor de transcripción se une a los sitios de unión del ADN que va a producir una molécula de ARN, se unen a un gen específico. 
Balsas lipídicas
Todo este conjunto de señalización y receptores se encuentra en la membrana celular, en las balsas lipídicas se mueve por toda la membrana, donde se van a encontrar diferentes receptores, conformadas por colesterol y lípidos.
Regulación de la señalización
Aparte de las fosfatasas, hay otros mecanismos de regulación. Una utilizando a los proteosomas, va a ser mediada por la ubiquitina.
Complejo de señalización del BCR
Aparte del BCR intervienen los heterodímeros también conocidos como CD79, muy importantes para la señalización del BCR, permiten la señalización y fosforilación del BCR, el BCR no tiene forma de activar por sí solo.
Los heterodímeros van a tener al interior de la célula unos dominios de activación que van a permitir la fosforilación. la proteínas llamados ITAM 
Motivo de activación (basado en tirosina) de inmunorreceptores (ITAM).
Intervienen también otras proteínas son las CD21, CD19 y CD81. En conjunto con los heterodímeros van a formar el complejo de señalización del BCR, si no están presentes el BCR puede señalizar pero de manera deficiente (inmunodeficiencia común variable, su origen puede ser por esta falta de proteínas). 
CD21 es el receptor para la fracción C3b del complemento que permite unirse a bacterias atacadas por este complemento.
CD19 tiene un dominio extracelular corto, pero intracelular largo que permite a la señalización
CD81 da la estabilidad a ambas proteínas.
En conjunto de todo esto permite la activación de la célula B.
Proteína CD19: Tiene dominio extra celular corto, con dominio intracelular largo que le permite la activación de proteínas, una vez que se une el BCR va a reclutar en sus dominios de activación de cinasas.
PI3K (Protein indositol 3-kinasa) y Lyn (dos proteínas importantes en la señalización del BCR), que van a permitir que la célula se active, MUY IMPORTANTES: VAV, PLC (fosfolipasa C).
4 proteínas importantes en la señalización del BCR activadas por la activación de CD19.
Un trastorno autoinmune por deficiencia en estas proteínas, también alguna de estas proteínas interviene en la activación de proteínas reguladoras.
La proteína Lyn va a ayudar a la activación del BCR, deficiencia de ella hace que esta activación se vea frenada y la célula se va para abajo en su actividadproduciendo una inmunodeficiencia. A su vez funciona para la activación de otras proteínas como CD22 (regula la activación para que la célula vuelva a la calma). Si no hay Lyn por un lado se esta inhibiendo la activación y no regulación.
La falta de regulación produce una inmunodeficiencia y autoinmunidad.
SYK Fyn y LYN importantes en la activación y regulación del BCR, esta activación de estas proteínas a su vez activa BTK (maduración del LB), la BTK permite la activación de fosfolipasa C (FLCy2)
Fosfolipasa C va a producir dos metabolitos, IP3 y DAG que funcionan como segundos mensajeros, DAG activa la vía de las MAP-cinasas y IP3 activa a más BTK.
También IP3 activa a PCK que activa a IKK activando al factor de transcripción NF-kB (kapaBeta).
La proteína lyn al mismo tiempo se va a ctivar y va a fosforilar a CD19 que va a permitir la reclutación de PI3K, PI10 y P65 que van a activar a IP3 permitiendo la liberación de Ca2+ de los depósitos.
Regulación negativa de la señalización del BCR
Tiene que haber algo que regule la señalización para que el receptor vuelva a la calma y la célula.
CD22 necesita que ser fosforilada para regular negativamente que va a apagar o desactivar a las proteínas fosforiladas. Tiene dominios ITIM (de inactivación). Para que se activen se necesitan ser fosforiladas que se lleva a cabo por Lyn. CD22 inhibe la activación del BCR. Regulación positiva es activación y negativa desactivación
CD72 y FcyRIIB intervienen también en la regulación negativa.
Hipermutación somática y cambio de clase.
Los genes VDJ ya recombinados van a permitir cierta diversidad del BCR.
Otro conjunto enzimático que va a producir afinidad es la enzima AID (desaminasa de citosina inducida por activación), donde interviene se conoce como hipermutación somática (específico para LB).
Le enzima AID va a desaminar de una de las bases nitrogenadas del ADN (citosina) cambia a un grupo uracilo.
¿Cómo se activan los LB?
El LB va a reconocer un antígeno que va a provocar la activación de la célula, el antígeno va a ser internalizado, lo degrada y un pedazo de características proteicas va a ser presentado en el MHC II, llega el T, le otrora citocinas para que el LB se diferencie a célula plasmática para que se diferencie a anticuerpos y el anticuerpos puede actuar en 3 mecanismos diferentes.
Tenemos dos tipos de antígenos:
Timo dependientes: Necesitan la cooperación con las células T. Van a ser proteínas. CD40 y CD40L su deficiencia puede ocasionar una inmunodeficiencia.
Timos independientes: No necesitan de la cooperación de linfocitos T, van a ser polisacáridos o lípidos. Los antígenos por si solitos van a ser que el LB se active, a los LB de zona marginal. 
El papel del receptor CD40 va a proveer la unión entre el LB y LB, la T va a expresar CD40 ligando.
La B va a expresar a CD40. Estos dos se unen activando una vía de señalización inducido por varias proteínas que va a activar el factor de transcripción importante NF-KB. Este factor activado va activar genes que van a promover la producción de la enzima AID. Que va a participar en el cambio de clase y la hipermutación somática.
A su ves la T manda citocinas como la IL-4 que promueve también el factor de transcripción.
AID
Va a ser una enzima producida cuando la LB es activada, participas en los proceso de afinación del sistema inmunológico, va a participar
AUDIOOOOOOOOOOOOOOO. 1:54
Va a provocar mutaciones en el ADN. Lo que provoca la diversidad.
Si se ocasiona en otros genes que no son los de Ig van a ser mutaciones aberrantes que puede cambiar la función de una célula. Produciendo una enfermedad.
Hipermutación somática
Va a generar diversidad del repertorio de anticuerpos al introducir mutaciones puntuales en las regiones variables (en los CD erres ELENAAAAAAAAAA), cuando el LB es activado.
AUDIOOOOO. Mecanismos de reparación del ADN. 4:31
Conforme pasa el tiempo en una infección la afinidad a ese antígeno va creciendo.
Reacción del centro germinal
Cuando la LB se activa ocurre la reacción del centro germinal LOS lb DENTRO DE LOS GANLGLSIO linfáticos.
Cuando se lleva a cabo la cooperación la célula B va a expandirse clonalmente en lo que se conoce como reacción de centro germinal, una célula B va a proliferar produciendo muchas LB con un mismo BCR para un mismo antígeno. Cuando ocurre esta reacción ocurre la hipermutación somática, la afinidad y el cambio de clase (la producción d ellos diferentes tipos de Ig).
¿Cómo es que la célula plasmática puede decidir cuando producr cualquier ig?
La AID interviene. Se va a encontrar en las regiones constantes de la ig, en las variables la hipermutación somática. Las LB van a expresar un Ig M a D, los segmentos génicos van a expresar primero para IgM y cuando madura ya es igD, va en orden y por eso lo expresa de esa manera. Para la IgD tiene 4 formas (cambios en la estructura y diferentes funciones).
Después siguen para E y al final A, para que se exprese uno u otro necesitan ser cortados los que no se necesitan. La AID funciona como unas tijera, cuando recibe la señal de que ig producir va a cortar los que no hagan falta. Este proceso es irreversible.
FOTOOOOOOOO VEGA.
Síndrome de hiper igM existe una deficienca de AID.
Diferentes citocina sdirifen el cambio de clase de Ig, va a permitir ese repertorio de inmunoglobulinas.
Respuesta independiente de LT
No hay cambio de clase solo se produce igM. No hay producción de enzima AID, no produce memoria y ocurre en LB de zona marginal y los LB B1 que se encuentran en la cavidad peritoneal.
Cuando ocurre el síndrome hiper gM ocurre en todas las células.
Respuesta inmunológica humoral
Puede ser de ambas formas, AUDIO.
HACER TAREAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA.
Funciones de las Ig
IgM
Va a permitir una mayor fijación al complemento por su forma pentamérica. Primera en aparecer en la infección, en la respuesta adaptativa. Es la más grande por la capacidad de formar pentámeros, mayor fija al complemento y actúa como un receptor de membrana en los LB.
IgG
Esta se sigue produciendo y por eso es de memoria, la M se degrada, es la más abundante. Su presencia persiste después del encuentro con el antígeno. Atraviesa la placenta, inmunidad por parte de la madre, neutraliza toxinas y fija complemento, pero no tanto como IgM y opsonizan microbios. Los diferentes isotipos de ig M van a tener diferentes funciones unos son mejores neutralizando o opsonizando, etc. 
IgA
Se encuentra en el suero y secreciones mucosas, se encuentra en forma monomérica o dimerica, no fija complemento.
IgE
Se encuentra asociada en la membrana de basófilos y mastocitos, relacionada con reacciones alérgicas, el reconocimiento por IgE provoca la degranulación de mastocitos, lo cual libera histamina. Provoca la activación de mastocitos.
IgD
Menos abundante en el organismo, solo se encuentra como receptor de LB, actuando como receptor de antígeno, junto con IgM. Se produce en LB maduros.
Citometría de flujo
Una técnica multiparamétrica en una solo célula de las características físicas y químicas de las células en suspensión.
La célula en su membrana expresa diferentes proteínas (CD=Cluster diferetation), permite que por esta técnica se puedan ubicar diferentes células, las proteínas tienen una función aparte de servir como marcadores. 
Yo quiero marcas LB por CD19, genero anticuerpos dirigidos contra CD19 y exclusivamente van con CD19, se obsserva agregándole un flurocromo que estará pegado al anticuerpo. 
Se identifica a las células en suspensión marcadas van a pasar por un g¿haz de luz que va a emitir una fluorescencia, va a excitarlo con diferentes intensidades de onda emitiendo diferentes intensidades de onda que lo va a reconocer el citómetro de flujo.
Cada una de las células pasa por el tubo y van a ser irradiadas por el haz de luz, sacando (preguntándole) tamaño, complejidad y fluorescencia.
Quiero evaluar LB, evaluando los linfocitos totales (tamaño y granularidad), hay varios B y T, selecciono utilizando al citómetro para separar a los Lb de los T y después separandopor expresión de CD38. Con el dotplot (gráfico de puntos)
Ahora se quiere saber el porcentaje de expresión de la proteína y se hizo por medio del histograma, la curva a la derecha significa mayor expresión de la proteína.
¿Cómo la realizo en un ratón?
Obtención de células provenientes del bazo de un ratón.
Se sacrifica por dislocación cervial, se le extrae el bazo, corte con las tijeras de disección se tiene que extraer inmediatamente antes de que muera.
Se coloca dn una solución de PBS (solución de fosfatos) evita que se mueran las células, se ponen en una caja Petri, debe estar frío el PBS (para estar en un estado basal).
Despues hay que disgregar el bazo (machacarlo) hasta hacer una suspensión rojiza.
La suspensión se va a pasar a un tubo Falcon (15 mm).
Aforar a 11 mL con pBS a 1x (para evitar poner PBS más concentrado para no matar a las células)
Llevar a 1500 rpm por 3 MIN y separar.
Elimino a los eritrocitos para quedarme con las blancas agregando un buffer de lisis (Cloruro de amonio, 3 mL por 3 min (rápido se vuelve a poner PBS). 
Afor a 11 mL con PBS y centrifugo a 1500 por 5 min.
Decantar el sobrenandante y agregafo a susénsión 1 mL de PBS.
Se deben manetenr siemrpe en hielo.
Quiero ver ahora cuantas células tengo y cuantas estas vivas.
Del ml tomar 10 Ul y agregar 90 uL del azul de tripano y agrego la disolución en una cama de neubauer.
Y las muertas se ven brillantes y se cuentan las que no están coloreadas y de esa manera voy a ver la viabilidad.
Se cuentan las células que se encuentran en las células de los 4 cuadritos de las orillas.
FOTO
Para poder contar el número de esplenocitos esta la formula. Primero se multiplico por 4 si solo se cuenta un cuadrante). 
Se puede contar el número de muertas y sacar el porcentaje de viabilidad.
Tinción de citometría de flujo
Quiero separar a los LB mando flurocromo contra CD19 y también me interesa separar a los LB1 y 2 y lanzo CD21 y CD23, CD24 y me interesa si produce IL-10 commo se secreta veo si la esta produciendo, la marco antes de salir de la célula
Coloco un inhibidor de tráfico vesicular (genera poros en las células permitiendo la entrada del anticuerpo), es el proceso por medio de cual Golgi se generan vacuolas que van a llevar proteínas (proteínas) que van a ser secretadas al exterior pero la inhibe este inhibidor y entonces ya no se liberan. INVESTIGARRRRRRRRRRRR.
Voy a se un mix de anticuerpos en exte tubo agrego todos los anticeurpos que voy a utilizar necesito saber cuantos tubos necesito, en cada tubo hay un millón de célula en cada tubo quiero teñir, ósea teñir 10 tubos.
Tengo que ver el insert ¿Cuántos uL debo agregar para teñir?
Por cada tubo debo agregar .9uL de cada anticuerpo debo agregar la cantidad de anticuerpo necesario.
Cada tubo va a tener 10 Ul del mix y 15.38 de las células y aforar con el PBS, para tener un tubo final de 100 uL. E incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 15 min.
Después los saco, agrego 1ml de pbs, centrifugo para quitar los anticuerpos que no se les allá pegdo, finalmente agrego formaldeido que va a proteger a la célula como una fotografía, como sellarla.
Y ya están lista para ser leídas en el citómetro de flujo.
Entegar el tipo de graficas con la separación e interpretación, se ratón sano y enfermo.
Protocolo de inmunización y su utilidad
Inmunización: buco generar una respuesta inmunológica para la producción de anticuerpos.
Inoculación: Introducción de algún agente para que se lleve acabo la respuesta inmunológica.
Vías de administración según el tipo de antígeno, la respuesta y la duración
Oral (en experimento de tiempo prolongado), intravenosa (respuesta inmediata), intramuscular (una respuesta local) intraperitoneal (mayor absorción, más rápida) e intradérmica (respuesta local).
Adyuvantes
Van a ser sustancias que se van a añadir a una vaucna para potenciar o dirigir la respuesta inmunológica frente a un antígeno, hay dos tipos:
Diferentes tipos:
Antígenos
Dos tipos los TI y Td y estructuralmente están los particulados y solublres
Particulados; Partículas de los microorganismos.
Soluble: sustancias producidos por estos antígenos particulados.
Según el tipo de antígeno es el tipo de respuesta. Se deben considerar las características de un antígeno.
Sueros precipitantes y aglutinantes
Los antígenos solubles van a formar generalmente sueros precipitantes.
FOTOO.
Los antígenos particulados van a generar sueros aglutinantes
Esquema de inmunización
Gracias a ellos se pueden generar la protección contra enfermedades por medio de las vacunas. Sirve para diversos estudios de investigación. 
Ejemplo en ratones
Este ratón es inmunodeficiente y yo quiero saber que tanto me esta produciendo de anticuerpos.
En el día cero le voy a sacar sangre para tener una determinación basal para que me diga que cantidad de anticuerpos ahí.
Lo inoculo en el día cero, a los 8 días le vuelvo a sacar sangre, al 14 tambien y al 23 le pongo otro refuerzo con la ayuda de un adyuvante para que haya ina liberación prolongada del antígeno y al dia 30 le saco de nuevo sangre.
Hago una gráfica y veo actuo la respuesta inmunológica.
En los primeros días va a ver presencia de IgM del día 8 al 14, antes de ese tiempo se esta llevando acabo la respuesta innata y principios de adaptativa.
A partir del 14 baja IgM y sube IgG.
¿Cómo afecta la respuesta inmunológica humoral la deficiencia de CD19? Se realiza con un protocolo de inmunización.
Con la gráfica se puede concluir que la producción de CD19 se puede ver que impacta en la producción de anticuerpos.
Ejemplo en conejos
Quiero generar anticuerpos contra el grupo sanguíneo A tengo que inyectar con este antígeno, eritrocitos del grupo A, lo detecta y genera anticuerpos con eritrocitos del grupo A, hago el mismo esquema, en el día 20 tengo un suero Anti-A.
De esa manera pueda determinar y producir anticuerpos.
Poster
Pequqeña introducción, figura
Los logos, titulo, nombre de los autores.
Materiales y métodos: método por el cual llegaríamos a nuestro resultado, el esquema
Resultados: diseñarlos de manera esquemática.
Y las conclusiones.
Imágenes con títulos y descrioción
Se va a imprimir nos va a mandar las medidas, en un papek bond.