Análisis enzimatico cualitativo

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CIUDAD JUAREZ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMEDICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA
ALEJANDRO GONZALEZ 127699
PRÁCTICA # 3
 ANÁLISIS ENZIMÁTICO CUALITATIVO
OBJETIVO:
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de definir el efecto fisicoquímico que generan las enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando además, las propiedades químicas que permiten que una enzima catalice la modificación de un sustrato.
PRERREQUISITOS:
1. Definición de enzima, substrato, apoenzima, holoenzima, proenzima, zimógeno, coenzima, cofactor.
· ENZIMA: Una enzima es una proteína que actúa como catalizador de una reacción química acelerándola. Las enzimas son protagonistas fundamentales en los procesos del metabolismo celular
· SUSTRATO: En bioquímica, un Sustrato es una molécula sobre la que actúa una enzima.
· APOENZIMA: La apoenzima es la parte proteica de una holoenzima, es decir, una enzima que no puede llevar a cabo su acción catalítica desprovista de los cofactores necesarios, ya sean iones metálicos u orgánicos, que a su vez puede ser una coenzima o un grupo prostético
· HOLOENZIMA: Una holoenzima es una enzima que está formada por una proteína (apoenzima) y un cofactor, que puede ser un ion o una molécula orgánica compleja unida (grupo prostético) o no (una coenzima). En resumidas cuentas, es una enzima completa y activada catalíticamente.
· PROENZIMA: Un zimógeno o proenzima es un precursor enzimático inactivo, es decir, no cataliza ninguna reacción como hacen lasenzimas. Para activarse, necesita de un cambio bioquímico en su estructura que le lleve a conformar un centro activo donde pueda realizar la catálisis.
· ZIMOGENO: Un zimógeno o proenzima es un precursor enzimático inactivo, es decir, no cataliza ninguna reacción como hacen las enzimas. Para activarse, necesita de un cambio bioquímico en su estructura que le lleve a conformar un centro activo donde pueda realizar la catálisis
2. Determine lo que significa: especifidad enzimática y alosterismo.
· ESPECIFICIDAD ENZIMATICA
Una de las características más importantes de los enzimas es su alta especificidad sobre la reacción que catalizan. Cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. Esta especificidad se debe a la complementariedad que debe existir entre el sustrato y el centro activo del enzima
· ALOSTERISMO
Las enzimas alostéricas son enzimas que cambian su conformación al unirse un efector, lo que conduce a un cambio aparente en la afinidad de unión de otroligando en un sitio distinto de la molécula. Esta "acción a distancia" de la unión de un ligando que afecta a la unión de otro en un sitio claramente diferente es la esencia del concepto de alostería o alosterismo. El alosterismo juega un papel crucial en muchos procesos biológicos fundamentales, incluyendo la señalización celular y la regulación del metabolismo, entre otros.
3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidoreductasa, transferasa, liasa, ligasa e isomerasa.
HIDROLASA: Una hidrolasa es una enzima capaz de catalizar la hidrólisis de un enlace químico. Por ejemplo, una enzima que catalice la reacción siguiente será una hidrolasa: La nomenclatura sistemática denomina a estas enzimas como sustrato hidrolasa
OXIREDUCTASA: Una oxidorreductasa es un grupo de enzimas que catalizan la transferencia de electrones desde una molécula donante (el agente reductor) a otra aceptora (el agente oxidante).
TRANSFERASA : Una transferasa es una enzima que cataliza la transferencia de un grupo funcional, por ejemplo un metilo o un grupo fosfato, de una molécula donadora a otra aceptora
LIASA: Las liasas son enzimas que catalizan la ruptura de enlaces C-C, C-O, C-N y otros enlaces por otros medios distintos a la hidrólisis o la oxidación, reacciones que son realizadas por enzimas específicas llamadas hidrolasas y deshidrogenasas respectivamente
LIGASA: Una ligasa es una enzima capaz de catalizar la unión entre dos moléculas de gran tamaño, dando lugar a un nuevo enlace químico; generalmente, sucede junto con la hidrólisis de un compuesto de alta energía
ISOMERASA:  una enzima isomerasa es una enzima que transforma un isómero de un compuesto químico en otro. Puede, por ejemplo, transformar unamolécula de glucosa en una de galactosa.
CLORURO DE CALSIO: El cloruro cálcico o cloruro de calcio es un compuesto químico, inorgánico, mineral utilizado como medicamentoen enfermedades o afecciones ligadas al exceso o deficiencia de calcio en el organismo y da una coloración naranja-roja a la llama.
CASEINA:Proteína de la leche de los mamíferos que contiene gran cantidad de fosfato y que se emplea en la industria del papel, de pieles, de pintura, en medicina y en alimentación.:
UREASA: Es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a dióxido de carbono y amoníaco
INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones químicas. De igual manera, participan en muchos mecanismos de regulación que de este modo permiten que el metabolismo se adapte a diferentes situaciones. Casi todas las enzimas son proteínas pero también hay ácidos nucleicos catalíticamente activos conocidos como “ribozimas” (Koolman & Röhm, 2004).
Las enzimas están formadas por una parte proteica o apoenzima inactiva. La unión de un cofactor o grupo prostético de forma covalente a la apoproteina da lugar a lo que denominamos holoenzimas, que ya presenta actividad catalítica (enzima activa). Los cofactores son moléculas pequeñas de naturaleza orgánica o inorgánica que requieren las enzimas para poder presentar actividad. Los cofactores inorgánicos pueden estar constituidos por uno o varios iones, como hierro, magnesio, zinc, cobre, manganeso, entre otros; o bien, por un complejo orgánico o metaloorgánico, en cuyo caso reciben el nombre de coenzima (Teijón, et al., 2006).
Las enzimas modifican la velocidad de una reacción química sin afectar el equilibrio final y sólo se requieren pequeñas cantidades para efectuar la transformación de un gran número de moléculas de sustrato. La actividad de la mayor parte de las enzimas es bastante específica tanto para el tipo de acción catalizada como por los compuestos o sustratos cuya modificación catalizan (Especificidad de sustrato), así mismo las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentración de sustrato, coenzimas etc. (Teijón, et al., 2006; Koolman & Röhm, 2004).
Clasificación de las enzimas
En la actualidad hay un gran número de enzimas (más de 2000), para su clasificación se usa un sistema que toma en cuenta tanto la especifidad de acción como la especificidad del sustrato. La International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) ha establecido un sistema en donde las enzimas se clasifican en 6 grupos de acuerdo con el tipo de reacción que catalicen (Figura 1): Oxidoreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, Ligasas o Sintetasas (Teijón, et al., 2006; Voet & Voet, 2006; Koolman & Röhm, 2004). 
En el catálogo de enzimas, cada una de ellas está indicada por un número EC (Enzyme Comission Numbers) de varias cifras, donde el primer número indica que la enzima corresponde a una de las seis clases principales de enzimas, los dos números siguientes definen la subclase y la sub-subclase y el último número es el número progresivo dentro de la sub-subclase (Teijón, et al., 2006; Koolman & Röhm, 2004). Por ejemplo, en el caso de la enzima tripeptido aminopeptidasa tiene el código EC 3.4.11.4, construido así:
3 por hidrolasa (enzima que usa el agua para catalizar algunas reacciones).
3.4 por hidrolasa, que actúa sobre los enlaces peptídicos.
3.4.11 por aquellas que actúan sobre el terminal amino de aminoácido de un polipéptido.
3.4.11.4 por aquellas que actúan sobre el terminal amino final de un tripéptido. 
MATERIAL: 
Tubos de ensaye
Pipetas de 1.0 ml
Pipetas de 5.0 ml
Propipetas
Gradillas
Tapones de algodón
Vasos de precipitado
EQUIPO:
Platina caliente
Incubadora 37°C
REACTIVOS:Semilla vegetal (semilla de sandía u otra que contenga ureasa)
Urea al 2%
Solución de Azul de bromotimol – NaOH 
Leche
Oxalato de amonio 2%
Solucion de Renina
Cloruro de calcio 10%
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Efecto del calor sobre la actividad de las enzimas "Actividad de la ureasa”.
	Tubo
	1
	2
	3
	Semilla Vegetal
	pizca
	pizca
	pizca
	Agua destilada
	0
	5.0 ml
	5.0 ml
Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandía y enseguida coloque un tapón de algodón a los tubos 1 y 2 y colóquelos en baño a ebullición durante 20 minutos. (Cuidar que no se acabe el agua del baño).
	Agua
	5.0 ml
	0
	0
	Azul de Bromotimol
	2 Gotas
	2 Gotas
	2 Gotas
Añadir ácido débil (GOTAS) en caso de que la solución tenga un color azul.
	Urea
	5.0 ml
	5.0 ml
	5.0 ml
Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire del color amarillo al azul en cada uno de los tubos.
Experimento No. 2 Determinación de actividad de la Renina.
	Tubo
	1
	2
	3
	Leche
	3.0 ml
	3.0 ml
	3.0 ml
	Oxalato de Amonio
	0
	0.5 ml
	0.5 ml
	Solución renina
	3 Gotas
	3 Gotas
	3 Gotas
Mezclar e incubar a 37°C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos. Posteriormente, calentar el tubo No. 2 a ebullición y enfriar. Cuando ya estén fríos los tubos agregar:
	Cloruro de Calcio 
	0 
	10 Gotas 
	10 Gotas 
Mezclar y comparar los cambios observados en los tubos No 2 y 3 con el 1.
RESULTADOS:
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DISCUSIÓN:
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CONCLUSIÓN:
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CUESTIONARIO:
1.- ¿De acuerdo a la clasificación enzimática a que clase pertenecen las enzimas utilizadas (renina y ureasa) y por qué?
2.- Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa: R: Del genero proteus. Vulgaris, mirabilis
3.- ¿Qué grupos químicos participan en el sitio activo de las enzimas?
4.- Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan sí, no; ¿por qué?
5.- ¿Por qué algunas proteínas actúan como catalizadores (enzimas) de reacciones con alta especificidad, mientras que otras proteínas que también contienen aminoácidos en su estructura no lo hacen?
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:
Koolman J., Röhm C.H. Bioquímica: Texto y atlas. Madrid, España: Panamericana, 2004.
Teijón J.M., Garrido A., Gaitán D., Villaverde C., Mendoza C., Ramírez J. Fundamentos de bioquímica estructural. Madrid, España: Tébar. 2006
Voet D., Voet G. Bioquímica. Madrid, España: Panamericana, 2006