RECUENTO DE MICROORGANISMOS

Vista previa del material en texto

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE ESTUDIOS CIENTÍFICOS Y TECNOLÓGICOS
¨MIGUEL OTHÓN DE MENDIZÁBAL¨
CARRERA DE TÉCNICO LABORATORISTA QUÍMICO
CONTROL SANITARIO MICROBIOLÓGICO
REPORTE DE PRÁCTICA 6, 7 y 8:
RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA Y TÉCNICAS DE TINCIÓN
EQUIPO 3:
· ALMAGUER SALINAS VERÓNICA ITZEL
· LARA PORTILLA ANA PATRICIA
· PALMA TREJO FÁTIMA DANIELA
· SALDAÑA BERNAL ISABEL MONSERRAT
INTRODUCCIÓN.
El “recuento de organismos mesofílicos en placa” es una técnica microbiológica fundamental utilizada para obtener información sanitaria importante acerca de un alimento, y su contenido de microorganismo mesofílicos aerobios como indicadores de: valor comercial del alimento, condiciones de higiene que se tomaron durante el proceso, almacenamiento y transporte del alimento, el posible riesgo sanitario por presencia de microorganismos patógenos, calidad de ingredientes del alimento, eficiencia de preservadores o microbicidas en el proceso, entre otras cosas.
Para el desarrollo de éstas prácticas se utilizó una muestra de mantequilla, ya que es un alimento que muy comúnmente utilizamos, y sería interesante saber qué tipo de bacterias crecen en dicho alimento.
La mantequilla es un derivado lácteo que tiene importancia como alimento por la grasa que contiene. Nutricionalmente esta grasa es importante porque transmite las vitaminas liposolubles de la leche como son las vitaminas A, D y E principalmente. En cuanto a su valor energético es equivalente al de otras grasas y aceites. Es la emulsión de agua en grasa, obtenida como resultado del suero, lavado y amasado de los conglomerados de glóbulos grasos, que se forman por el batido de la crema de leche y es apto para consumo, con o sin maduración biológica producida por algunas bacterias específicas.
Las bacterias dañinas que pueden crecer en este alimento son:
· Pseudomonas putrefaciens: origina olores nauseabundos al descomponer las grasas de la mantequilla, ésta alteración se conoce como “superficie pútrida”.
· Streptococcus lactis: origina el deterioro conocido como “sabor a malta”.
· Levaduras del género Torula: causan deterioro de la mantequilla originando lipólisis y decoloraciones características de sus esporas. 
· Campylobacter jejuni: Es un bacilo que responde negativamente a la tinción de Gram, presenta movilidad mediante uno o dos flagelos polares (que se encuentran en sus extremos); es microaerófilo capaz de crecer en una atmósfera de composición 5% de O2. Provoca infecciones intestinales usualmente de origen zoonótico. El cuadro clínico se manifiesta por una diarrea aguda, que puede o no ir acompañada de vómitos, dolor abdominal, dolor de cabeza y malestar general.
· Coxiella burnetii: es una especie de bacteria patógena intracelular, el agente causante de la fiebre Q. El género Coxiella es morfológicamente similar a las rickettsias, pero con ciertas diferencias genéticas y fisiológicas. C. burnetii es un pequeño bacilo Gram-negativo, con dos fases de crecimiento, así como una forma de esporas inactivas en el suelo. Puede sobrevivir a los desinfectantes corrientes y es resistente a muchos otros cambios en el ambiente.
· Escherichia coli O157:H7: es una cepa enterohemorrágica de la bacteria E. coli y una causa de intoxicación alimentaria debido a la producción de verotoxina. La infección conduce frecuentemente a una diarrea hemorrágica y ocasionalmente a una falla renal.
· Listeria monocytogenes: es un bacilo Gram positivo, una bacteria que se desarrolla intracelularmente y es causante de la Listeriosis. Es uno de los patógenos causante de infecciones alimentarias más violentos, con una tasa de mortalidad entre un 20 a 30%, más alta que casi todas las restantes toxicoinfecciones alimentarias.
· Mycobacterium tuberculosis: es una bacteria aerobia estricta1​ patógena responsable de la mayor cantidad de casos de tuberculosis en el mundo.2​ Quien la describió por primera vez, el 24 de marzo de 1882, fue Robert Koch (de ahí el heterónimo (sobrenombre) de esta bacteria: «bacilo de Koch»).
· Salmonella spp: es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae constituido por bacilos gramnegativos intracelulares anaerobios facultativos con flagelos peritricos. Constituye un grupo importante de patógenos para animales y humanos.
· Yersinia enterocolitica: es un representante de las enterobacteriaceae. Es un bacilo gram negativo, no esporulado, capaz de crecer dentro de una amplia escala de temperaturas, desde -1 °C hasta +40 °C. Presenta factores antifagocitarios (cápsula). Se multiplica en las mucosas y se puede transmitir a través del contacto con animales, ingestión de productos alimenticios o contaminados o agua contaminada. Raramente causa infecciones mortales. Habita en el intestino de animales domésticos. 
· COLIFORMES: grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos.
Los límites permiscibles por grupo microbiano para la mantequilla son los siguientes:
· Mesofílicos aerobios: 10,000 ufc/g
· Coliformes totales: 100 ufc/g
· Hongos y levaduras: 20 ufc/g
Para poder llevar a cabo la técnica de recuento en placa, se utilizaron dos tipos de medios de cultivo: AGAR CUENTA ESTÁNDAR (ACE) y AGAR PAPA DEXTROSA (PDA), el último se utilizó para el crecimiento de hongos y levaduras, y el primero para el resto de bacterias que pudiera contener la muestra. 
El agar cuenta estándar se utiliza para la enumeración de bacterias en agua, aguas residuales, alimentos y productos lácteos en un entorno de laboratorio. El agar para métodos estándar no está destinado a ser utilizado en el diagnóstico de enfermedades u otras condiciones en humanos. Esta fórmula cumple con la Asociación Americana de Salud Pública (APHA) y la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC). Fue desarrollado por Buchbinder, Baris y Goldstein en 1953 a petición de la Asociación Americana de Salud Pública. Los resultados mostraron que un medio deshidratado libre de leche que contenía extracto de levadura al 0.25%, triptona al 0.5%, dextrosa al 0.1% y agar al 1.5% por litro aproximaba la productividad del agar extracto de glucosa triptona con leche añadida. Buchbinder et al. recomendó utilizar un medio de cultivo deshidratado en la preparación del medio de recuento en placa estándar en lugar de preparar el medio a partir de los ingredientes. 
El agar papa dextrosa se utiliza para el cultivo de hongos en un entorno de laboratorio. El agar papa dextrosa no está destinado a ser utilizado en el diagnóstico de enfermedades u otras condiciones en humanos. El agar papa dextrosa (PDA) es un medio de uso general para levaduras y mohos que puede ser suplementado con ácido o antibióticos para inhibir el crecimiento bacteriano. Se recomienda para los métodos de recuento en placa para alimentos, productos lácteos y pruebas de cosméticos. El PDA se puede utilizar para el cultivo de ciertas levaduras y mohos. La base nutricionalmente rica (infusión de papa) estimula la esporulación del moho y la producción de pigmentos en algunos dermatofitos.
Para poder identificar la morfología y estructura de las bacterias presentes en la muestra, se hizo uso de una técnica de tinción diferencial (técnica que se usa para diferenciar de manera más explícita los microorganismos), la tinción de Gram. Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El materialde la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.
Después de llevar a cabo las prácticas, obtuvimos como resultado que en la muestra de mantequilla que analizamos teníamos la presencia de estafilococos Gram positivos, así como Gram negativos.
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:
Para llevar a cabo las diluciones de la muestra en el laboratorio, se siguieron los siguientes pasos:
1. Sanitizar y desinfectar la mesa de trabajo.
2. Colocar en la mesa de trabajo el frasco con solución isotónica (90 mL.), las seis cajas Petri estériles que se ocuparían, el mechero, el asa bacteriológica, cuatro tubos de ensaye con 9 mL de solución isotónica cada uno en una gradilla y las cinco pipetas estériles (tapadas).
3. Rotular los cuatro tubos de la siguiente manera: 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000.
4. Rotular las cajas Petri de la siguiente manera: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, PDAH y PDAL.
5. Pesar o medir 10 g/mL de la muestra a analizar.
6. Colocar la muestra en el frasco con los 90 mL de solución isotónica, y diluirla (o tratar de que se diluya lo máximo posible).
7. Cuando la muestra esté diluida, destapar una de las pipetas y tomar tres mililitros, depositar un mililitro en el tubo de ensaye etiquetado con 1:10, otro en la caja Petri 1:10 y el restante depositarlo en la caja Petri para hongos (PDAH). Poner la pipeta en un lugar aislado para ya no volverla a usar.
8. Tomar otra pipeta estéril, destaparla y tomar 3 mL del tubo de ensaye 1:10, colocar 1 mL en el tubo 1:100, otro mL en la caja Petri 1:100 y el útlimo en la caja Petri para levaduras (PDAL). Poner la pipeta en un lugar aislado para ya no volverla a usar.
9. Tomar otra pipeta estéril, destaparla y tomar 2 mL del tubo de ensaye 1:100, colocar 1 mL en el tubo 1:1000 y otro mL en la caja Petri 1:1000. Poner la pipeta en un lugar aislado para ya no volverla a usar.
10. Tomar la última pipeta estéril, destaparla y tomar 2 mL del tubo de ensaye 1:1000, colocar 1 mL en el tubo 1:10000 y otro mL en la caja Petri 1:10000. Poner la pipeta en un lugar aislado para ya no volverla a usar.
11. Sacar del autoclave los medios de cultivo que previamente se habían metido para esterilizar, dejar enfriar hasta que sea soportable para la superficie de nuestra mano, posteriormente colocar aproximadamente 24 mL de medio de cultivo Agar Cuenta Estándar a todas las cajas Petri a excepción de las que están rotuladas como PDAH y PDAL.
12. Adicionar 24 mL aproximadamente de Papa Dextrosa y Agar a las cajas Petri rotuladas como PDAH y PDAL.
13. Sellar perfectamente las seis cajas Petri, esperar a que solidifiquen y encubar de manera invertida a una temperatura de 37oC, excepto la caja PDAH, esa se dejará a temperatura ambiente, por 48 horas.
14. Revisar el crecimiento de las colonias en las cajas, y realizar el conteo. Para ello se deben contar las colonias de la caja Petri 1:10000, o la caja que contenga entre 25 y 250 UFC y multiplicarlas por 1x105. 
Tinción Diferencial de Gram.
Preparación del frotis:
1. Se esteriliza el asa y se coloca una pequeña película de agua sobre un portaobjetos limpio.
2. Se vuelve a esterilizar el asa y se enfría para tomar una asada de crecimiento bacteriano.
3. Se esparce la carga bacteriana con ayuda del asa, sobre la gota en el portaobjetos con un tamaño adecuado.
4. Se deja secar.
5. Se fija el frotis pasándolo por el mechero de 2-3 veces.
Tinción:
1. Colocar el frotis sobre el puente de tinción y cubrir toda la capa microbiana con el cristal violeta y dejar actuar durante un minuto. 
2. Al chorro suave del agua, escurrir el exceso de colorante.
3. Cubrir la capa microbiana con lugol dejándolo actuar durante un minuto.
4. Lavar y escurrir el exceso de lugol al chorro de agua.
5. Decolorar el frotis con alcohol cetona dejando gotear durante 15 a 20 segundos.
6. Lavar con agua de la llave 
7. Cubrir el frotis con safranina dejandolo actuar de 30 a 60 segundos.
8. Escurrir y lavar el exceso de colorante con agua de la llave 
9. Dejar secar el frotis al aire 
10. Finalmente se observa la preparación hasta a objetivo de inmersión, para identificar la estructura y morfología microbiana de las bacterias presentes en la muestra que se está analizando.
Conclusión.
ALMAGUER SALINAS VERÓNICA ITZEL: La tinción de Gram se realizó de manera correcta y ordenada, lo cual permitió la identificación de ciertos organismos en la muestra, como lo son cocos e incluso la formación de algunos diplococos, sin embargo es muy importante conocer la parte teórica y el límite de organismo permisibles en cada alimento pues gracias a esto se puede identificar si el alimento es o no apto e incluso proceder a una demanda. Los distintos tipos de tinción sirven para determinados casos y no está de más conocerlos y practicarlos para en un futuro ayudar al desarrollo en la industria alimentaria.
LARA PORTILLA ANA PATRICIA: Para poder obtener resultados correctos y no “falsos positivos”, se requiere llevar a cabo de la manera correcta todas las técnicas que se requieren para poder llegar al objetivo de las prácticas. Desde hacer correctamente las diluciones de la muestra, hasta la técnica de tinción para poder identificar al microscopio los microorganismos presentes en dicho alimento. A pesar de que nuestra muestra no se diluyó completamente en la solución isotónica (por estar constituido principalmente por grasa), al regresar a revisar después de las 48 horas de incubación, se obtuvo un crecimiento ciertamente coherente, a excepción de una caja Petri. La caja donde se tenía el crecimiento de la dilución 1:10000 presentaba mayor cantidad de UFC que la que contenía la dilución 1:1000, y se supone debería ser al revés. Pero después de hacer el frotis y la técnica de tinción, se pudo observar perfectamente en el microscopio la estructura y morfología de los microorganismos presentes, la muestra de mantequilla tenía estafilococos Gram negativos en una UFC, pero en otra también había estafilococos Gram positivos.
PALMA TREJO FÁTIMA DANIELA: La práctica de “recuento de mesófilos aerobios en un alimento” y “morfología y tinciones microbianas” fueron realmente interesantes, la primera por la ayuda que nos da al “aislar” cierto tipo de microorganismos para posteriormente contarlos, y la segunda por su gran relevancia a la hora de identificarlos, base comparten la característica de que son relativamente sencillas y además son fundamentales para la identificación de microorganismos.
SALDAÑA BERNAL ISABEL MONSERRAT: Tras realizar una buena técnica de tinción se logró apreciar los morfología, estructura, color, tamaño y forma de los microorganismos vistos y así poder realizar el recuento de mesófilos que se encontraron en un alimento, ayudando así a analizar y verificar que ciertos alimentos cumplan con los límites microcosmos que deben de tener, de esta forma se evitará que dichas levaduras u hongos causen enfermedades en la población. Tener el control de estos microorganismos es de sumamente importante.
Referencias
Benìtez, A. A. (27 de Agosto de 2013). Prezi. Obtenido de Mantequilla y sus bacterias: https://prezi.com/gtrqm3kfpute/bacterias-de-la-mantequilla/
Berrueta, T. U. (10 de Noviembre de 2017). Departamente de microbiología y parasitología. Generalidades de micología. Obtenido de http://www.facmed.unam.mx
Castillo, A. S. (13 de Abril de 2015). Postgrado de biotecnología-microbiología. Obtenido de Mantequilla y su microbiología: http://biotecnologiapostgrado.blogspot.com
Hylary, Q. G. (29 de Septiembre de 2014). Microbiología. Obtenido de http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com