INFORME BIOQUIMICA

Vista previa del material en texto

Universidad de Oriente
Núcleo Bolívar
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Laboratorio de Bioquímica
Medicina
Semestre II-2018
Grupo A- Jueves.
PRÁCTICA Nº 03: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA AMILASA SALIVAL.
 (
Integrantes:
Ascanio, Carla CI: 29.689.508
Brito, María 
 CI: 
26.753.225
Grau, Luisanny CI: 26.744.115
Lyon, Uzziel CI: 26.623.639
Rodríguez, Sofía CI: 27.255.030
)
Profesora:
González, Rafael.
Ciudad Bolívar, Abril 2019.
INTRODUCCIÓN.
Las enzimas son compuestos proteicos, también llamados catalizadores biológicos ya que se encargan de realizar la mayoría de las transformaciones energéticas que ocurren en un organismo, aumentando su velocidad de reacción sin alterar el equilibrio final, cada enzima se une a un solo tipo de sustrato por lo que son altamente específicas y eficientes en su función ya que pequeñas concentraciones pueden catalizar grandes concentraciones de sustrato, actúan bajo condiciones determinadas de pH, temperatura, concentración del sustrato y cofactores, siendo muy susceptibles a cualquier variación de estos parámetros (distintos para cada enzima), cambios bruscos resultan en la inhibición o reducción de la actividad enzimática y finalmente la desnaturalización de la enzima y los parámetros adecuados, permiten que la actividad enzimática sea óptima.
Las propiedades catalíticas de las enzimas están ligadas a la presencia de un centro activo, que une el sustrato y estabiliza el estado de transición de la reacción, produciendo el complejo enzima-sustrato. En el centro activo se dan factores de proximidad y orientación relativa de los sustratos, fenómenos de superficie y procesos de distorsión de enlaces. El centro activo puede contener cadenas laterales de aminoácidos capaces de participar en procesos de catálisis ácido-base o covalente, también poseen un centro alostérico en donde se van a unir sustancias que pueden activar o inhibir la actividad de la enzima (McKee, 2014).Sin enzimas, la mayor parte de las miles de reacciones bioquímicas que sustentan los procesos vitales del ser humano ocurrirían a velocidades imperceptibles, muy lentas para lograr su cometido, causando incompatibilidad con la vida. 
El almidón es una mezcla de dos polisacáridos, amilosa (10-20%) y amilopectina (80-90%), ambos formados por unidades de glucosa (Cox y Nelson, 2006). La amilosaposee una estructura lineal, mientras que la amilopectina es ramificada. Está presente en el trigo, la patata, el arroz, el maíz, etc., constituyendo la reserva de energía de la mayoría de vegetales, y es la principal fuente de energía delos alimentos que comemos. Para que el cuerpo humano pueda aprovechar la glucosadel almidón es preciso degradarlo previamente. La saliva humana contiene entre 0 y 3mg/ml de una enzima llamada amilasa,llamada también sacarasa o ptialina, la cual es una enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente en las glándulas salivales y en el páncreas. Cuando una de estas glándulas se inflama, aumenta la producción de amilasa. 
El objetivo de la experimentación es identificar la acción que realiza la amilasaproducida en las glándulas salivales de la boca sobre el almidón y comprobarcómo es que ésta rompe los enlaces del polisacárido en monosacáridos.
REPORTE DE RESULTADOS.
TABLA 1. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.
	Sustrato
(ml)
	CT
(mmoles/l)
	CN
(mmoles/l)
	CS
(mmol/l)
	Vo
(CS/TR)
	1/CT
	1/Vo
	1.0
	4.09x10-3 mmol/l
	0.17x10-3 mmol/l
	3.93x10-3 mmol/l
	1.96x10-3 mmol/min
	244,49 mmol/l
	510,20 mmol/min
	1.5
	6.14x10-3 mmol/l
	0.46x10-3 mmol/l
	5.68x10-3 mmol/l
	2.84x10-3 mmol/min
	162,86 mmol/l
	352,11 mmol/min
	2.0
	8.18x10-3 mmol/l
	0.21x10-3 mmol/l
	7.97x10-3 mmol/l
	3.98x10-3 mmol/min
	122,24 mmol/l
	251,25 mmol/min
	2.5
	10.22x10-3 mmol/l
	2.24x10-3 mmol/l
	7.98x10-3 mmol/l
	3.99x10-3 mmol/min
	97,84 mmol/l
	250,65 mmol/min
	3.0
	12.27x10-3 mmol/l
	4.28x10-3 mmol/l
	7.97x10-3 mmol/l
	4.00x10-3 mmol/min
	81,69 mmol/l
	250,00 mmol/min
Fuente:Valores obtenidos a partir de práctica realizada en el Laboratorio de Bioquímica UDO-Bolívar.
TABLA 2. Efecto de la concentración de enzima.
	Sustrato
(ml)
	CT
(mmol/l)
	CN
(mmol/l)
	Cs
(mmol/l)
	E
	Vo
(mmol metabolizado/min)
	
1ml
	
4.09x10-3 mmol/l
	3.10x10-3mmol/l
	0.99x10-3mmol/l
	0.2
	0.49x10-3 mmol/min
	
	
	1.95x10-3 mmol/l
	2.14x10-3 mmol/l
	0.4
	1.07x10-3 mmol/min
	
	
	0.93x10-3mmol/l
	3.16x10-3 mmol/l
	0.6
	1.58x10-3 mmol/min
	
	
	0.22x10-3mmol/l
	3.87x10-3 mmol/l
	0.8
	1.93x10-3 mmol/min
Fuente:Valores obtenidos a partir de práctica realizada en el Laboratorio de Bioquímica UDO-Bolívar.
TABLA 3. Efecto de la variación del pH sobre la actividad de la enzima. 
	Sustrato
(ml)
	CT
(mmol/l)
	CN
(mmol/l)
	Cs
(mmol/l)
	pH
	Vo
(mmol metabolizado/min)
	
1ml
	4.09x10-3 mmol/l
	4. 09x10-3mmol/l
	0 mmol/l
	3
	0 mmol/min
	
	4.09x10-3 mmol/l
	1.97x10-3 mmol/l
	2.12x10-3 mmol/l
	5
	1.06 x10-3 mmol/min
	
	4.09x10-3 mmol/l
	1.44 x10-3mmol/l
	2.65x10-3 mmol/l
	7.2
	1.33 x10-3 mmol/min
	
	4.09x10-3 mmol/l
	1.61 x10-3mmol/l
	2.48x10-3 mmol/l
	8
	1.24x10-3 mmol/min
	
	4.09x10-3 mmol/l
	3.83 x10-3mmol/l
	0.26x10-3 mmol/l
	11
	0.13x10-3 mmol/min
Fuente:Valores obtenidos a partir de práctica realizada en el Laboratorio de Bioquímica UDO-Bolívar.
TABLA 4. Efecto de la variación de la temperatura sobre la actividad enzimática.
Fuente:Valores obtenidos a partir de práctica realizada en el Laboratorio de Bioquímica UDO-Bolívar.
	Sustrato
(ml)
	CT
(mmol/l)
	CN
(mmol/l)
	Cs
(mmol/l)
	Temperatura
C°
	Vo
(mmol metaboliz/min)
	
1ml
	4.09×10-3 mmol/l
	2.00×10-3 mmol/l
	2.09×10-3 mmol/l
	0
	1.04×10-3
	
	4.09×10-3 mmol/l
	8.50×10-5mmol/l
	4.00×10-3 mmol/l
	37
	2.00×10-3
	
	4.09×10-3 mmol/l
	2.00×10-3 mmol/l
	2.09×10-3 mmol/l
	40
	1.04×10-3
	
	4.09×10-3 mmol/l
	3.00×10-3 mmol/l
	1.00×10-3 mmol/l
	50
	0.50×10-3
TABLA 5. Efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimática.
	Sustrato
(ml)
	CT
(mmol/l)
	CN
(mmol/l)
	SUS
TANCIA
	Cs
(mmol/l)
	Vo
(mmol metabolizado/min)
	
0.5
	
2.05x10-3 mmol/l
	1.54x10-3 mmol/l
	Acarbosa
	0.51x10-3 mmol/l
	0.25x10-3 mmol/min
	
	
	1.8x10-3 mmol/l
	H2SO4
	0.22x10-3 mmol/l
	0.11x10-3 mmol/min
	
	
	0.1x10-3 mmol/l
	NaCl
	1.95x10-3 mmol/l
	0.98x10-3 mmol/min
	
1ml
	
4.09x10-3 mmol/l
	3.55x10-3 mmol/l
	Acarbosa
	0.54x10-3 mmol/l
	0.27x10-3 mmol/min
	
	
	3.82x10-3 mmol/l
	H2SO4
	0.27x10-3 mmol/l
	0.14x10-3 mmol/min
	
	
	0.19x10-3 mmol/l
	NaCl
	3.90x10-3 mmol/l
	1.95x10-3 mmol/min
	
1.5ml
	
6.14x10-3 mmol/l
	5.42x10-3 mmol/l
	Acarbosa
	0.72x10-3 mmol/l
	0.36x10-3 mmol/min
	
	
	5.72x10-3 mmol/l
	H2SO4
	0.42x10-3 mmol/l
	0.21x10-3 mmol/min
	
	
	0.28x10-3 mmol/l
	NaCl
	5.86x10-3 mmol/l
	2.93x10-3 mmol/min
Fuente:Valores obtenidos a partir de práctica realizada en el Laboratorio de Bioquímica UDO-Bolívar.
DISCUSIÓN.
	Numerosos estudios han sido realizados para determinar la importancia de las enzimas en el organismo así como también su importancia en la práctica clínica, en reiterados casos, niveles bajos o altos de ellas indican posibles desordenes del medio interno o anomalías en los diferentes tejidos que constituyen al ser humano. Según el texto Bioquímica de Harper (2017) este indica que: “Lapresencia y el mantenimiento de un conjunto completo y equilibrado de enzimas son esenciales para la desintegración de nutrientes a fin de que proporcionen energía y bloques de construcción químicos; el montaje de esos bloques de construcción hacia proteínas, DNA”. Y no es ninguna novedad que gracias a la enzimas el mundo se conoce tal y como es, estos polímeros muy útiles para la desintegración de nutrientes y a su vez hacen que el metabolismo funcione de una manera adecuada.
La cinética enzimática es el campo de la bioquímica que se encargade la medición cuantitativa de los índices de reacciones catalizadas por enzimas,y del estudio sistemático de factores que afectan estos índices. El análisis cinético puede revelar el númeroy orden de los pasos individuales mediante los cuales las enzimas transforman sustratos en productos. Junto con la mutagénesis dirigida hacia sitio y otras técnicas que sondean la estructura de proteínas, los análisis cinéticos revelan detalles del mecanismo catalítico de una enzima dada. Un conjunto completo y balanceado de actividades enzimáticas tiene importancia fundamental para el mantenimiento de la homeostasis. De este modo, una comprensión de la cinética enzimática es importante para entender de qué modo los estados de estrés fisiológico, como la anoxia, la acidosis o alcalosis metabólica, las toxinas y los agentes farmacológicos afectan ese equilibrio (Harper, 2017).
La participación de las enzimas en casi todos los procesos fisiológicos hace de ellas los mejores objetivos para fármacos que curan o aminoran enfermedad en seres humanos. La cinética enzimática aplicada representa el principal recurso mediante el cual los científicos identifican y caracterizan agentes terapéuticos que inhiben de manera selectiva los índices de procesos catalizados por enzima específicos. De este modo, la cinética enzimática desempeña una función crucial en el descubrimiento de fármacos y en la farmacodinámica comparativa, así como en la dilucidación del modo de acción de los fármacos (Harper, 2017). 
El estudio cuantitativo de la catálisis enzimática, proporciona información sobre las velocidades de reacción, la cual se define como se define como el cambio de la concentración de un reactivo o producto por unidad de tiempo. Los estudios cinéticos también miden la afinidad de las enzimas por los sustratos y por los inhibidores y permiten entrever los mecanismos de reacción. A su vez, la cinética enzimática ayudaa comprender las fuerzas que regulan las vías metabólicas. La velocidad de la reacciónA → P es proporcional a la frecuencia con la que las moléculas que reaccionan forman el producto (McKee, 2014). 
Muchos factores afectan el índice de la reacción. La teoría cinética(también llamada la teoría de la coalición) de cinética química declara que para que dos moléculas reaccionen, deben: 1) aproximarse dentro de la distancia formadora de enlace de la otra, o “chocar”, y 2) poseer suficiente energía cinética para vencer la barrera de energía para alcanzar el estado de transición. Por ende, resulta que cualquier cosa que aumente la frecuencia o energíade colisión entre sustratos aumentará el índice de la reacción en la cual participan (Harper, 2017). 
Junto a la sacarosa y la lactosa, el almidón completa la tríada de carbohidratos quenormalmente hacen parte de la dieta humana. Para ser absorbido a través de la paredintestinal, el almidón debe ser digerido e hidrolizado hasta las unidades de glucosa, lo cual esrealizado gradualmente por lasenzimas digestivas que se hallan en la boca (amilasa salival), yen el intestino delgado (amilasa pancreática, maltasa, isomaltasa y glucamilasa). Laamilasasalival solo cataliza la hidrólisis de las uniones α-1,4 y genera básicamente dextrinas, maltosa,isomaltosa, maltotriosa y eventualmente glucosa libre (Boyer, 2000).
Para visualizar las mejores condiciones que garanticen el óptimo funcionamiento de una enzima, se tendrá que proceder a la evaluación de su actividad catalítica, ya sea midiendo la velocidad inicial de la reacción enzimática en función de uno de los parámetros (concentración del sustrato, de la enzima, variación del pH, temperatura) o determinando la presencia o ausencia de un sustrato o de un producto de la reacción, a medida que se varia uno de los parámetros (Amaris y Lopera, 1995). 
El Efecto de la Concentración de Sustrato, En las reacciones no catalizadas por enzimas la formación de producto depende linealmente de la concentración de sustrato añadido. Mientras que en las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente se obtiene una dependencia hiperbólica de la velocidad respecto a la concentración de sustrato. Principalmente, la velocidad de la reacción o catálisis varía de acuerdo a la concentración del sustrato. Al aumentar la concentración de sustrato, la actividad enzimática aumenta, hasta alcanzar la velocidad máxima, punto donde la enzima se satura, debido a que las enzimas tienen todos sus sitios activos ocupados. En la grafica 1.1 elaborada con los datos obtenidos en la experiencia de laboratorio de la concentración de sustrato se distinguen 3 partes distintas en la curva. En la primera parte, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es proporcional a la concentración de sustrato, de tal manera que si se duplica la concentración de sustrato, se duplica la velocidad (conocido como reacción de primer orden). La segunda parte de la curva, a concentraciones intermedias de sustrato, la velocidad se incrementa, pero no menos que en la primera parte con el incremento de la concentración, iniciando alrededor de la ½ de la Vmax. La última parte de la curva, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad es independiente de la concentración de sustrato (reacción de orden cero), así la velocidad alcanzada es la máxima. Se encuentra saturada y se hace constante en forma lineal.
Para poder saber la velocidad máxima de esta reacción y el Km de esta, se realizo una grafica del inverso reciproco, donde se obtuvo una Vmax para esta reacción de 0,028, calculándolo 1/Vo donde corta en el eje Y. Siendo para el Km igual a -1/-CT que corta en el Eje X, dando como resultado Km: 0,05. En base a esto podemos observar que la velocidad de la reacción es rápida, sin embargo si Km, o la afinidad que esta posee por el sustrato no es tan alta. La amilasa salival tiene una isoenzima, que es la amilasa pancreática que esta tiene un Km por el almidón.
El efecto de la concentración de la enzima, en muchas situaciones, tanto clínicas como científicas, es útil conocer no solo si una enzima esta presente, sino también la cantidad de la enzima. En condiciones apropiadas, la velocidad de una reacción catalizada por enzimas será directamente proporcional a la cantidad d enzima presente. Si se considera la situación en equilibrio puede observarse que la velocidad no siempre es proporcional a concentración de la enzima. Aunque la reacción prosigue, la velocidad de la reacción inversa la iguala. En consecuencia, podría parecer que la velocidad de la reacción es 0, esto es la velocidad neta de reacción es 0, un requerimiento de la condición de equilibrio. No obstante, causando la reacción catalizada enzimáticamente inicia la conversión de uno o más sustratos a un producto [P], no hay P para que ocurra la reacción inversa. A de mas al iniciarse la reacción (hacia adelante), la concentración de S no estaba en absoluto agotada, por lo tanto. Al iniciarse la reacción, es decir, la velocidad inicial (Vo), será directamente proporcional a la velocidad de la enzima [Enz]. 
En la grafica 2, se observo una línea de tendencia que muestra el incremento de la velocidad de la reacción en los tubos, a medida que se fue añadiendo mas enzima, particularmente para esta practica, solo se utilizo un tuvo control ya que era la misma y única enzima de variante, en contrate con sus niveles de concentración. Así que la concentración de la enzima afectara de manera proporcional a la velocidad de la reacción, a mayor concentración de enzima, se aumentara la velocidad de esta, pero para efectos fisiológicos de nuestro organismo, detectar altos niveles de la enzima amilasa en sangre (amilasemia), es un síntoma de alguna patología, como la pancreatitis.
El efecto del pH es el cambio en el estado de ionización de los grupos químicos localizados en el centro activo, puede alterar el reconocimiento del sustrato o la reactividad de los aminoácidos implicados en la catálisis. Según el texto de Bioquímica y Biología Molecular de Lozano (2005) “La actividad catalítica está relacionada con el estado iónico del sitio activo. Los cambios en la concentración de iones hidrógeno pueden afectar a laionización de los grupos del sitio activo”
	Normalmente, la actividad de una enzima es máxima alrededor de un valor de pH determinado, el pH óptimo, en el cual la conformación de la proteína y el estado de ionización de los residuos de aminoácidos del centro activo son idóneos para el reconocimiento y la transformación del sustrato. Éste suele coincidir con el pH del medio fisiológico en el que actúa la enzima, por lo que es altamente variable en alteraciones por encima y por debajo de este valor, la actividad decae, de manera que las representaciones de actividad frente a pH suelen ser acampanadas. Bioquímica de Harper (2017) señala que: “Casi todas las enzimas intracelulares muestran actividad óptima a valores de pH entre 5 y 9. La relación entre actividad y concentración de ion hidrógeno”. 
Aunque unas pocas enzimas toleran cambios importantes de pH, la mayoría son activas sólo dentro de un intervalo estrecho de pH. Por esta razón, los seres vivos emplean amortiguadores para regular rigurosamente el pH. (Lozano, 2005)
	La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Si el pH se vuelve tan alcalino que el grupo pierde su protón, la actividad enzimática puede disminuir. Además, pueden ser afectados los sustratos. Si un sustrato contiene un grupo ionizable, un cambio del pH puede alterar su capacidad para unirse al sitio activo. En segundo lugar, los cambios en los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Los cambios drásticos del pH a menudo provocan desnaturalización. (Lozano, 2005).
	El pH no afecta la actividad de la enzima directamente, sino que modifica la concentración de protones. Por ende, cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son proteínas, puede alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las propiedades catalíticas de la enzima. A pH alto o bajo de producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación.
	En la experiencia del pH se logro apreciar que a concentraciones extremas de pH, ya sea mayor (pH11) o menor (pH3) la enzima amilasa salival se desnaturaliza. Si se encuentra en un valor cercano a ellos puede provocar que se reduzca la velocidad de reacción de la enzima. Mientras que un rango de pH entre 5 y 9, la enzima se encuentra en un pH óptimo para realizar su actividad enzimática, siendo el pH 7.2, en esta ocasión, el punto máximo de la gráfica donde la enzima puede realizar de manera más rápida la actividad enzimática, debido a que es el valor más alto de la velocidad de reacción.
El efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas es complejo, ya que concurren al menos dos factores. Por una parte, como en cualquier reacción química, un incremento de la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción, debido al incremento en el movimiento browniano y a que la energía de las moléculas de los reactivos es mayor. Haciendo que el número de encuentros entre los reactivos aumente y que la proporción de moléculas capaces de salvar la barrera energética del estado de transición sea, también, mayor. Por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima, en valores superiores a esta, la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse (Lozano, 2005). 
Cuando se estudia la acumulación de producto en una reacción enzimática típica, realizada a distintas temperaturas, se obtienen curvas lineales a temperaturas moderadas, en las que la velocidad de desnaturalización de la enzima es baja. A temperaturas altas, la velocidad inicial de aparición del producto es más elevada. Sin embargo, la enzima se desnaturaliza en el medio y a medida que la reacción transcurre, existen cada vez menos moléculas de enzima activa. Por ello, la velocidad de formación del producto decae rápidamente. Es complejo determinar un valor de temperatura óptimo para las enzimas, sin embargo la mayoría funcionan mejor a 37° (temperatura fisiológica) y empiezan a reducir su actividad enzimática. Según el texto de Bioquímica de las Bases Moleculares de la Vida de Mckee (2014): “La temperatura óptima de una enzima, aquella a la que actúa con su máxima eficiencia (se determina en el laboratorio en condiciones específicas de pH, fuerza iónica y concentraciones de solutos. En los seres vivos no hay una única temperatura óptima definible para las enzimas”.
En la gráfica Nº5 correspondiente a esta experiencia es posible apreciar como la amilasa salival trabaja más eficientemente a una temperatura optima que son 37ºC, a temperaturas menores se evidencio que la enzima catalizo la reacción con una velocidad mucho menor, sin embargo al subir la temperatura y luego de sobrepasar los 40ºC esta tuvo un cambio brusco en su actividad, perdiendo su función biológica.
La actividad de las enzimas puede ser inhibida. Las moléculas que reducen la actividadde una enzima, denominadas inhibidores, incluyen muchos fármacos, antibióticos, conservadores alimentarios, venenos y metabolitos de procesos bioquímicos normales (McKee, 2014). En la gráfica Nº6 correspondiente a esta experiencia es posible apreciar el efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimática.El estudio de estas moléculas tiene un gran interés básico y aplicado. En todos los organismos, la activación o inhibición de algunas enzimas clave en las distintas rutas metabólicas contribuye, decisivamente, a la regulación del flujo a través de dichas rutas (Lozano, 2005). 
Se determinó que la acarbosa es un inhibidor reversible y competitivo, teniendo el mismo Vmax pero difiriendo en el Km, este impide que el almidón se una al centro activo de la amilasa salival para ser catalizado en maltosas, dextrinas o glucosas. La acarbosa inhibe a las alfa glucosidasas, dentro de las cuales está la amilasa. Según el texto Bioquímica y Biología Molecular de Lozano (2005) “La velocidad de reacción para una concentración determinada de sustrato y enzima es, entonces, tanto menor cuanto mayor sea la concentración del inhibidor.Sin embargo, a concentración de inhibidor fija, el grado de inhibición disminuye a medida que aumenta la concentración del sustrato. En efecto, si el número de moléculas de sustrato es alto, en comparación con el de inhibidor, la probabilidad de que el centro activo de la enzima esté ocupado por el inhibidor es baja. Sila concentración de sustrato aumenta lo suficiente, acaba por obtenerse la misma velocidad máxima que en ausencia de inhibidor”. 
El ácido sulfúrico es un inhibidor de tipo irreversible; según el texto Bioquímica de Harper (2017): “varios otros inhibidores actúan de manera irreversible al producir modificación química de la enzima. Estas modificaciones por lo general comprenden hacer o romper enlaces covalentes con residuos aminoacilo esenciales para la unión a sustrato, catálisis o mantenimiento de la conformación funcional de la enzima”. Es decir, en este tipo de inhibidores aumentar la cantidad de sustrato no hace que la reacción sea catalizada más rápido, ya que las enzimas se encuentran en complejos enzima-inhibidor, este tipo de inhibidores si afectan la velocidad de reacción y hacen por lo tanto que la enzima pierda su función. La amilasa salival se inactiva al estar en contacto con un medio ácido, cosa que sucede también en el organismo ya que cuando los alimentos llegan al estómago se inactiva dicha enzima para dar lugar a la acción de la amilasa pancreática. 
El ácido clorhídrico es un caso totalmente diferente, ya que recientes descubrimientos dieron a conocer que la α-amilasa contiene Cloro (Cl) en los restos aminoacídicos de su sitio activo, y por ello, al agregar NaCl, los aniones cloruro se unen al sitio activo aumentando la actividad enzimática.Es decir, el cloro actúa como cofactor de la enzima.En la grafica nº6es evidente que en presencia del ácido clorhídrico la enzima alcanza una mayor velocidad de reacción con respecto a las otras sustancias que actuaban como inhibidores, en este ejemplo de un cofactor los aniones cloruro se unen al sitio activo y hace que una mayor cantidad de grupos ionizables estén disponibles para la actividad enzimática, es decir la enzima mejora notablemente su rendimiento y por ende el Km disminuye aumentando la afinidad de la enzima por el sustrato. Se sustenta esto citando el texto de Bioquímica y Biología Molecular de Lozano (2005) que dice que: “Muchas enzimas son proteínas conjugadas, que contienen algún componente de naturaleza no proteica, al que se denomina cofactor. El cofactor suele ser esencial para la catálisis enzimática, y junto a la parte proteica de la enzima o apoenzima, constituye la holoenzima. La naturaleza química de los cofactores es variada: pueden ser iones metálicos (como lasmetaloenzimas), o moléculas orgánicas, llamadas coenzimas”. 
	La inhibición de α-amilasa hace posible que la captación de glucosa post-prandial sea menor por lo que la concentración de esta en plasma es menor, así Inhibidores de glucosidasas en alimentos 9 como el pico máximo post-prandial. Aunque no hay demostraciones de que se dé hipoglucemia, lo que hacen estos inhibidores es que los niveles de glucosa vuelvan a la normalidad en pacientes con alteraciones de estos niveles. De lo que si hay pruebas es que se da una disminución del peso corporal. Esto quiere decir que a parte de los ya antes mencionados, se encuentran otra gran cantidad de inhibidores de α-amilasa, los cuales pueden ser de origen natural o químico. Entre los inhibidores de origen natural encontramos alguno como son: Extracto de judía (Phaseolus vulgaris), extracto de Malpighia emarginata (Aceronidina) y el extracto de Azadirachta indica (Meliacinolina). Es primordial la elección de los inhibidores de origen natural ya que los efectos secundarios y riesgos de estos son menores que los de los inhibidores sintéticos. Además hoy en día la población general prefiere remedios naturales a los fármacos, por lo que es importante saber su forma de actuación. A parte de esto, algunos de estos inhibidores se encuentran en alimentos del día a día, por lo que prescribiendo una dieta en la que dichos elementos estén presenten nos hace ayudar a la población evitando riesgos sin que ellos y los profesionales de la salud se den cuenta. Lo cual nos hace pensar que una dieta variada y equilibrada es una herramienta de prevención (Barrett y col, 2011).
CONCLUSIÓN
En la práctica realizada se ilustraron los distintos factores que alteran la actividad enzimática utilizando como ejemplo a la enzima amilasa salival.
La concentración de sustrato afecta directamente proporcional la actividad enzimática, hasta que llega a la Vmax en condiciones saturantes de sustrato, en la experiencia se obtuvo una Vmax para esta reacción de 0,028 y un Km: 0,05
Pequeñas variaciones en el ph y la temperatura del medio afectan también a la actividad enzimática, cada enzima tiene un ph ´´optimo´´. En la experiencia se se evaluó que el de la amilasa salival es de 7,4 y que su temperatura ideal es de 37ºC, a temperaturas menores la enzima redujo su velocidad de reacción, sin embargo al subir la temperatura y sobrepasar los 40ºC la amilasa se desnaturalizó y perdió su actividad biológica.
Los inhibidores también tienen repercusión en la actividad enzimática, en el caso particular de la amilasa se determinó que el HCL mejora el rendimiento de la enzima debido a que el Cl- es un cofactor de esta, por otra parte el ácido sulfhídrico es un inhibidor irreversible y la ascarbosa uno reversible.
BIBLIOGRAFÍAS. 
Amaris, R. y Lopera, P. 1995. Prácticas de Bioquímica. Universidad de Antioquia. Facultad de Educación. Departamento de Extensión y Educación a Distancia. 
Barrett M.L., Udani J.K. 2011. A proprietary alpha-amylase inhibitor from White bean (Phaseolus vulgaris): A review of clinical studies on weight loss and glycemic control. Nutrition Journal. 
Basanta, M., Cedeño J., Castillo Z., González R., Salazar I., Bermúdez D., Becerra C., et al. 2017. Manual de laboratorio de bioquímica para medicina.
Boyer, R. 2000. Conceptos de Bioquímica. México. International Thomson. 
Lozano J. Galindo J., García-Borrón J., Martínez-Liarte J., Peñafiel R y Solano F. 2005. Bioquímica y Biología Molecular para ciencias de la salud. 3era Edición. Ed. McGraw-Hill.
McKee, T., McKee, J. 2013. Bioquímica. Las bases moleculares de la vida. 5ta Ed. McGraw-Hill.
Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennelly, P. K., Rodwell. V. W.,Weil, P. A., 2017. Bioquímica de Harper Ilustrada. 29 Ed. México D.F., México. McGraw-Hill Interamericana editores, S. A. de C. V.
Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennelly, P. K., Rodwell. V. W.,Weil, P. A., 1987. Bioquímica de Harper. 8va edicion España, Madrid . McGraw-Hill Interamericana editores, S. A. de C. V.