PRACTICA N 12 - BIOQUIMICA

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PRÁCTICA N°12: OXIDACIONES BIOLÓGICAS
Relación de experimentos:
1. Xantino deshidrogenasa de la leche
2. Oxidación del Lactato y succinato por un homogeneizado de músculo cardiaco
OBJETIVOS:
1. Estudiar la oxidación del Succinato y del Lactato por un homogeneizado de músculo
cardiaco
2. Estudiar la necesidad de cofactores y acción de inhibidores.
3. Estudiar la actividad de la xantino deshidrogenasa de la leche.
INTRODUCCIÓN:
Como es sabido, en la membrana mitocondrial interna existe una serie de transportadores de
hidrógeno y/o electrones, que en conjunto se conocen como cadena respiratoria mitocondrial.
Así, diversos sustratos en determinadas vías metabólicas, al oxidarse pierden 2 hidrógenos (2
protones y 2 electrones) por acción de deshidrogenasas ya sea NAD o FAD dependientes,
estableciéndose desde aquí un verdadero proceso de transferencia de hidrógenos y/o
electrones, dando como resultado final la reducción del oxígeno y su conversión en agua y la
consecuente liberación de energía libre que es aprovechada en la formación de ATP.
En el esquema que presentamos, se observan los componentes de la cadena respiratoria
mitocondrial de mamíferos. Se observan también algunos sustratos que al oxidarse, los
protones y / o electrones perdidos en estos procesos son transportados por la cadena
respiratoria. Así mismo, se muestra el sitio de acción de algunos inhibidores, lo mismo que
los lugares donde se genera ATP.
Está bien claro entonces que cuando funciona la cadena respiratoria mitocondrial, hay
consumo de oxígeno. Así en presencia de mitocondrias y los sustratos adecuados, la medida
del consumo de oxígeno es un índice del grado de funcionamiento de la cadena respiratoria
mitocondrial. Sin embargo, la existencia de algunos compuestos que se comportan como
aceptores artificiales de hidrógenos y/o electrones, hacen factible también el estudio de la
oxidación de algunos sustratos oxidables por la cadena respiratoria mitocondrial.
Entre los aceptores artificiales de electrones, se tiene al azul de metileno, metasulfato de
fenazina, al diclorofenol indofenol, entre los más conocidos y que tienen la característica
particular de presentar un color cuando están oxidados y otro cuando son reducidos por algún
intermediario de la cadena respiratoria.
EXPERIMENTO Nº 1.
XANTINO DESHIDROGENASA DE LA LECHE.
- Rotular 4 tubos de ensayo y medir como se señala en el siguiente cuadro:
TUBO 1 2 3 4
Leche cruda 5.0 ml ------ 5.0 ml 5.0 ml
Leche hervida ------ 5.0 ml ------ ------
Uretano 50% ------ ------ 1.5 ml ------
Na CN 0.008 N ------ ------ ------ 0.5 ml
Aldehído fórmico 0.1 M 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml
Azul de metileno 0.001 M 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml
a) Mezclar con cuidado cada uno de los tubos.
b) Cubrir cada tubo con una capa de 1 ml de parafina líquida (o aceite) y colocarlos en
baño maría a 37ºC.
c) Observar el grado de decoloración cada 5 min.
EXPRESIÓN DE RESULTADOS:
Observar el aclaramiento de los tubos cada 5 min. y anotarlo en cruces de acuerdo al
siguiente esquema:
- Tubo permanece azul
+ Ligero aclaramiento
++ Aclaramiento mayor que el anterior
+++ Tubo casi completamente claro
++++ Tubo completamente claro
TUBO Nº 1 2 3 4
Tiempo 0 min. - - - -
Tiempo 5 min. ++ - + ++
Tiempo 10 min. ++++ - + +++
Tiempo 15 min. ++++ - + ++++
Tiempo 20 min. ++++ + + ++++
Tiempo 30 min. ++++ + + ++++
Se puede utilizar más tiempo de lecturas si fuera necesario.
¿En qué tubos se dio la reducción de azul de metileno?
En el tubo 1, que contenía leche cruda y en el tubo 4, que contenía leche cruda y cianuro de
sodio 0.008N.
EXPERIENCIA Nº 2
OXIDACIÓN DEL LACTATO Y SUCCINATO POR UN HOMOGENEIZADO DE
MÚSCULO CARDIACO.
- Rotular 7 tubos de ensayo y medir lo siguiente.
1 2 3 4 5 6 7
Azul de metileno 3 gts. 3 gts. 3 gts. 3 gts. 3gts. 3 gts. 3gts.
Lactato 0.1 M 2 ml. 2ml. ---- ---- ---- ---- ----
Succinato 0.1 M ---- ---- ---- ---- 2 ml. 2 ml. ----
Succinato 0.3 M ---- ---- ---- ---- ---- ---- 2 ml.
NAD 0.1 ml. --- 0.1 ml. ---- ---- ---- ----
Malonato ---- ---- ---- ---- ---- 2 ml. 2 ml.
Agua destilada 1.9 ml. 2.0 ml. 3.9 ml. 4.0 ml. 2.0 ml. ---- ----
Preparación
enzimática de
músculo cardiaco
1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml.
● Mezclar y añadir a cada tubo 1 ml. de parafina líquida (o aceite)
● Incubar en baño maría a 37ºC.
EXPRESIÓN DE RESULTADOS:
TUBO Nº 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo 0 min. - - - - - - -
Tiempo 5 min. ++ - - - ++ - +
Tiempo 10 min. +++ - - - +++ - ++
Tiempo 15 min. ++++ - - - ++++ - +++
Puede utilizarse más tiempo de lectura si fuese necesario.
INTERPRETACIÓN E INTERROGANTES BIOQUÍMICOS
1. Los potenciales redox de los sistemas A y B, son respectivamente, - 0.23 y - 0.32
voltios, indicar ¿cuál es el sistema oxidante y cuál es el reductor?
El sistema B es el agente reductor, puesto que su potencial redox es más negativo al
encontrarse más alejado de cero; mientras que, el sistema A es el agente oxidante, al
encontrarse más cercano a cero.
2. ¿Es necesario agregar NAD para que el lactato se oxide? Sí _X_ No __ ¿Qué
tubo apoya su respuesta?
SÍ es necesario agregar NAD para oxidar lactato, ya que el lactato es el sustrato del
NAD, esto se puede comprobar con el tubo N°1.
3. El lactato se ha oxidado en forma máxima en el tubo Nº _1_. Explique qué es lo
que ha sucedido en dicho tubo:
El lactato se ha oxidado en forma máxima en el tubo N°1, ya que se ha podido oxidar
y entregar sus electrones al NAD con éxito; posteriormente el NAD en su forma
reducida entregó los electrones al Complejo I, el cual se encuentra presente en la
preparación enzimática de músculo cardiaco; y finalmente, el Complejo I, le entregó
los electrones al azul de metileno, reduciéndolo y volviéndolo incoloro.
4. ¿Por qué el aclaramiento del tubo 2 es menor que el del tubo?
Porque le falta agregar el NAD para que haga reacción.
5. Hay aclaramiento en el tubo Nº 3? Sí __ No _ X_ . ¿Por qué?
No, porque solo hay NAD y falta el sustrato que es el lactato.
6. Hay aclaramiento en el tubo Nº 4 ? Sí __ No _X_ . ¿Por qué?
No, porque no tiene ningún sustrato, ni tampoco NAD.
7. ¿Cómo explica Ud. lo sucedido en el tubo Nº 5?
Sí hay aclaramiento, puesto que se encuentran las enzimas del músculo y su sustrato
que es el succinato.
8. Explique que pasó en el tubo Nº 6 . ¿Se aclaró? Sí __ No _X_. ¿Qué función está
cumpliendo el malonato ?
No, porque el malonato tiene la función de ser un inhibidor y el succinato está en la
misma concentración.
9. ¿Qué objeto tiene el Nº 7:
Demostrar que una mayor concentración del sustrato Succinato en presencia del
inhibidor Malonato, puede favorecer la decoloración del colorante azul de metileno,
esto se fundamenta en la Inhibición competitiva.
10. ¿De qué color aparecerán los tubos de no agregar la parafina? ¿Por qué?
El mismo color azul, porque al exponer el azul de metileno al oxígeno del aire causa
su re-oxidación, en consecuencia el aclaramiento será más lento.
11. ¿Por qué el cianuro no inhibe la oxidación del aldehído fórmico en el tubo Nº 4?
Porque el cianuro solo inhibe a nivel del complejo IV, por lo tanto no interviene en la
oxidación del aldehído fórmico.
12. ¿La Xantino deshidrogenasa es una enzima mitocondrial?¿Qué otras fuentes
tisulares podrían usarse en esta experiencia?
La Xantino deshidrogenasa NO es una enzima mitocondrial. Las otras fuentes
tisulares que se podrían usar son:
- Músculo Pulmonar
- Cerebro
- Hígado
13. ¿En el tubo Nº 3 observaría aclaramiento? Si __ No _X_ . ¿Cuál sería la acción
del uretano?
No se observa un aclaramiento porque tiene un inhibidor competitivo que es el
uretano.
14. ¿Cuál es el sustrato natural de la Xantino deshidrogenasa y cuál es su rol
fisiológico?
La xantino deshidrogenasa en química se conoce por su simbología XDH, se refiere a
una enzima catalizadora de xantina, NAD + y agua, obteniendo como productos
NADH, urato y un hidrógeno.
En otras palabras, se refiere a una enzima oxidativa que naturalmente se localiza en elhígado (sólo en estado patológicos cuando hay daño hepatocelular) y es liberada al
torrente sanguíneo. Estas enzimas actúan a nivel del músculo liso, favorecen la
vasodilatación y su rol fisiológico es actuar en la metabolización del ácido úrico.