TAREA CONTROL DE AGUA

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TAREA CONTROL DE AGUA
1. Escriba los fundamentos de Agar plate count
El Plate Count Agar (Agar para Standard Methods), es un medio utilizado para la
enumeración de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales y alimentos. En el
PCA (Plate Count Agar), la Triptona y el Extracto de Levadura suministran las
fuentes de nitrógeno y de vitaminas, que requieren para el crecimiento una basta
variedad de microorganismos, la glucosa actúa como fuente de energía. Se prepara
según la fórmula de la USP y recomendaciones de la APHA (American Public
Health Association) La transparencia del medio y el buen tamaño de las colonias al
crecer facilitan los recuentos bacterianos.1
COMPOSICIÓN POR LITRO DE MEDIO EN AGUA PURIFICADA
➢ Hidrolizado pancreático de caseína (Triptona) → 5.0 g
➢ Extracto de levadura → 2.5 g
➢ Glucosa → 1.0 g
➢ Agar → 15.0 g
➢ pH : 7,0+/- 0,2
2. Escriba los fundamentos de Caldo Rothe
El Caldo Rothe es un medio selectivo para la cuantificación de enterococos
mediante la técnica del Número Más Probable (NMP) en agua, productos
alimenticios y materiales contaminados por aguas residuales.
La presencia de enterococos es un indicador de contaminación fecal en el agua,
especialmente cuando ocurrió hace mucho tiempo y las bacterias coliformes menos
resistentes, pueden estar ya muertas cuando se lleva a cabo el análisis.
● Polipeptona y Glucosa aportan los elementos nutritivos y energéticos.
● Sodio Azida inhibe el crecimiento de los microorganismos Gram negativos y
no afecta el crecimiento de los Enterococos.
● Sodio Cloruro mantiene el nivel salino necesario para el buen crecimiento.
Interpretación de los resultados:
❖ Positivo: Turbidez en el medio de cultivo.
❖ Negativo: El medio permanece límpido.
El crecimiento en este medio de cultivo brinda un diagnóstico presuntivo, y es
necesario realizar pruebas bioquímicas de identificación bacteriana.2
3. Escriba los fundamentos de Agar KF
El agar KF utilizado por Kenner en 1960 para el recuento de estreptococos fecales
en muestras de agua resultó tener un excelente poder de recuperación en
comparación con otros medios utilizados en aquella época. Los autores observaron
que el medio permitió una excelente caracterización de los cocos entéricos, así
como de los microorganismos con propiedades químicas y bioquímicas y
antigénicas similares: Streptococcus bovis y Streptococcus equinus.11
Principios:
● La alta capacidad nutritiva del medio se debe a la presencia de una elevada
proporción de poliptona, extracto de levadura y carbohidratos.
● El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico.
● La lactosa y la maltosa son fuentes de energía para los microorganismos que
pueden utilizarlas.
● La acidificación del medio se manifiesta por el cambio del bromocresol de
púrpura a amarillo.
● La azida sódica inhibe el crecimiento de las bacterias Gram negativas
contaminantes.
● El TTC añadido justo antes de su uso es un indicador del crecimiento
bacteriano. Se reduce a un formazán insoluble dentro de las células. Esta
reacción se visualiza por la aparición de colonias de color rojo a granate.
4. Realice el fundamento y procedimientos de la determinación de
clostridimetría: Recuento de clostridios sulfito reductores
Los procedimientos bacteriológicos de rutina en el análisis de agua incluyen la
determinación de clostridios sulfitos reductores.3 Los anaerobios sulfito reductores
constituyen un grupo asociado a los Clostridium spp. y como tal se caracterizan por
ser organismos Gram positivos, anaerobios, formadores de esporas. Se encuentran
en diversas fuentes ambientales, como suelo, sedimentos marinos, vegetación en
descomposición, intestino humano y de animales, heces, aguas superficiales, como
también en los alimentos, especialmente cuando las condiciones de higiene en la
elaboración son deficientes. Son deteriorantes, ya que producen malos olores y, con
mucha frecuencia, ennegrecimiento del producto cuando este tiene hierro. Estos
microorganismos tienen la capacidad de reducir los sulfitos a sulfuros a partir de
aminoácidos y compuestos azufrados. Estas bacterias se han propuesto como
indicadores de contaminación de alto riesgo del agua.4
La determinación de éstos se basa en el recuento del número de colonias, con
capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un medio específico, incubadas en
condiciones anaeróbicas durante un tiempo y a una temperatura determinada.
Procedimiento:
1. Agitar la muestra vigorosamente para homogeneizar.
2. A partir de la muestra previamente homogeneizada tomar alícuotas de 10 mL
con una pipeta estéril y depositarlas en cada uno de los tubos estériles vacíos.
3. Una vez que estos tubos contienen los 10 mL de agua, mantenerlos en un baño
de agua a 80°C durante 5 minutos a efecto de que se destruyan las formas
vegetativas y permanezcan solamente las formas esporuladas.
4. Retirar y dejar enfriar los tubos.
5. Tomar los tubos con agar SPS a 50°C, rotularlos convenientemente y proceder
a su inoculación profunda, de la siguiente manera:
a. Con una pipeta estéril tomar 5 mL de la muestra de agua e introducirla
hasta el fondo del tubo que contiene el agar.
b. Con mucho cuidado ir depositando el agua a lo largo de todo el tubo
desplazando la pipeta al exterior, procurando que el total de la muestra
quede en el agar y no se airee.
c. Rápidamente pasar el tubo al chorro del agua de la llave para enfriarlo.
d. Después añadir una capa de unos 3 mm de espesor de vaselina o parafina
estéril para conseguir condiciones de anaerobiosis.
e. Este procedimiento se repite con los 3 tubos restantes.
NOTA: Si se sospecha que el agua está muy contaminada, se pueden inocular
5 mL de muestra en un tubo y en los restantes, 5 mL de las diluciones 10-1,
10-2 y 10-3. En caso necesario se puede incrementar el grado de dilución.
6. Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37°C durante 24 h.
7. Transcurrido el período de incubación, contar las colonias de color negro que
aparezcan en los cuatro tubos inoculados.3
CÁLCULOS Y PRESENTACIÓN DE RESULTADOS:
Efectuado el recuento en los tubos correspondientes, el resultado obtenido se
calculará de la siguiente manera:
● Si se han sembrado 20 mL de muestra, es decir, 5 mL en cada uno de los cuatro
tubos, el resultado es directo.
● En caso de haber realizado diluciones, se aplica la siguiente fórmula:
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑙𝑜𝑠𝑡𝑟𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑠𝑢𝑙𝑓𝑖𝑡𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠
20 𝑚𝑙 =
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑚𝑙 × 20
Los resultados se expresarán en:
Número de esporas de clostridios sulfito-reductores: __/20 mL.
5. Describa los pasos para pruebas confirmatorias de:
● Escherichia
Para las pruebas confirmativas se seleccionan las muestras que dieron positivo
a la prueba presuntiva.
1. Se utiliza medio de eosina azul de metileno (EMB) para diferenciar
Escherichia de bacterias Gram negativas mediante la producción de un
brillo metálico verdoso que confirma la presencia de la bacteria
indicadora.
❖ La producción de la indicación de color de las colonias se puede
observar hasta después de 24 horas de incubación a 37ºC mediante la
muestra en asa de los tubos positivos..
La presencia del indicador Escherichia se confirma por la producción de gas y
cambios de color en los medios. Para una confirmación más completa, se
puede realizar una diferenciación mediante pruebas de indol, rojo de metilo,
Voges-Proskauer y citrato de Simmons (IMViC).5
1. Inocular las muestras bacterianas sospechosas en el caldo de preparado.
2. Incubar a 37ºC durante 24 horas de incubación.
3. Para la prueba de indol, agregar unas gotas de reactivo de indol de Kovacs
con la muestra de cultivo incubada.
4. Para la prueba de rojo de metilo, agregue de 6 a 8 gotas de indicador de
rojo de metilo al tubo que contiene el caldo incubado de los organismos
sospechosos.
5. Para la prueba de Voges-Proskauer se añadieron unas gotas de reactivo de
Barritt I y II a los tubos incubados de los tubos sospechosos.6. Para la prueba de citrato de Simmons, se hacen cultivos inclinados con
este agar y se inocula con los organismos de prueba, luego se mantienen en
incubación.6.
● Klebsiella
Las pruebas bioquímicas que se realizan comúnmente en la identificación de
las enterobacterias son los métodos IMViC, y la prueba de agar triple azúcar
hierro (TSI) para encontrar bacterias que produzcan gases y ácidos.
1. La prueba de indol se realiza con Caldo triptona inoculado con cultivo. Las
colonias se incuban a 37°C durante 24 horas y se les administran 1-3 gotas
del reactivo de Kovacs. Se mezcla suavemente en intervalos de 10 a 15
minutos.
2. La prueba de RM se realiza con el indicador de pH rojo de metilo que
permanece rojo a un pH de 4,4 o inferior. Las colonias se inoculan y se
incuban a 37°C durante 24 horas. Luego, se añaden 2-5 gotas del reactivo
rojo de metilo.
3. Para la prueba VP, se transfiere aproximadamente 1/3 de cada cultivo a un
tubo de ensayo vacío, luego se agregan 6 gotas de reactivo de Barrit. Se
incuban todos los tubos durante 24-48 horas a 37°C.
4. Para la prueba de citrato se inoculan inclinaciones de agar citrato de
Simmons por medio de una inoculación por punción y estrías. Se incuban
a 37°C durante 24 horas.7.
1. Para la prueba TSI, las colonias se recogieron y se cultivaron en el medio
TSI.
2. Se inoculó TSI pinchando a través del centro del medio hasta el fondo del
tubo y luego extendiendo sobre la superficie del agar inclinado.
3. Se tapó y se incubó toda la noche a 37°C. Luego se observó la producción
inclinada, a tope, de gas y de H2S.
❖ El resultado se considera positivo si el color de los medios va de rojo
anaranjado a amarillo. Son resultados negativos si los medios se
quedan de color rojo.
❖ La formación de gas se caracteriza por la ruptura del agar provocada
por la formación de CO2.
❖ La formación de H2S se indica mediante depósitos negros.8.
● Citrobacter
Para confirmar la presencia de citrobacters, se incubaron las muestras de agua a
una temperatura de 37 °C durante 24 horas en un medio selectivo. La siembra
de las colonias de Lactosa positiva de Citrobacter freundii, se realiza en agar
MacConkey. En un cultivo de 24 horas, en un ambiente anaeróbico y a una
temperatura de 37°C. Las colonias típicas de Citrobacter spp. que crecen en
agar MacConkey son de color rosa.9
.
❖ Citrato: Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Solo
las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en
este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del
citrato (ácido), generará una fuerte alcalinización del medio que será
aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul
(positivo). La incubación se realiza a 37 ºC durante 24 a 48 horas.
❖ Rojo de Metilo: Se cultiva Citrobacter spp. en caldo RM-VP (medio de
Clark y Lubs) y se incuba a 37 º C durante un periodo 24 a 48 horas.
Pasado este tiempo, se pasa a un tubo inclinado y se le añade unas gotas
(4 a 5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita ligeramente
para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si
vira al rojo y negativa si permanece amarillo.10
● Salmonella
La resiembra se realizó en dos medios selectivos a partir del cultivo obtenido.
Uno de los medios, agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD) y como medio
selectivo complementario se eligió un agar cromógeno de Salmonella (Oxoid).
Los dos se incubaron a 37 ± 1°C durante 24 ± 3 horas.
Después de la incubación se examinan las placas para identificar la presencia
de colonias típicas y se procedió a la identificación. Las colonias típicas de
Salmonella que crecen en el agar XLD son transparentes de color rojizo con o
sin un centro negro y las colonias típicas que crecen en agar cromógeno de
Salmonella son de color rosa-rojo. .
Se seleccionaron cinco colonias sospechosas de Salmonella de cada placa y se
aislaron en placas de agar nutritivo (plate count agar). Finalmente a partir de
una colonia aislada en el agar nutritivo, se realizaron las siguientes pruebas
bioquímicas positivas para Salmonella spp.:
● Rojo de metilo: Para realizarla se utilizó el mismo medio de cultivo, el
caldo rojo de metilo-Voges-Proskauer. Se suspendió el contenido de un
asa de la colonia sospechosa en un tubo estéril que contenía 3 ml de este
y se incubó a 37 ± 1 °C durante 24 ± 3 horas. Se realizó la prueba del
rojo de metilo, la cual tiene como objetivo determinar si se produce
formación de ácidos y para Salmonella debe ser positiva. Para ello se
añadió rojo de metilo, un indicador de pH que actúa entre 4,2 (rojo) y 6,3
(amarillo) y se interpretaron inmediatamente los resultados donde se
consideró un cambio de color a rojo como prueba positiva.
● Citrato: La prueba del citrato se utiliza para determinar si un
microorganismo es capaz de crecer con citrato como única fuente de
carbono. Para ello se utiliza el agar Citrato de Simmons, que contiene
citrato de sodio, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador
de pH. Para realizarla se sembró la superficie en estría, se incubó a 37 ±
1 °C durante 24 horas y después del periodo de incubación se
interpretaron los resultados. Los resultados se consideraron positivos si
el medio había virado a color azul, este sería el caso de posible
Salmonella, y se consideraron negativos si no había virado.11
● Shigella
El caldo Gram negativo y el caldo selenita cistina son recomendados para inhibir
el crecimiento de bacterias Gram positivas y favorecer el crecimiento de
bacterias Gram Negativas que metabolizan manitol y triptosa, tales como
Salmonella spp., y Shigella spp. El tiempo de incubación en estos caldos es de
16 horas.
La temperatura a la cual debe mantenerse el caldo para lograr el máximo
crecimiento de las bacterias es de 35 °C, sin embargo, para favorecer el
desarrollo de Shigella flexneri, algunos autores sugieren que la temperatura ideal
de incubación es de 42 °C.
El caldo Gram negativo, según algunos autores, muestra pobres resultados para
recuperar y permitir el crecimiento de colonias de Shigella sonnei y S. flexneri
estresadas (con soluciones ácidas y picantes).
Como medios de cultivos para las distintas especies de Shigella se emplean
principalmente Agar Salmonella-Shigella (SS), Agar MacConkey. El primero de
ellos es moderadamente selectivo y en él crecen colonias de Shigella incoloras,
convexas y de no más de 4 mm de diámetro.
.
El Agar MacConkey, por su parte, inhibe el crecimiento de las bacterias Gram
positivas y separa las bacterias Gram negativas fermentadoras de las no
fermentadoras. En este medio, las colonias de Shigella muestran una apariencia
semejante a la obtenida en el agar SS.
Otros medios de cultivos empleados para el cultivo de S. flexneri incluyen el
agar entérico de Hektoen (HEA por sus siglas en inglés), Agar XLD (Xylose
Lysine Deoxycholate agar), Agar DCA (Deoxycholate Citrate agar) y el agar
Tergito. (12)
● Proteus
Prueba de la Fenilalanina Desaminasa: Se cultiva el microorganismo en agar
fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inóculo e
incubando durante 24 horas a.37 ºC. Seguidamente se añade 4-5 gotas de la
solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el medio
inclinado. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta
por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.
Prueba de la Ureasa: Esta actividad enzimática es característica de todas las
especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras
enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el
microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se
complementa después del autoclavado con 50 ml/l de urea. Ésta será degradada
por aquellos microorganismos capaces de producir la enzima ureasa. Esta
degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de
amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa. (13)
● Vibrium
Los métodos para la obtención y transporte de las muestras fecales,es
aislamiento primario y la identificación presuntiva en agar selectivo se
incluyen los Apéndices; los cultivos con sospecha de ser V. cholerae se deben
subcultivar en un medio no selectivo, como para la identificación por serología
en lámina y pruebas bioquímicas. Las cepas de V. cholerae requieren de 0,5%
de NaCl para un crecimiento óptimo en medio de agar; algunas formulaciones
comerciales de agar nutriente no contienen sal y no deben utilizarse para el
cultivo de V. cholerae.
➔ Prueba de la cuerda: Utiliza crecimiento fresco de un agar no selectivo
y es útil para excluir las especies que son Vibrios; la prueba de la cuerda
puede desarrollarse en una lámina de vidrio o en una placa plástica de
Petri, suspendiendo un crecimiento de agar infusión de corazón durante
18-24 hrs en una gota de solución acuosa de desoxicolato de sodio al
0,5%.
➔ Agar hierro de Kliger y agar hierro triple azúcar: Es importante que
el agar hierro de Kliger y el agar hierro triple azúcar sean preparados de
manera que los tubos tengan un tope profundo y una cuña larga, si el
tope no es suficientemente profundo se pueden generar reacciones
engañosas en estos medio. Las cuñas de agar AHK o AHTA se inoculan
por punción del tope y estriando la superficie del medio, se incuba las
cuñas a 35-37°C y se examina durante 18-24 hrs. Los resultados
obtenidos indican que
AHK K/A (cuña roja/fondo amarillo),
no produce gas, no H2S.
AHTA A/A (cuña amarilla/fondo
amarillo), no produce gas, no H2S
● Enterobacter
Son bacilos Gram negativos, desdoblan los nitratos a nitritos, fermentan
glucosa, aerobios facultativos y son Oxidasa (-) y Catalasa (+). Pruebas
bioquímicas:16
➢ LIA: Color lila, no tiene inhibidores, su indicador es púrpura de
bromocresol y es sembrado por picadura profunda con aguja y luego por
estrías en el pico.
➢ Citrato de Simmons: Este medio permite comprobar la capacidad de la
bacteria a utilizar el citrato como fuente exclusiva de carbono. La
degradación del citrato conlleva a la alcalinización del medio y del viraje
del indicador azul de bromotimol de verde a azul prusia.
➢ Úrea: En este medio se observa la capacidad de la bacteria de degradar
la urea por medio de la enzima ureasa formando amoniaco y carbonato
de amonio, que alcalinizan el medio.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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