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Importancia de la amplificación del gen E1 del virus Chikugunya
La fiebre de la chikungunya es una enfermedad viral cuyo portador es un mosquito, caracterizado por
fiebre, factor clínico que es muy parecido al dengue. Estas enfermedades son transmitidas, asimismo,
por las mismas especies de mosquito, Ae. aegypti y Ae. ablopictus, y usualmente aparecen juntas en
brotes de casos en lugares como la India. Sin embargo, a diferencia del dengue, la chikungunya no es
mortal y no requiere supervisión clínica. Es por esto que es importante realizar una diferenciación del
virus del chikungunya y el dengue, particularmente en áreas donde el dengue es un problema.
Actualmente, el diagnóstico de chikungunya se realiza mediante pruebas de Hi y pruebas ELISA. La
prueba de ELISA es una prueba que se basa en la reacción de un antígeno de la enfermedad con un
anticuerpo enlazado a una enzima que produce fluorescencia, entonces es importante encontrar un
antígeno adecuado para su diagnóstico.
E1= 44kDa
Durante los años 2006-2008, se analizaron muestras de 151 pacientes y comparados con pruebas
convencionales, y se observaron cambios importantes en la membrana de la glicoproteína E1 que
indicaba a un índice de virulencia más alto.
DIseño de primers (Método del paper)
Para el diseño de primers mediante software Primer-BLAST del NCBI fue realizado de
acuerdo a parámetros anteriormente reportados en otros papers y para el resto de los
parámetros se utilizó los valores predeterminados por el software.
Inicialmente, se utilizó la secuencia obtenida con número de acceso JX142137.1, se
ingresó esta secuencia en la interfaz de Primer-BLAST.
El tiempo de procesamiento del programa para la búsqueda de los primers fue
aproximadamente 72 segundos, al terminar el programa reportó una lista de los primers
encontrados. Posteriormente, el par de primers obtenidos fueron analizados de forma In
silico con los programas correspondientes.
Inicialmente, se analizó el par de primers con Beacon Designer Free Edi-tion, diseñado
para la evaluación de oligos por sus propiedades termodinámicas y estructuras
secundarias. Posteriormente, se analizó la secuencia amplificada con UNAFold, que
permite predecir los plegamientos o hibridación de ácidos nucleicos (Markham & Zuker,
2008).
Los valores fisicoquímicos, los dímeros y horquillas que podrían formar los primers en el
experimento de PCR fueron determinados mediante el software Beacon Designer
Diseño de los primer según el 2do método
● EL gen seleccionado es relativamente corto con 563 pb y, tal como se aprecia en el
sequence text view, solo presenta 1 exón, el cual comienza desde el pb 1. Ya que
comenzó desde el 1 no se pudo tomar un forward antes el exón, por lo que se optó
por tomar un rango desde el primer pb, hasta 20 nucleotidos (o bases?) después de
que terminara el exón, es decir, hasta el 288 pb. Este rango se colocó en el FASTA.
● Se procedió con el Pick Primer, y se cambio los parámetros según lo recomendado
en clase (está resaltado de amarillito en la imagen del ppt 20).
● Ahora, al hacer esto nos dimos cuenta que la página no podía encontrar primer, y
esto fue por un aspecto en la configuración previa, “Primer pair specificity”, lo
automático en dabatase era Refseq mRNA y el organismo el virus, pero no salía, es
por ello que se cambió ese parámetro. en dabatase se cambió a refseq
representative genoma, y en el organismo se dejó tal cual estaba predeterminado.
Los primers obtenidos fueron 10, de los cuales solo 2 se escogieron por su longitud
(el 1 y el 8). Se realizó su analisis en la página de Oligo analizer, y se determinó las
horquillas, homodímeros y heterodímeros que formaría el primer. Lo mismo se hizo
con el 8. Ambos primers tenian caracteristicas similares. Luego se llevó la secuencia
al BLAST y se vió que estos primer secunciarian al virus buscado asi como el gen.
● Sin embargo en el paper no se hizo la variación antes mencionada, si no, que se
cambio el organismo mas no el dabatase, el organismo fue cambiado a homo
sapiens. Se realizó esto también, y de ltodos los primers brindados se escogieron el
2 y el 8 para su analisis ya que tenian mayor longitud. En oligoanaizer se identificó
las horquillas, homodímero y heterodímeros, y en este caso, entre ambos si habia
variaciones. Se llevó la secuencia del forward al BLAST y se vió que, si bien esos
primer secuenciarian genes del virus estudiado, no era del E1 que era lo que
finalmente se buscaba, este se encontraba entre los ultimos de toda la lista. Por ello
se determinó que entre ambos procedimeintos, el cambiar el dabatase fue mejor.
Finalmente se tomó esos primers (1 y 8) y con la página de “reverse complement” se
halló el reverse correspondiente de cada uno.
Conclusiones:
Los primers (o cebadores) son oligonucleótidos de simple hebra de ADN que determinan la
especificidad de la secuencia a amplificarse. Es necesario diseñar cebadores que sean
complementarios a la región molde del ADN.
El tamaño de la imprimación también es muy importante. Los cebadores cortos se utilizan
principalmente para amplificar un fragmento pequeño y simple de ADN. Por otro lado, se
utiliza un cebador largo para amplificar una muestra de ADN genómico eucariótico.
Sin embargo, un cebador no debe ser demasiado largo (cebadores > 30-mer) ni demasiado
corto (Los cebadores cortos producen un producto de amplificación de ADN impreciso e
inespecífico, y los cebadores largos dan como resultado una tasa de hibridación más lenta).
Se debe tener en cuenta que para poder tener buenos resultados debemos:
● Longitud de 18-24 bases
● Es deseable que tengan un contenido de G/C (40 a 60%) o ligeramente superior
● Deben tener una temperatura de desnaturalización (o melting) de entre 50 y 60 C, y
no debe diferir entre ambos en más de 5 C -
El desarrollo informático ha permitido la creación de diversos softwares que facilitan el
diseño de cebadores incrementando la tasa de éxito como PrimerBIast y Primer3Plus
El diseño de primers está siendo extensamente implementado en muchos laboratorios, sean
clínicos o de investigación, logrando reducir costos, también permite tener un control
personalizado y más completo sobre el experimento.
El proposito de la identificación de este gen (E1 codifica una proteína de membrana
conocida por incrementar su habilidad de infección posterior a su mutación) podría ser útil
para emplearlo como marcador genético si inicialmente se realiza una retrotranscripción
puesto que el virus de tipo RNA de cadena sencilla.
Con respecto a los resultados obtenidos, se demostró que el uso de penaltis en el software
Primers3plus resultó una búsqueda más adecuada de cebadores, que posee un equilibrio
entre especificidad y eficiencia para un mejor rendimiento en el ensayo de PCR en tiempo
real. A diferencia del diseño de primers mediante el uso del software Primers3 en el cual se
descubrió la formación de estructuras secundarias, por lo tanto se puede concluir del papper
que los primers obtenidos mediante Primer3Plus son más estables y específicos. Por lo
tanto, emplear el uso de penaltis a los diferentes parámetros permitiría mejorar la calidad de
los cebadores y por ende efectivizar un ensayo de qPCR.
Se realizo dos metodos, metodo facil y el metodo mas largo que es atraves del softwares,
teniendo mejores resultados mediante softwares, las cuales tambien se vieron reflejados en
el papper que se siguio de modelo, en el metodo facil, los resultados no se adecuaban
completamente a las condiciones generales de primers, mientras que en el otro metodo si.