paper circular 3496 para coli

Vista previa del material en texto

Resumen: V-041 
UN I V ER S I D AD N AC I O N AL D E L N O RDES T E 
C om u n i c a c i o n e s C i e n t í f i c a s y T e c n o l ó g i c a s 2 0 0 6 
Escherichia coli productor de toxina Shiga 
en medias reses y carnes molidas bovinas* 
 
Cicuta, María E.
1
 - Deza, Natalia
3
 - Roibón, Walter R.
1
 
Benitez, María C.
1
 - Ramírez, Gabriela V.
4
 - Arzú, R. O.
2
 
 
1.Cátedras de Microbiología - 2. Cátedra de Bromatología (FCV/UNNE), 
Sgto. Cabral 2.139, Corrientes. Tel/Fax 03783- 425753 – 420854, Interno 165. E-mail: cicuta@vet.unne.edu.ar 
3.Servicio Fisiopatogenia , Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, 
Av. Vélez Sarsfield 563 (1281), Buenos Aires.E-mail: ndeza@anlis.gov.ar 
4.SGCYT/UNNE 
 
ANTECEDENTES 
 Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC), es un patógeno emergente transmitido por alimentos, 
asociado a casos esporádicos y a brotes de diarrea con o sin sangre, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico 
(SUH) (Paton & Paton (1998).Desde su identificación como patógeno en 1982, STEC O157:H7 ha ocasionado una 
serie de brotes, especialmente en Canadá, Japón, Reino Unido y Estados Unidos (Bettelheim, 2003; Karmali, 1989). 
Los rumiantes en general, y el ganado vacuno en particular, han sido señalados como los principales reservorios de 
STEC, el ganado ovino es también excretor de estos microorganismos (Padola et al., 2004; Blanco et al., 2004; Gómez 
et al., 2002). Distintos alimentos como carne molida y productos cárnicos crudos o insuficientemente cocidos, 
hamburguesas, embutidos fermentados, lácteos no pasteurizados, mayonesa, jugos de manzana no pasteurizados y 
vegetales tales como lechuga, brotes de soja y alfalfa, entre otros, han sido señalados como fuente de contaminación en 
casos esporádicos o brotes asociados a STEC, la bacteria es resistente a los ácidos y puede sobrevivir en alimentos 
fermentados (Gómez et al., 2002). El ganado vacuno no es un huésped específico de STEC, en heces de animales sanos 
se pueden aislar distintios serotipos de STEC O157 y no-O157 y un mismo animal puede portar más de un serotipo 
(Hussein & Bollinger, 2005). Otras formas de transmisión son: la contaminación cruzada durante la preparación de los 
alimentos, el contacto directo del hombre con animales, y persona a persona, por la ruta fecal-oral, debido a las bajas 
dosis infectivas que posee este grupo bacteriano, ya menos de 100 bacterias por gramo de alimento puede causar 
enfermedad (Paton & Paton, 1998; Karmali, 1989). 
 
 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método selectivo y sensible que amplifica regiones 
específicas de un gen. Para minimizar tiempo y materiales, los cebadores o primers pueden ser combinados en una 
reacción única (PCR múltiple) que puede detectar varios genes en una sola muestra (Watterworth et al., 2005; Paton & 
Paton, 1998). Esta reacción ha significado un considerable avance sobre otros métodos de PCR para identificar STEC y 
la mayoría de sus genes marcadores de virulencia incluyendo las variantes de la toxina Shiga (Osek, 2003). Esta técnica 
ha sido validada por diversos autores (Leotta et al., 2005; Pollard et al., 1990) para el rápido diagnóstico de STEC 
basada en la detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157 para la confirmación de cepas STEC O157 y no- O157 a partir 
de cultivos. El desarrollo de este método ha permitido la identificación simultánea de los tipos enterotoxigénicos 
(ETEC), enteropatogénicos (EPEC), enterohemorrágicos (EHEC) y enteroinvasivos (EIEC) de E. coli (Rappelli et al., 
2001). Con esta técnica y tan sólo 12 horas de enriquecimiento en caldo, un mínimo de 0,5 unidades formadoras de 
colonias (UFC) por gramo de carne molida puede ser detectada (Witham et al, 1996). 
 
Si bien la mayoría de los estudios están orientados a la detección de E. coli O157, en la actualidad aumentaron 
los esfuerzos para detectar los diferentes serotipos de STEC no-O157 (Bettelheim 2000, 2003) .En España (Blanco et 
al., 2003), detectaron 13% de STEC en 455 muestras de carne cruda, aislando 1% de E. coli O157:H7 y 12% de STEC 
no-O157. En Argentina se analizaron 279 muestras de carne, detectándose STEC O157:H7 en 3,8% de muestras de 
carne picada, 4,8% de muestras de chorizo fresco y 3,3% de muestras de chorizo seco (Chinen et al., 2001). En el año 
2003 se pudo establecer por primera vez en Argentina la asociación entre un caso esporádico de SUH y el consumo de 
hamburguesas caseras contaminadas por STEC O157:H7 (Rivas et al., 2003a,b). 
 
Visto que los perfiles de virulencia de Escherichia coli aisladas de hamburguesas y carne molida se 
corresponden con los obtenidos de terneros y bovinos adultos (Parma et al.2000) y Argentina, con 300 casos por año 
de SUH, tiene uno de los valores más altos registrados con una tasa de incidencia de 12,5/100.000 niños menores de 5 
años (López et al., 1997; Gianantonio et al., 1973 y Rivas et al., 1996), el propósito del presente trabajo fue determinar 
la presencia de E. coli productor de toxina Shiga en medias reses bovinas de plantas faenadoras y carnes procesadas en 
lugares de expendio de las mismas, de las provincias de Chaco y Corrientes del nordeste argentino. 
 
 
* Corresponde al PI 20/03: Escherichia coli verotoxigénicas, con especial referencia a O157:H7, en medias reses y 
carne molida bovinas del nordeste argentino(SGCYT/UNNE, Res. N° 638/2003-CS) 
Resumen: V-041 
UN I V ER S I D AD N AC I O N AL D E L N O RDES T E 
C om u n i c a c i o n e s C i e n t í f i c a s y T e c n o l ó g i c a s 2 0 0 6 
MATERIALES y MÉTODOS 
En el período comprendido entre mayo de 2004 y julio de 2006 se analizaron 240 muestras de carne molida y 
147 hisopados de reses bovinas. Cada unidad de carne picada se conformó de acuerdo con la normativa del Servicio 
Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria (SENASA, Circular 3496/2002) de porciones representativas de 
los lotes de producción, de 150 g cada una, de las cuales se pesaron 25 g en 225 ml de caldo tripticasa soya. La 
recolección de los hisopados se realizó mediante el uso de técnicas no destructivas, siguiendo las mismas normas, con 
una plantilla de papel de estraza descartable, que cubrió una superficie de 100 cm
2
 o sea un cuadrado de 10 cm de lado, 
en cuatro zonas: nalga, ijada, pecho y cogote. Se frotó un hisopo embebido en caldo peptonado (0,1%) estéril + cloruro 
de sodio (0,85%), en forma vertical, luego horizontal y por último diagonalmente, cubriendo la totalidad de esa 
superficie. Todas las muestras fueron enriquecidas en agua peptonada con cefixima (Bagó, 0,05 mg/l) a 37°C durante 6 
hs., y posteriormente aisladas en agar MacConkey (Merck). La caracterización de las colonias fermentadoras de lactosa 
se realizó mediante la utilización de citrato de Koser (Oxoid) y la producción de lisina decarboxilasa en agar lisina 
hierro (Britania). Con esta identificación previa se hicieron las pruebas de crecimiento en presencia de telurito de 
potasio, fermentación de sorbitol, y detección de β-glucuronidasa 
11
. 
Los aislamientos de Escherichia coli se enriquecieron en caldo tripticasa de soja (Difco) a 37ºC por 6 hs y 
luego repicados en agar MacConkey sorbitol (SMAC) (Difco). Las placas de SMAC se incubaron a 37°C durante 18-24 
hs. Como tamizaje se realizó la técnica de PCR múltiple de la zona de crecimiento confluente, para detección de los 
genes stx1 y stx2, usando los oligonucleótidos descriptos por Pollard et al. (1990) y el gen rfbO157, usando los 
oligonucleótidos descriptos por Paton & Paton (1998). Los aislamientos stx1 y/o stx2 positivos se identificaron por 
técnicas bioquímicas estándares serotipificaron con antisueros de E.coli O y H (Ørskov & Ørskov, 1984) y 
caracterizaron feno-genotípicamente (Chinen et al., 2001; Rivas et al., 2003a,b) 
Caracterización fenotípica y genotípica de los aislamientos. El gen eae fue detectado porPCR (Karch et al., 
1993); las cepas STEC eae-negativas se analizaron para determinar la presencia del gen saa (Paton & Paton, 1998), el 
gen EHEC-hly se identificaró por PCR (Schmidt et al., 1995) y la hemólisis debida a EHEC-enterohemolisina se 
observaró en placas de agar sangre con glóbulos rojos desfibrinados de oveja. El antibiotipo fue determinado según el 
método de Kirby Bauer para: ácido nalidixico, amikacina, ciprofloxacina, ampicilina, cloranfenicol, colistin, 
estreptomicina, gentamicina, nitrofurantoína, tetraciclina y trimetoprima-sulfametoxazol (NCCLS Standards Methods 
2004). 
Subtipificación de los aislamientos. Las variantes de stx2 se determinaron por análisis de polimorfismo de 
longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de los productos de amplificación obtenidos por PCR de una región de 
la subunidad B de la toxina.(Tyler et al., 1991). 
DISCUSIÓN de RESULTADOS 
Se confirmaron bioquímicamente como Escherichia coli, 190 cepas (Cuadro 1), 134 (70,5%) de las cuales 
fueron aisladas de carnes molidas (n= 240) y 56 (29,4%) de reses bovinas (n= 147). 
Cuadro 1: Caracterización bioquímica de 190 cepas de Escherichia coli aisladas de carnes molidas e hisopados de reses 
bovinas de las provincias de Corrientes y Chaco (mayo 2004 a julio 2006). 
Muestra (aislamientos/n) Sorbita (+) Sorbita (-) Telurito(+)Telurito (-) ββββ+ ββββ- 
Carne molida (134/240) 63 71 120 14 (n=36) 30 6 
Res bovina (56/147) 46 10 55 1 (n=22) 20 2 
 
Referencias: 
Sorbita (+): Fermentación de sorbitol 
Sorbita (-): No fermentación de sorbitol 
Telurito (+): Crecimiento en presencia de telurito de potasio 
Telurito (-): Ausencia de desarrollo en presencia de telurito de potasio 
β+: Presencia de la enzima β-glucuronidasa 
β-: Ausencia de la enzima β-glucuronidasa 
 
Del 55,8% de las carnes molidas (134/240) se aisló E. coli mientras que sólo del 38% (56/147) de las reses. 
Ello fue esperable debido a las normas sanitarias que rigen para la res (lavado con agua potable, frío y desecación de la 
superficie) comparado con el procesamiento de las carnes molidas, donde, al destruir las fascias protectoras, aumenta la 
superficie de contaminanción. 
Una sola cepa aislada de carne molida e identificada como C37a, fue caracterizada como E. coli STEC no-
O157:H7, OR:HNT, stx2vh-a (Figura 1), negativa para los marcadores de virulencia accesorios: eae, EHEC-hlyA y saa, 
fermentadora de sorbitol, β-glucuronidasa positiva, no desarrollando en presencia de telurito de potasio y sensible a 
todos los antibióticos ensayados. Otra cepa proveniente de hisopado de res, referencia R40b, de cinco días de 
Resumen: V-041 
UN I V ER S I D AD N AC I O N AL D E L N O RDES T E 
C om u n i c a c i o n e s C i e n t í f i c a s y T e c n o l ó g i c a s 2 0 0 6 
conservación en cámara fue caracterizada como E. coli O157 (Figura 2), no fermentadora de sorbitol, β glucuronidasa 
positiva y desarrollando en presencia de telurito de potasio. 
stx2 (+)
346 pb (stx2)
259 pb (rfbO157)
130 pb (stx1)
stx2 (+)
346 pb (stx2)
259 pb (rfbO157)
130 pb (stx1)
346 pb (stx2)
259 pb (rfbO157)
130 pb (stx1)
 
 
Figura1. Figura 2. 
Productos de amplificación por PCR para la detección de los genes Productos de amplificación por PCR para la 
stx1, stx2 y rfbO157. Línea 1: E. coli OR:HNT stx2 cepa aislada detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157. 
de carne molida (C37a). Línea 2: control negativo E. coli ATCC Línea 1: E. coli O157, cepa aislada de hisopado 
25922 sin factores de virulencia. Línea 3: control positivo E. coli de res (R40b). Línea 2: control positivo, E. coli 
EDL933 stx1/stx2/rfbO157. Línea 4: control de reactivos (mezcla EDL933 stx1/stx2/rfbO157. Línea3: control de 
sin templado). Línea 5: Amplicón de control positivo reactivos (mezcla sin templado). Línea 4: 
 marcador de tamaño molecular. 
 
CONCLUSIONES 
Debido a que el tipo 2 de toxina Shiga (stx2) es el principal responsable de la falla renal en el SUH, (Wen et 
al. 2006; Brooks et al., 2005) es necesario extremar los controles higiénico-sanitarios de derivados bovinos, en especial 
carne molida, para que no constituyan riesgo en los consumidores. 
Cepas stx2 como la de este trabajo, han sido predominante en varios estudios llevados a cabo en Argentina 
sobre bovinos y sus productos, en especial carnes molidas y hamburguesas (Blanco et al., 2004, Gómez et al. 2002, 
Gioffre et al., 2002) y en Australia (Brett et al. 2003). Sin embargo Mercado et al, (2004), hallaron un 60% de STEC 
no- O157 productoras de toxina Shiga stx1, en 15 cepas aisladas de 12 muestras de materia fecal diarreicas de terneros 
de establecimientos pampeanos argentinos. 
La prevalencia de STEC no-O157 en los Estados Unidos es mayor de lo que se sospechaba, por esta razón, a 
partir de enero de 2002, la American Society for Microbiology Public and Scientific Affairs Board Committee on 
Agriculture and Food Microbiology recommendó al U.S. Department of Agriculture Food Safety and Inspection 
Service (FSIS) la necesidad de incluir los serotipos no-O157 STEC (Parck et al., 2002). 
BIBLIOGRAFÍA 
1- Bettelheim KA. Non O-157 Verotoxin-producing Escherichia coli . A problem, paradox and paradigm. 
Exp. Biology and Medicine. 228: 333 – 344 2003. 
2- Bettelheim KA. Serotypes of verotoxin-producing Escherichia coli reported in the literature apart from 
those belonging to serogroup O157. 
MicroBionet.http://www.microbionet.com.au/frames/feature/vtec/intro.htm 2000. 
3- Blanco M, Padola NL, Kruger A, Sanz ME, Blanco JE, Gonzalez EA, Dahbi G, Mora A, Bernardez MI, 
Etcheverria AI, Arroyo GH, Lucchesi PM, Parma AE, Blanco J. Virulence genes and intimin types of 
Shiga-toxin producing Escherichia coli isolated from cattle and beef products in Argentina. Int 
Microbiol. 7(4):269-76 2004. 
4- Brett KN, Hornitzky MA, Bettelheim KA, Walker MJ, Djordjevic SP. Bovine non-O157 Shiga-toxin 2-
containing Escherichia coli isolates commonly posses stx2-EDL933 and/or stx2vhb subtypes. J Clin 
Microbiol. 41(6):2716-22 2003 
5- Brooks JT, Sowers EG, Wells JG, Greene KD, Griffin PM, Hoekstra RM, Strockbine NA. Non-O157 Shiga-
toxin producing Escherichia coli infections in the United States, 1983-2002. J Infect Dis. 192(8):1422-9 
2005. 
6- Chinen, I.; Tanaro, J.D.; Miliwebsky, E.; Lound, L.H.; Chillemi, G.; Ledri, S.; Baschkier, A.; Scarpin, M.& 
Rivas, M. Isolation and characterization of Escherichia coli O157:H7 from retail meats in Argentina. J. 
Food Prot. 64 (9): 1346 – 51 2001. 
 1 2 3 4 5 
1 2 3 4 
Stx2 
0157 
Stx1 
 
1000pb 
 
400 pb 
300 pb 
200 pb 
100 pb 
 
Resumen: V-041 
UN I V ER S I D AD N AC I O N AL D E L N O RDES T E 
C om u n i c a c i o n e s C i e n t í f i c a s y T e c n o l ó g i c a s 2 0 0 6 
7- Gianantonio, C.A.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Gallo, G.E. & Sojo, E.T. The hemolytic uremic 
syndrome. Nephron, 11: 174-192 1973. 
8- Gioffre A, Meichtri L, Miliwebsky E, Baschkier A, Chillemi G, Romano MI, Sosa Estani S, Cataldi A, 
Rodriguez R, Rivas M.Detection of Shiga toxin Escherichia coli by PCR in cattle in Argentina, 
Evaluation of two procedures. Vet Microbiol. 22;87(4):301-13 2002. 
9- Gómez D, Miliwebsky E, Fernandez Pascua C, Baschkier A, Manfredi E, Zotta M, Nario F, Piquin A, Sanz 
M, Etcheverria A, Padola N, Parma A, Rivas M. Aislamiento y caracterización de Escherichia coli 
productora de verotoxina de hamburguesas congeladas y quesos blandos. Rev Argent Microbiol. 
34(2):66-71 2002. 
10- Hussein HS, Bollinger LM. Prevalence of Shiga toxin-producing Escherichia coli in beef cattle. J Food 
Prot. 68(10):2224-41 2005. 
11- Karch H, Bohm H,Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S, Heesemann J. Clonal structure and pathogenicity of 
Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H7. J. Clin. Microbiol.; 31: 1200-
5 1993. 
12- Karmali, M.A. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli. Clinical Microbiological Reviews 
2, 15–38 1989. 
13- Leotta GA, Chinen I, Epszteyn S, Miliwebsky E, Melamed IC, Motter M, Ferrer M, Marey E, Rivas M. 
Validation of a multiplex PCR for detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli. Rev Argent 
Microbiol. 37(1):1-10 2005. 
14- López, E.L.; Contrini, M.M.; Sanz, M.E.; Viñas, M.R.; Parma, A.R.; De Rosa, M.F. & Cleary, T.G. 
Perspectives on Shiga-like toxin infections in Argentina. J.Food Protect., 60: 1458 - 1462 1997. 
15- Mercado EC, Gioffre A, Rodriguez SM, Cataldi A, Irino K, Elizondo AM, Cipolla AL, Romano MI, Malena 
R, Mendez MA. Non-O157 Shiga-toxin producing Escherichia coli isolated from diarrhoeic calves in 
Argentina J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 51(2):82-8 2004 
16- National Committee for Clinical Laboratory Standards..Performance standards for antimicrobial disk 
susceptibility tests, 8th ed., 24 (1). Approved standard M100-S13. National Committee for Clinical 
Laboratory Standards, Wayne, P.A 2004. 
17- Ørskov F & Ørskov I. Serotyping of Escherichia coli. In T. Bergan (ed), Methods in Microbiology, 
Academic Press, London, 14: 43 – 112 1984. 
18- Osek J. Development of a multiplex PCR approach for the identification of Shiga toxin-producing 
Escherichia coli strains and their major virulence factor genes Journal of Applied Microbiology, 
95(6):1217 2003. 
19- Padola NL, Sanz ME, Blanco JE, Blanco M, Blanco J, Etcheverria AI, Arroyo GH, Usera MA, Parma AE. 
Serotypes and virulence genes of bovine Shigatoxigenic Escherichia coli (STEC) isolated from a feedlot 
in Argentina. Vet Microbiol. 100(1-2):3-9 2004. 
20- Parck CH, Kim HJ & Hixon DL. Importance of testing stool specimens for Shiga toxins. J. Clin. 
Microbiol. 40:3542-3543 . 2002. 
21- Paton, JC & Paton, AW. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli 
infections. Clin. Microbiol. Rev. 11:450-479 1998. 
22- Pollard DR, Johnson WM, Lior H, Tyler SD, Rozee KR. Rapid and specific detection of verotoxin genes 
in Escherichia coli by the polymerase chain reaction. J.Clin.Microbiol. 28: 540-545 1990. 
23- Rivas M, Caletti MG, Chinen I, Refi SM, Roldán CD, Chillemi G, Fiorilli G, Bertolotti A, Aguerre L. 
Home-prepared hamburger and sporadic hemolytic uremic syndrome, Argentina. Emerging Infect. Dis. 
9:1184-1186 2003a. 
24- Rivas M, Sosa Estani S, Rangel J, Caletti MG, Vallés P, Mead P, Griffin P. Risk factors associated with 
Shiga toxin-producing Escherichia coli infections, Argentina. A Case-Control Study. Abstract 5th 
Iternational Symposium and Workshop on Shiga toxin (verocytotoxin) Producing ‘Escherichia coli’ 
infections. Edinburg, (United Kingdom) p. 19 2003b. 
25- Rivas, M.; Voyer, L.E.; Tous, M., de Mena, M.F.; Leardini, N.; Wainsztein, R.; Callejo, R.; Quadri, B.; Corti, 
S.& Prado, V. Verocytotoxin-producing Escherichia coli infection in family members of children with 
hemolytic uremic syndrome. Medicina (Buenos Aires), 56: 119 – 125 1996. 
26- Schmidt, H., L. Beutin, and H. Karch Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of 
Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933. Infect. Immun. 63:1055-1061 1995. 
27- Tyler SD, Johnson WM, Lior H, Wang G, Rozee KR. Identification of verotoxin type 2 variant B subunit 
genes in Escherichia coli by the polymerase chain reaction and restriction fragment length 
polymorphism. J. Clin. Microbiol. 29: 1339-1343 1991. 
28- Watterworth L, Topp E, Schraft H & Leung KT. Multiplex PCR-DNA probe assay for the detection of 
pathogenic Escherichia coli Journal of Microbiological Methods 60, Issue 1:93-105 2005. 
29- Wen SX, Teel LD, Judge NA, O'Brien AD. A plant-based oral vaccine to protect against systemic intoxication 
by Shiga toxin type 2Proc Natl Acad Sci U S A. 103(18):7082-7 2006. 
30- Witham PK, Yamashiro CT, Livak KJ, Batt CA. A PCR-based assay for the detection of Escherichia coli 
Shiga-like toxin genes in ground beef. Appl Environ Microbiol. 62(4):1347-53 1996.