Seminario 5 Tecnicas I BC 2020 Fmed UBA (pdf io)

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SEMINARIOS 5 y 6 
BIOLOGIA CELULAR Y 
MOLECULAR 2020
Técnicas para estudios de 
localización y función de 
proteínas y ácidos 
nucleicos
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
Los objetivos generales de los seminarios 5 y 6 son:
1. Entender que los conocimientos científicos que se estudian en la 
materia “Biología Celular y Molecular” se obtienen mediante la 
realización de trabajos científicos. En estos trabajos se aplican técnicas 
que sirven para resolver las preguntas planteadas.
2. Comprender que para la realización de los trabajos experimentales se 
utilizan distintos modelos experimentales -células procariontes, células 
eucariontes, organismos multicelulares de distintos niveles de 
complejidad (invertebrados, vertebrados)-. 
TÉCNICAS PARA ESTUDIOS DE PROTEINAS Y
 ACIDOS NUCLEICOS : OBJETIVOS GENERALES
 
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
TÉCNICAS PARA ESTUDIOS DE ACIDOS NUCLEICOS
 Y PROTEINAS: OBJETIVOS GENERALES
 
3. Entender que el médico utiliza los conocimientos científicos para 
determinar el diagnóstico y establecer el tratamiento adecuado para 
las personas que le consultan. En este proceso, el equipo de salud 
suele solicitar estudios que le ayudan con dicho propósito. Entre esos 
estudios solicitados, se aplican técnicas bioquímicas, de histología, 
biología celular y molecular.
4. Comprender el fundamento y la utilidad (para la investigación 
científica y para el diagnóstico y el tratamiento de personas) de 
técnicas de detección, cuantificación y determinación de funciones de 
proteínas y ácidos nucleícos.
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Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
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-En los trabajos científicos de biología celular 
y molecular se obtienen resultados 
particulares que pueden generalizarse. 
-El equipo de salud resuelve un caso clínico 
individual utilizando conocimientos generales 
obtenidos mediante los trabajos científicos.
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Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
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Seminario 5: 
Técnicas I
ESTUDIO DE LOCALIZACIÓN Y 
FUNCIÓN DE PROTEÍNAS
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Celular, Embriología y Genética. 
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 TÉCNICAS I
 A-Origen de las muestras a ser analizadas: (1) 
Modelos experimentales (trabajos de 
investigación) y (2) personas que consultan al 
equipo de salud.
 B- Inmunohistoquímica/ Inmunofluorescencia 
 C-Fraccionamiento subcelular. 
 D- Western blot.
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Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
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Esquema conceptual del seminario 5:
 
Biopsia , elementos formes
de la sangre o celulas en cultivo
(conservan la estructura) 
Plasma, tejido homogeneizado, 
fraccionamiento subcelular 
(no conservan la estructura)
 Técnica histológica de rutina
Inmunohistoquímica/fluorescencia
Técnicas de análisis
Estudios bioquímicos 
 Westernblot
Observación
con microscopios
Muestras
TRABAJO CIENTíFICO ------------------------CONSULTA MEDICA
(Modelos experimentales)
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Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
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A1-Modelos experimentales
-Debido a que todos los organismos unicelulares y 
pluricelulares comparten propiedades que se conservaron 
a través de la evolución, los científicos utilizan modelos 
experimentales unicelulares y multicelulares.
Empleando estos modelos experimentales se obtienen 
conocimientos acerca de procesos celulares y moleculares 
que en muchos casos tienen semejanzas básicas con 
procesos que se producen en organismos más complejos, 
como los seres humanos. 
En consecuencia, diversos tipos de células y organismos 
son utilizados como modelos experimentales para 
estudiar diferentes aspectos de la biología celular y 
molecular.
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
LOS SIGUIENTES EJEMPLOS SE 
PRESENTAN SOLO PARA MOSTRAR LA 
VARIEDAD Y UTILIDAD DE LOS 
MODELOS EXPERIMENTALES. NO ES 
OBJETO DE ESTUDIO DE NUESTRA 
MATERIA COMPRENDER LA UTILIDAD 
DE CADA MODELO EXPERIMENTAL.
Célula procarionte
• Escherichia Coli (está habitualmente en el tracto intestinal 
humano). Es un modelo experimental muy útil por su 
simplicidad, para estudiar mecanismos de biología molecular 
Los primeros conocimientos sobre duplicación del ADN, 
transcripción y traducción surgieron empleando este modelo. 
 
 
La célula eucarionte más simple es la levadura. 
Es utilizada como modelo experimental de estudios 
bioquímicos y genéticos. Fue fundamental en los estudios
de la regulación del ciclo celular.
Célula eucarionte
Levadura
Modelos para estudiar organismos 
multicelulares: invertebrados
El nematodo C. Elegans, se utiliza
para estudios de desarrollo y 
diferenciación celular.
La mosca de la fruta, Drosophila 
Melanogaster, modelo para el estudio 
de los mecanismos moleculares del 
desarrollo por su fácil reproducibilidad.
Xenopus laevis, modelo para el 
Estudio del desarrollo embrionario 
Embriones de pollo, modelo para 
estudios de desarrollo embrionario 
por su fácil acceso. Se utilizan en 
la producción de vacunas.
Modelos para estudiar organismos 
multicelulares: vertebrados
Pez cebra, modelo para estudios
genéticos del desarrollo de los vertebrado
El ratón y la rata son los modelos más empleados por ser mamíferos como 
los seres humanos y por su rápida reproducción. La manipulación del 
genoma del ratón constituye una herramienta fundamental en el estudio de 
las funciones de los productos de los distintos genes. 
Rata realizando una
Prueba conductual
Operación cesárea para
Estudiar al feto
Modelos para estudiar organismos 
multicelulares: vertebrados
Ratones transgénicos que expresan
 proteina fluorescente verde. 
Se estudiará en el seminario 6.
Ratón 
 Los estudios científicos de Biología Celular y 
Molecular pueden realizarse a distintos 
niveles de integración y aislamiento de las 
variables a ser analizadas: 
• Estudios in vivo (animales sometidos a 
distintas condiciones experimentales).
• Estudios in vitro (cultivos celulares sometidos 
a distintas condiciones experimentales). 
• Estudios libres de células (componentes 
celulares aislados de su entorno sometidos a 
distintas condiciones experimentales).
Departamento de Histología, Biología Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. Facultad de Medicina, UBA.
Estudios in vivo
Rata realizando una
Prueba conductual
Ratones transgénicos que expresan
 proteina fluorescente verde. 
Se estudiará en el seminario 6.
Cultivos celulares
Estudios in vitro
 Estudios libres de células: 
 Fraccionamiento subcelular 
Conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones 
puras o enriquecidas de un determinado componente celular.
(se desarrollará más adelante durante 
este seminario) 
 A2-Estudios médicos complementarios 
• El equipo de salud puede solicitar estudios 
cuyos resultados informen sobre localización y/
o cuantificación de proteínas y/o ácidos 
nucleicos. Estos estudios pueden tener fines 
diagnósticos o predictivos sobre la evolución 
del paciente y sirven para orientar el 
tratamiento a seguir.
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
-Obtención de las muestras para 
realizar estudios complementarios
-La muestra a ser estudiada puede ser obtenida 
de distintas partes del cuerpo y mediante 
distintos procedimientos.
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Celular, Embriología y Genética. 
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Toma de muestras de sangre (tejido líquido)
-Es la muestra que se toma con mayor frecuencia para 
realizar estudios bioquímicos.
ASPIRADO Y BIOPSIA DE MEDULA OSEA BIOPSIA ENDOSCOPICA DE ESTOMAGO
BIOPSIA EN SACABOCADO DE PIEL
Toma de muestras de otros tejidos 
-Dependiendo de cual sea el tipo de análisis que 
se pretenda realizar de las muestras, éstas 
deben procesarse de distintas maneras.
-Si se pretende obtener información sobre la 
localización de componentes tisulares, celulares 
o de moléculas, debe conservarse la estructura 
del tejido o la ultraestructura de las células para 
observarse al microscopio -distintos tipos de 
microscopio óptico (incluido el microscopio de 
epifluorescencia) o microscopio electrónico-. 
-Si se pretende obtener información acerca de la 
presencia o ausencia o de la cantidad de una 
molécula, las muestras pueden ser procesadas 
sin conservar la estructura de los tejidos o la 
ultraestructura de las células.
Tanto en los trabajos experimentales como 
en los estudios complementarios de 
pacientes, las muestras de tejidos 
Biopsia , elementos formes
de la sangre o celulas en cultivo
(conservan la estructura) 
Plasma, tejido homogeneizado, 
fraccionamiento subcelular 
(no conservan la estructura)
 Técnica histológica de rutina
Inmunohistoquímica/fluorescencia
Técnicas de análisis
Estudios bioquímicos 
 Westernblot
Observación
con microscopios
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Celular, Embriología y Genética. 
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Microscopio óptico Microscopio electrónico
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Celular, Embriología y Genética. 
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Microscopio óptico invertido para observación de cultivos celulares
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Celular, Embriología y Genética. 
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Los anticuerpos como herramientas de investigación
¿Qué son los anticuerpos?
B-D- La inmunocitoquímica y el inmunoblot o 
Westernblot utilizan la reacción antígeno-anticuerpo 
Para reconocer moléculas (proteínas). 
Los anticuerpos como herramientas de investigación
¿Qué son los anticuerpos?
Estructura de un anticuerpo
Los anticuerpos como herramientas de investigación
Generación de anticuerpos policlonales
Los anticuerpos como herramientas de investigación
Generación de anticuerpos policlonales
• Son anticuerpos derivados de diferentes líneas de células B
• En conjunto, reconocen distintos epitopes de un antígeno
Los anticuerpos como herramientas de investigación
Generación de anticuerpos monoclonales
• Son anticuerpos derivados de una única línea de células B y sólo 
reconocen un epitope del antígeno
B-Inmunohistoquímica / Inmunofluorescencia
Utilización de anticuerpos para detectar la localización de proteínas específicas
• Cortes histológicos 
• Células en cultivo
Inmunohistoquímica / Inmunofluorescencia
DAPI → núcleos
α-actina (anticuerpo hecho en ratón)
α-COX IV (anticuerpo hecho en conejo)
Ejemplo: Localización de dos proteínas en células en cultivo
 Ejemplo: Receptores nicotínicos en la unión neuromuscular 
Inmunofluorescencia 
α-receptor nicotínico
Inmunofluorescencia 
α-receptor muscarínico
Inmunohistoquímica / Inmunofluorescencia
 Ejemplo: Índice de proliferación en biopsia de tumor pulmonar
Inmunohistoquímica / Inmunofluorescencia
Inmunohistoquímica 
α-Ki-67
(marcador de proliferación)
C-Fraccionamiento subcelular
Conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones 
puras o enriquecidas de un determinado componente celular.
HÍGADO
RUPTURA MECÁNICA
HOMOGENATO
=
• núcleos
• mitocondrias
• microsomas
• ribosomas
• citosol
ETAPA I : Ruptura mecánica del tejido
Fraccionamiento subcelular
Conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones 
puras o enriquecidas de un determinado componente celular.
HOMOGENATO
ETAPA II : Separación de componentes mediante centrifugación diferencial
La separación de partículas u organelas que no presentan una tendencia a sedimentar 
espontáneamente requiere aumentar la fuerza gravitatoria a través de la centrifugación.
SOBRENADANTE
PELLET
Fraccionamiento subcelular
Conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones 
puras o enriquecidas de un determinado componente celular.
ETAPA II : Separación de componentes mediante centrifugación diferencial
MICROSOMAS
HOMOGENATO
NÚCLEOS MITOCONDRIAS
LISOSOMAS
PEROXISOMAS
CITOSOL
RIBOSOMAS
CENTRIFUGACIONES A VELOCIDADES Y TIEMPOS CRECIENTES
¿Cómo se evalúa la efectividad del procedimiento de 
enriquecimiento/pureza de las fracciones subcelulares?
Fraccionamiento subcelular
Evaluación de la efectividad del método
1- Determinación de actividad enzimática específica de una organela
Fracción Ejemplo de enzima ‘marcadora’
MITOCONDRIAL Citocromo oxidasa
MICROSOMAS Glucosa-6 fosfatasa
CITOSOL Lactato deshidrogenasa
Fraccionamiento subcelular
Evaluación de la efectividad del método
2- Microscopía electrónica de las fracciones subcelulares
FRACCIÓN NUCLEAR FRACCIÓN MICROSOMALFRACCIÓN MITOCONDRIAL
D-Western blot = inmunoblot
Permite determinar los niveles de expresión de una proteína específica en una 
fracción subcelular u homogenato
ETAPA I : SDS-PAGE
Proteínas ya 
corriendo en el 
gel
Fuente de 
poder
Permite determinar los niveles de expresión de una proteína específica en una 
fracción subcelular u homogenato
ETAPA II : TRANSFERENCIA Y REVELADO CON ANTICUERPOS
Western blot
Secuencia del Western blot – Paso 2Secuencia del Western blot – Paso 2
Paso 2 - Transferencia a la membrana de nitrocelulosa:
-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de 
nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas 
Cassette listo para iniciar transferenciaArmado del cassette de transferencia
El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia
Se quitan las burbujas para asegurar
la correcta transferencia
Se detiene la corrida electroforetica
Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar 
el gel con las proteinas separadas por masa
¿Cuál es la localización subcelular de la aromatasa?
TEJIDO 
OVÁRICO
1: HOMOGENATO
2: CITOSOL
3: MICROSOMAS
Western blot
Western blot
Ejemplo:
Biopsias de cuatro tumores de mama: A, B, C, D
A B C D
Limitación de técnicas basadas en el uso de anticuerpos
No siempre hay ‘buenos’ anticuerpos (sensibles y específicos) 
disponibles para la proteína de interés
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Técnicas II
AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS 
Y ESTUDIO DE FUNCIONES DE ACIDOS NUCLEICOS 
Y PROTEINAS
 Preguntas de autoevaluación:
1.Explique por qué pueden utilizarse distintos tipos de organismos como 
modelos experimentales.
2. Explique qué tipo de información puede obtenerse de una biopsia de un tumor 
de piel si se realiza una inmunohistoquímica contra histona H3 fosforilada.
3. Justifique qué técnica utilizaría para detectar la localización (distribución) de
laminina en una biopsia de mucosa de intestino grueso.
4. Se realiza un experimento en un cultivo de fibroblastos de ratón para verificar
el funcionamiento de un ARN de interferencia contra el ARNm del receptor de
insulina. A) Qué técnica utilizaría para evaluar los niveles de expresión de la
proteína del receptor? Qué espera observar en la condición tratada con el ARN
de interferencia? B) Qué técnica utilizaría para evaluar la distribución de esta
proteína en las células? Qué espera observar en la condición tratada con el
ARN de interferencia? Justifique. 
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TécnicasII
AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS 
Y ESTUDIO DE FUNCIONES DE ACIDOS NUCLEICOS 
Y PROTEINAS
 Preguntas de autoevaluación:
 
5. Justifique qué ventaja presenta realizar un Western blot sobre las distintas
 fracciones de un fraccionamiento subcelular respecto de realizarlo sobre 
un homogenato de tejido.
6. Justifique qué técnica utilizaría para detectar la presencia de una proteina
 viral en sangre. Compárela en cuanto a su sensibilidad con técnicas como la 
PCR vista en talleres. Justifique.
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