Biologia-celula-34

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BIOLOGÍA CELULAR20
Localización de secuencias específicas 
en una población de fragmentos de RNA 
(técnica Northern)
Esta técnica es una variante de la anterior, pero aplicada
a la identificación de secuencias de RNA mediante son-
das de RNA, que pueden ser marcadas radiactivamente
o con otros marcadores, como los de tipo quimiolumi-
niscente. El RNA de las células es extraído por el mismo
procedimiento indicado para la obtención del DNA, pe-
ro efectuando el tratamiento final con DNAasa (en vez
de con RNAasa), quedando el RNA. Éste es separado
por electroforesis en un gel de formaldehído-agarosa,
que permite la desnaturalización del RNA y su transfe-
rencia a una membrana de nailon o nitrocelulosa, que
se incuba con la sonda marcada. 
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
Esta técnica tiene como finalidad aislar y amplificar un
determinado fragmento de DNA a partir de una mezcla
compleja de secuencias de DNA. Se basa en la amplifica-
ción de esas secuencias por medio de una enzima poli-
merasa que es estable en condiciones de temperaturas
tan altas como para desnaturalizar el DNA. Para com-
prender cómo se aplica esta técnica es conveniente leer
antes el apartado correspondiente a la replicación del
DNA (véase página 86). 
Tras homogeneizar el tejido, se procede a obtener el
DNA según el procedimiento ya indicado. Este DNA es
incubado junto con los cuatro tipos de desoxinucleótidos
o sus análogos (uno de ellos marcado), la enzima DNA
polimerasa que actúa a temperatura elevada (polimerasa
TAQ) y las dos secuencias de DNA (de 15 a 20 desoxinu-
cleótidos cada una), cuyas bases son complementarias
de los extremos iniciales y finales del fragmento de DNA
que se va a copiar, y que actúan como cebadores especí-
ficos para la replicación de ese fragmento de DNA. Se
utiliza un cebador diferente para cada uno de los dos ex-
tremos del fragmento de DNA porque las dos hebras de
DNA se disponen con direcciones opuestas, y son copia-
das en direcciones opuestas ya que la replicación siem-
pre se realiza en el sentido 5’ → 3’ (Fig. 1.14).
La incubación se somete a unos 30 ciclos de tempe-
ratura. Cada ciclo consta de tres fases, de acuerdo con
los cambios de temperatura: a 85-90 °C el DNA se des-
naturaliza, separándose sus dos hebras; a 50-60 °C los
cebadores se disponen sobre sus secuencias comple-
mentarias en las hebras de DNA; a 72 °C actúa la TAQ
polimerasa, que comienza a copiar las dos cadenas de
DNA. En el primer ciclo se ha obtenido una réplica del
fragmento de DNA. En realidad, la copia obtenida es
de mayor longitud que la del fragmento que se preten-
de amplificar, pues los cebadores marcan el inicio y el
sentido en que la polimerasa irá copiando, pero no el
punto donde se detendrán, ya que la polimerasa se de-
tiene cuando se interrumpa el ciclo. En los ciclos si-
guientes cada una de las copias del fragmento de DNA
es copiada de nuevo, con lo que en cada ciclo se multi-
plica por dos el número de copias. En cada ciclo, la co-
Los procedimientos técnicos concretos seguidos en
el uso de la hibridación de ácidos nucleicos dependen
de la finalidad a la que se aplique el estudio.
Hibridación in situ
En esta técnica la hibridación se realiza in situ sobre célu-
las completas, núcleos o cromosomas, sin necesidad de
aislar previamente el DNA, y se utiliza preferentemente
para localizar un gen o fragmento de DNA. Para poder
realizar la hibridación se procede a la desnaturalización
del DNA (elevando la temperatura hasta 85-90 °C o cam-
biando a valores extremos el pH), con lo que las cadenas
del doble helicoide se separan. Al ir descendiendo la
temperatura o neutralizando el pH se produce la rees-
tructuración del doble helicoide, y la sonda de DNA intro-
ducida se hibrida con el DNA complementario. El marca-
je de la sonda permite visualizar el DNA hibridado.
La hibridación in situ puede también poner de mani-
fiesto la presencia de un gen activo (que transcriba RNA
mensajero) en las células de un tejido. Tras eliminar el
DNA del tejido mediante digestión enzimática con DNAasa,
se añade una sonda de DNA o RNA marcada cuya se-
cuencia es complementaria de la del RNA mensajero que
se pretende localizar, y que se hibridará con éste.
Localización de genes o secuencias específicas
en una población de fragmentos de DNA
(técnica Southern)
El primer paso es el aislamiento del DNA. Tras homoge-
neizar el tejido, se separan los núcleos por centrifuga-
ción y se procede a obtener los ácidos nucleicos. Para
ello, se utilizan diversos procedimientos; el más habi-
tual consiste en usar un detergente (SDS) que lisa los
núcleos y libera su contenido. Mediante tratamiento con
fenol-cloroformo se desnaturalizan las proteínas, que
precipitan por centrifugación, quedando en el sobrena-
dante una fase acuosa entre cuyos componentes están
los ácidos nucleicos. El sobrenadante es sometido a va-
rios ciclos de tratamiento con fenol y centrifugación
hasta eliminar por completo las proteínas. Seguida-
mente el sobrenadante se trata con etanol frío, que pre-
cipita los ácidos nucleicos que pueden separarse del so-
brenadante. La eliminación del ácido nucleico que no
interesa (RNA) se realiza con una enzima específica (la
RNAasa) que lo digiere, quedando el DNA.
El DNA genómico aislado se digiere mediante enzi-
mas de restricción, las cuales fragmentan los dobles heli-
coides de DNA cortándolos por secuencias determina-
das. A continuación, los fragmentos son separados por
electroforesis en un gel de agarosa y se transfieren des-
pués a una membrana de nailon o nitrocelulosa por capi-
laridad. Esta transferencia es necesaria para mantener el
DNA firmemente en su lugar, lo que no ocurriría si se
mantuviera en el gel. A medida que se efectúa la transfe-
rencia se va desnaturalizando el DNA. La membrana con
los fragmentos de cadenas simples de DNA se incuba
con una sonda de DNA o RNA marcada, complementaria
de la del fragmento de DNA que se pretende localizar, y
se produce la hibridación.
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