TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

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TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA CONVENCIONAL
 
BANDAS GTG
Es la técnica de rutina más usada para el estudio de la morfología cromosómica, existen una
enorme cantidad de variantes del protocolo original y esto fue informado por Sumner et al.,
en 1971. Las laminillas son maduradas con el uso de temperatura, se tratan con alguna
proteasa, por ejemplo tripsina o utilizando soluciones salinas, citratos y altas temperaturas
(60-65°C), se tiñen con alguna solución que contenga colorante de Wright o de Leishman y
por último se tiñen con Giemsa, este tratamiento pone en evidencia las regiones claras y
oscuras presentes en los cromosomas que se ha postulado son parte del empaquetamiento
del DNA de los mismos. Es una metodología útil en el diagnóstico de la mayoría de las
alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales.
 
Procedimiento
1. Sumergir las laminillas ya maduradas, en 50 mL de solución de fosfatos (solución
amortiguadora de Sörensen), a la cual se le adiciona 75µL-10µL de tripsina 1:250 de una
concentración 0.01%, la solución de fosfatos se mantene a 37°C, ± 1°C, en baño María.
Mantener la laminilla sin agitación durante 55 a 1.30 segundos, según la calidad de las
metafases y el tiempo de maduración de la laminilla.
2. Sumergir la laminilla en un Koplin que contiene 50 mL de solución isotónica de cloruro
de sodio 0.9%, a temperatura ambiente (TA) durante 12 segundos.
3. Pasar a otro koplin que contiene 50 mL de una solución de colorante de Wright al 20%
en solución amortiguadora de Sörensen, durante 6 a 12 segundos, agitando y teniendo
cuidado de quitar en cada ocasión el espejo que se forma del colorante, esto es con el
objeto de evitar el precipitado del mismo sobre el material a observar; realizar a TA.
4. Pasar inmediatamente a un Koplin con una solución de Giemsa al 8% en solución de
Sörensen durante 2.15 a 3.30 minutos a TA, quitar el espejo que se forme antes de
sumergir la laminilla.
5. Lavar durante 1 minuto en agua destilad a TA y dejar secar.
 
Observar bajo microscopio utilizando el objetivo seco fuerte para ver calidad de bandeo, si
no observamos bandeo, se destiñe la laminilla con alcohol del 70% o solución de Carnoy,
dejar secar al aire e intentar desde el paso 1.
 
BANDAS CBG
Esta técnica con las siglas “CBG”, (bandas C, con hidróxido de bario contrateñidas con
Giemsa) se basa en la desnaturalización y renaturalización del DNA, se emplea una
solución de ácido clorhídrico e hidróxido de bario, seguida de soluciones salinas citratadas
a altas temperaturas, por último la tinción con Giemsa.
Hay muchas variantes a la técnica original informada en 1971 por Arrighi y Shu. Las
bandas “C” tiñen selectivamente la heterocromatina constitutiva alrededor de los
centrómeros y las regiones de heterocromatina polimórfica de los cromosomas 1, 9, 16 y
“Y”. Esta técnica es particularmente útil para investigar rearreglos cromosómicos cercanos
a estas regiones pericentroméricas, polimorfismos y cromosomas marcadores.
Se basa en la desnaturalización y renaturalización del DNA cromosómico. Las laminillas
pueden madurarse según la técnica anterior o utilizarse de inmediato, hay que tener en
cuenta que si son de inmediato, el tiempo de acción de la solución de ácido clorhídrico es
menor.
 
Procedimiento
1. Elaborar 4 laminillas de cada caso, asegúrese que la calidad del material es adecuado.
Sumergir en una solución de ácido clorhídrico al 0.2 N a TA, durante 10 minutos.
2. Enjuagar en tres Koplin con 50 mL de agua destilada cada uno durante 1 minuto, dejar
secar a TA.
3. Introducir las laminillas en 50 mL de una solución hidróxido de bario (BaOH2) 0.2M,
mantenida a 45°C en baño María, durante 30 minutos.
4. Enjuagar en tres Koplin con 50 mL de agua destilada cada uno durante 1 minuto, dejar
secar a TA. Observar que la laminilla no presente el precipitado de la solución de bario.
5. Pasar las laminillas a otro Koplin que contiene una solución de citratos 2X, mantenida a
65°C en un baño María, dejar la laminillas durante 60 a 90 minutos.
6. Lavar en un Koplin con 50 mL de agua destilada durante 1 minuto a TA.
7. Teñir con Giemsa al 8% en solución amortiguadora de Sörensen a TA, iniciar con 5
minutos, enjuagar en agua destilada, observar el contraste de la tinción en el objetivo de
seco fuerte, y si es necesario aumentar el tiempo de tinción en otra laminilla.
 
INTERCAMBIO DE CROMÁTIDAS HERMANAS (ICH)
La frecuencia de intercambio entre cromosomas homólogos en células somáticas puede ser
observada utilizando la técnica de intercambio de cromátidas hermanas ICH.
Los cultivos de linfocitos u otras células son mantenidos durante un ciclo de replicación,
posteriormente se le agrega un análogo de base la bromo deoxi-uridina (BrdU) con el cual
permanecen durante dos ciclos más, se cosecha de la forma habitual y se deja actuar el
colorante fluorescente de Hoeschst, se tratan con una solución salina de Latt, (autor de
dicha metodología en 1974) se exponen a UV y finalmente se tiñen con Giemsa.
Con esta metodología podemos observar en individuos normales la presencia de una
cromátida clara y otra obscura con algunos intercambios en ciertas regiones cromosómicas
(cada laboratorio debe de realizar sus promedios “normales” para su población), un
incremento en la frecuencia de ICH pueden indicar exposición a agentes que dañen al DNA.
 
Procedimiento
Se realizan cultivos de linfocitos de sangre periférica utilizando la técnica de siembra
anteriormente descrita, a las 24 horas de cultivo adicionar en condiciones de esterilidad 80
µL de una solución de BrdU, al 1% en agua destilada, dejar en cultivo durante 48 horas más
a 37°C, cosechar y gotear como se describió anteriormente.
 
1. Introducir 4 laminillas en un vaso de Koplin que contenga 50 mL de una solución de
Hoechst 33258 al 0.005%, durante 1 hora a TA, protegido de la luz.
2. En tres diferentes Koplin que contengan cada uno 50 ml de agua destilada lavar con
agitación durante 1 minuto, a TA.
3. Se exponen las laminillas a la acción de la luz ultravioleta (UV), en un Koplin que
contenga 50 ml de solución amortiguadora de Sörensen, a 37°C, a una altura de 20 cm, de
donde se encuentre la fuente de luz UV, durante una hora. Se puede utilizar también la
luz solar.
4. Lavar las laminillas en un koplin que contenga 50 mL de agua destilada durante 2
minutos con agitación a TA.
5. Teñir las laminillas en una solución de Sörensen -Giemsa al 8%, durante 5 minutos a
TA.
6. Lavar en un koplin con 50 mL de agua destilada, 1 minuto a TA.
 
BANDAS NOR
Goodpasture y Bloom, reportaron en el año de 1975 esta metodología para teñir
selectivamente las regiones organizadoras nucleolares NOR (tinción de plata para las
regiones de organizadores nucleolares), en las regiones NOR se encuentran los genes para
RNA de tipo ribosomal (RNAr) el nitrato de plata tiñe selectivamente estas regiones que
fueron transcritas de manera activa durante la interfase y presentes en cromosomas
condensados en la subsecuente metafase. En el humano los genes para RNAr se encuentran
localizados en los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos, esta metodología es útil
en el estudio de los polimorfismos parentales y para demostrar el origen de cromosomas
marcadores satelitados. Las laminillas se maduran de la manera descrita anteriormente.
 
Procedimiento
1. Sumergir las laminillas en un Koplin que contenga 50 mL de una solución de ácido
sulfúrico 1N durante 7 minutos a TA.
2. Lavar en un Koplin que contenga 50 mL de agua destilada, durante 30 segundos a TA.
3. Dejar secar a TA.
4. Adicionar 100 µL de la mezcla de nitrato de plata en formaldehido, sobre la superficie
de la laminilla poner sobre esta solución un cubreobjetos de 40x50 mm hacer leve presión
para sacar las burbujas, realizar lo anterior con guantes y en una área protegida ya que el
nitrato de plata mancha todo y es difícil de quitar, evitar el exceso de luz ya que la
solución es fotosensible.
5. Colocar la laminilla en una cámara húmeda mantenida a 60°C, regular de antemano esta
temperatura ya que es muy importante, dejaractuar durante 10 minutos.
6. Dejar que se deslice el cubreobjetos poniendo la laminilla de manera vertical, lavar
brevemente en agua destilada, montar con otro cubreobjetos y 100 µL de solución
amortiguadora de Sörensen observar al microscopio bajo objetivo de inmersión.
 
BANDAS Q
Caspersson et al., reportaron en 1970 la primera técnica de bandeo desarrollada para
cromosomas humanos. Su procedimiento es rápido, simple y reproducible. Las laminillas
con el material cromosómico, son introducidas en un recipiente que contenga una solución
de dihidrocloruro de quinacrina o mostaza de quinacrina, la cual se une al DNA y produce
un patrón distintivo de fluorescencia brillante y menos brillante, recuerda el patrón de
bandeo “G”, con excepción de las regiones pericentroméricas de los cromosomas 1, 9 y 16
que se observan débilmente teñidas.
Los satélites de los acrocéntricos y la parte distal del cromosoma “Y” se observan
brillantemente teñidas, las variantes polimórficas de estas regiones pueden ser estudiadas
con el uso de esta técnica. Se preparan laminillas de la forma habitual descrita
anteriormente.
 
Procedimiento
1. Introducir las laminillas en un vaso de Koplin que contenga una solución de mostaza de
quinacrina al 0.5% en agua destilada, durante 20 minutos a TA. La solución se debe
mantener en refrigeración y protegida de la luz, se puede reutilizar durante seis meses.
2. Enjuagar en agua destilada agitando durante 5 minutos a TA, dejar secar protegida de la
luz, poner sobre la laminilla 100 µL de solución amortiguadora de Sörensen.
3. Observar bajo objetivo de inmersión y con la ayuda de la fluorescencia con filtro verde
FITC. Capturar las imágenes y guardarse en la memoria de la computadora ya que la
fluorescencia es muy corta y no permite que se analicen las metafases directamente.
 
REPLICACIÓN TARDÍA “X” Y BANDAS R
Esta metodología produce un patrón de bandeo opuesto al que se presenta por bandeo “G” o
“Q”, ya que las regiones que se observan claras en esas técnicas son vistas como oscuras
por el bandeo “R” y viceversa, las bandas “R” se pueden obtener incubando las laminillas
en soluciones salinas calientes y después teñidas con Giemsa, esta técnica postulada
primero por Dutrillaux y Lejeune en 1971, es usada con mucho éxito, otra metodología
emplea es el colorante fluorescente naranja de acridina, que al intercalarse en el DNA y
excitada por la luz UV de una lámpara de mercurio en un microscopio con fluorescencia,
produce un patrón de bandeo rojo y verde, es muy útil en la investigación de rearreglos que
involucren los telómeros. Por último, empleando un análogo de base como la BrdU, al final
del periodo de de síntesis de ADN y el empleo del colorante fluorescente Hoescht más la
luz UV y soluciones de citratos ponen en evidencia la presencia de estas bandas y a su vez
la replicación tardía del segundo cromosoma “X”.
 
Procedimiento