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Química Biológica PROTEÍNAS II. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS Jefas de Trabajos Prácticos: Dra. Julieta Marino 15) Con una solución de una proteína (concentración 3 mg/mL) se realizan los siguientes procedimientos experimentales: 1 mol -SH ----- 1 mol CMCys PROCEDIMIENTO RESULTADOS 1)Cromatografía de exclusión molecular (CME) en condiciones disociantes y no disociantes 1 pico PM 37.000 2) Proteína + IAA/ urea. Análisis de aminoácidos 0 CMCys/molécula 3) 2,5 mL de solución proteica + β-ME/urea. Luego se agrega IAA 0,81 moles CMCys 4) Proteína SDS-PAGE + 2-ME 2 bandas: PM 10.000 y PM 27.000 5) 2 ml de sol. de prot. + DTT + IAA. Análisis de aminoácidos CME 6) Oxidación perfórmica e isoelectroenfoque 0,324 moles de CMCys 1 pico de 37.000 2 bandas Calcule: a) Número de grupos -SH accesibles e inaccesibles / molécula de proteína. b) Número de puentes -S-S- accesibles e inaccesibles, inter y/o intracatenarios por molécula de proteína. c) Realice un esquema de la probable estructura de la proteína estudiada, indicando si la proteína tiene estructura cuaternaria y la cantidad de cadenas. CMCys/molécula Es necesario expresar los moles de CMCys/ mol de proteína. 1) CEM en condiciones disociantes y no disociantes 1 pico PM 37.000 2) Proteína + IAA/ urea. Análisis de aminoácidos 0 CMCys/ molécula ¿Qué se puede inferir de la estructura de la proteína a partir de estos datos? ¿Tiene estructura cuaternaria? ¿La proteína tiene Cys con SH libres? 3) 2,5 ml de solución proteica + 2-ME/urea 9 M. Luego se agrega IAA. Análisis de aminoácidos 0,81 moles CMCys Como el resultado de las CMCys está expresado en moles, primero es necesario expresar este valor por mol de proteína. Para eso podemos usar el dato de la concentración de proteína (en este caso es 3 mg/mL). En este tratamiento se usaron 2,5 mL, que corresponde a 7,5 mg. Luego, se expresa en moles usando el PM (37.000) 7,5 mg/37.000= 2.10-4 mmoles = 0,2 moles de proteína. 0,2 moles de proteína ------- 0,81 moles de CMCys 1 moles de proteína ------- X= 4 moles CMCys → 4 CMCys / molécula Como se hizo una reducción en medio desnaturalizante, estas Cys pueden ser accesibles o inaccesibles, pero están formando S-S, ya que no hay SH libres 4) Proteína SDS-PAGE + 2-ME 2 bandas: PM 10.000 y PM 27.000 5) 2 ml de sol. de prot. + DTT + IAA. Análisis de aminoácidos CME 6) Oxidación perfórmica e isoelectroenfoque 0,324 moles de CMCys 1 pico de 37.000 2 bandas 2,0 mL de proteína (3 mg/mL) ---- 6 mg 6,0 mg/37.000= 1,6.10-4 mmoles = 0,16 moles de proteína. 0,16 moles de proteína ------- 0,324 moles de CMCys 1 moles de proteína ------- X= 2 CMCys / molécula Como se hizo una reducción y bloqueo sin desnaturalizar, estas Cys son accesibles y forman 1 S-S absortividad/ coeficiente de extinción molar paso de luz (cm) concentración Absorbancia = Determinación de la concetración de proteínas Intensidad de luz incidente (I0) Intensidad de luz transmitida (I) Muestra Detector MonocromadorFuente de iluminación Depende de la muestra y de la ¿El coeficiente de extinción molar depende de la concentración? T= I/I0 A = log I I 0 = log 1 T = - log T Ley de Lambert-Beer Ley de Lambert-Beer Desviaciones de la linealidad ●Monocromaticidad ● Partículas en suspensión ● Cambios en el grado de solvatación, asociación, disociación o ionización cuando varía la concentración de la especie química absorbente ● Fluorescencia ● Temperatura ¿Cómo procedería si la muestra tuviera una Abs en la región de desviación de la curva? Métodos empleados para la determinación de la concentración de proteínas Métodos directos Medida de la absorbancia a 280 nm Medida de la absorbancia a 220 nm Métodos indirectos o colorimétricos Método de Biuret Método de Lowry Método de Bradford Método del acido bicinconínico (BCA) Determinación de la concentración proteica Métodos directos ● Absorción en 280 nm ● Absorción en 220 nm En esta región del espectro electromagnético (260 nm) también absorben los ácidos nucleicos ¿Los métodos directos se pueden usar para muestras de proteínas puras y para mezclas? Medida en UV como detección de proteínas A ct iv it y (● ) A 2 8 0 ( ) Protease B from Debaryomyces hansenii: purification and biochemical properties Int J Food Microbiol 98 (2005) 167– 177 Fig. 1. Chromatograms from different steps in the purification of PrB from D. hansenii. Gel filtration in a Sephacryl S-300 HR column. Protein was detected by measuring the absorbance at 280 nm (dotted line), PrB activity is expressed in fluorescence units (FU) (solid line). A b s 2 2 0 ( )Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 86 (1989) 802-806 FIG. 2. C4 RP-HPLC of BALB/MK mitogenic activity. Determinación de Abs en microvolúmenes Nanodrop 3) Para determinar la concentración de una proteína purificada de hígado se realizó la lectura de la Absorbancia en 280 nm de la muestra diluida 1/3 y se obtuvo la siguiente información: Abs 280 nm = 0,142 280 nm proteína hepática = 39,2 x 10 3 M-1 cm-1 Paso de luz del espectrofotómetro: 1 cm PM: 90.000 Calcule la concentración en M, mM y mg/mL g / L = mg / mL = µg / µL % P/V = masa (g) de soluto en 100 mL M = mol / L = mmol / mL mM = mmol / L = µmol / mL = 10-3 M µM = µmol / L = nmol / mL = 10-6 M nM = nmol / L = pmol / mL = 10-9 M Repaso UNIDADES y EQUIVALENCIAS Ecuación de Lambert-Beer Abs = 280 nm . d . C C = 0,142 / 39,2 x 103 M-1 cm-1 . 1 cm Conc. = 3,6 x10-6 M x 3 (1/dil)= 1,09 x10-5 M → 0,0109 mM 1,09 x10-5 M = 1,09 x10-5 mol/L = 1,09 x10-5 mmol/mL 1mmol ------ 90.000 mg 1,09 x10-5 mmol ------ X= 0,978 mg/mL Determinación de la concentración proteica Métodos indirectos ● Método de Biuret Se basa en la reacción de iones Cu2+ en medio alcalino con compuestos que poseen enlaces peptídicos o amida consecutivos o separados por un átomo de carbono intermedio. Absorbancia 540 nm Sensibilidad del método 0,1 mg/mL Determinación de la concentración proteica Métodos indirectos El método se basa en la reacción de Biuret en la que los enlaces peptídicos reaccionan con el Cu+2 en medio alcalino para producir Cu+. En un segundo paso el Cu+ y los aminoácidos aromáticos Tyr y Trp reducen el reactivo de Folin- Ciocalteu generando un compuesto de molybdeno y tungsteno (azul). La sensibilidad del método es 0,01 mg/ml de proteínas y se usa para un rango de proteínas 0,01–1,0 mg/ml. ● Método de Lowry Determinación de la concentración proteica Métodos indirectos El método se basa en la interacción del colorante Coomassie Blue G-250 con las proteínas a través de uniones iónicas (aminoácidos básicos) e hidrofóbicas con las proteínas. Estas interacciones favorecen la forma aniónica del colorante y producen un cambio en el máximo de absorción del reactivo de 465 a 595 nm. Interfieren detergentes, glicerol, sulfato de amonio, Tris. ¿Cómo solucionaría la presencia de compuestos que interfieren en la lectura? ● Método de Bradford Máximo de absroción 465 nm Combina la reducción en medio alcalino de Cu2+ a Cu1+ por las proteínas con la detección colorimétrica altamente sensible y selectiva del catión Cu1+ por el ácido bicinconínico (100 veces más sensible que el reactivo de Biuret). Determinación de la concentración proteica Métodos indirectos Absorbe en 562 nm ● Método del ácido bicinconínico (BCA) MÉTODO VENTAJA DESVENTAJA UV 280 nm Se recupera la muestra Alta sensibilidad Depende de la composición en aminoácidos Interfieren los compuestos que absorben en el UV Biuret No depende de la composición en aminoácidos Pocas interferencias Baja sensibilidad Interferencias como el sulfato de amonio Lowry Sensibilidad media Depende de la composición en aminoácidos Presenta muchas interferencias (detergentes no iónicos, sulfatode amonio, solventes orgánicos, etc) Bradford Alta sensibilidad Interfieren detergentes BCA Es el más sensible Pocas interferencias Ventajas y desventajas de los diferentes métodos de cuantificación de proteínas Seroalbúmina bovina (BSA) como solución patrón ● Proteína globular Acta Crystallogr D Biol Crystallogr (2012) 68(10):1278-89 ● Heterogeneidad de aminoácidos (PM promedio de aa 110). De esta manera hay igual cantidad de enlaces peptídicos por unidad de masa tanto para la muestra como para la proteína patrón Equivalencia en masa de la proteína patrón y la muestra Al utilizar un método colorimétrico y BSA como solución patrón ¿es posible trabajar en molaridad? PROBLEMA 5 Protocolo de trabajo Tubo (nº) Solución patrón 1 mg/mL (mL) Muestras (mL) H2O (mL) Reactivo de Biuret (mL) Abs 1 540 nm Abs 2 540 nm 1-2 - - 1,0 4,0 0,107 0,100 3-4 0,2 - 0,8 4,0 0,152 0,143 5-6 0,4 - 0,6 4,0 0,210 0,19 7-8 0,6 - 0,4 4,0 0,244 0,258 9-10 0,8 - 0,2 4,0 0,300 0,290 11-12 1,0 - 4,0 0,302 0,310 13-14 - 0,8 0,2 4,0 0,263 0,270 15-16 - 0,5 0,5 4,0 0,180 0,175 Muestra 1 (tubos 13 y 14): Ovoalbúmina Muestra 2 (tubos 15 y 16): Homogenato de hígado de rata (dil 1/5) Se va de la linealidad Abs = 0,243 mg -1 x + 0,102 R 2 = 0,9903 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Masa de BSA (mg) A b s o rb a n c ia 5 4 0 n m y = 1,2163 (mg/ml) -1 x + 0,1021 R 2 = 0,9903 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 0,05 0,1 0,15 0,2 Concentración de BSA (mg/mL) A b s o rb a n c ia 5 4 0 n m 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Concentración de BSA (mg/mL) A b s o rb a n c ia 5 4 0 n m y = 1,0757 (mg/ml) -1 x + 0,1096 R 2 = 0,9705 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Concentración de BSA (mg/mL) A b s o rb a n c ia 5 4 0 n m ¿Qué condición del diseño del experimento permite hacer esta simplificación? Calcule el valor de la concentración proteica a partir de las curvas de calibración realizadas en masa y en concentración ¿La concentraciones obtenidas por ambos gráficos serán iguales o distintas? Planilla de Excel Tubo 15 → Abs = 0,180 → 0,64 mg/mL x 5 = 3,2 mg/mL Tubo 16 → Abs = 0,175 → 0,603 mg/mL x 5 = 3,01 mg/mL Concentración = 3,1 mg/mL Concentración Muestra 2 (homogenato de hígado de rata, dil 1/5) Tubos 15 y 16 ¿Por qué se puede usar un método indirecto para determinar la concentración de muestras puras y de mezclas de proteínas? ¿Los métodos directos se pueden usar para muestras puras y para mezclas de proteínas? Determinación de la concentración de proteínas en microescala Utiliza ~ 20 µl de muestra. Es rápido porque se mide la Abs en lectores de placas. Es decir, se determina la Abs de 96 pocillos en el mismo momento. Curva de calibración Trabajo práctico Parte A Determinar la concentración de una solución de ovoalbúmina y de una muestra de homogenato de hígado por el método de Biuret •Diseñar un protocolo para medir la concentración de proteínas. •Agregar los reactivos en el siguiente orden: agua, BSA, muestras. Por último agregar el reactivo de Biuret a todos los tubos. •Mezclar y esperar 10 min. •Medir la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro. •Representar las curvas de calibración en función de masa y en función de concentración. •Obtener el valor de la concentración de ovoalbúmina y de homogenato de hígado. Parte B Calcular la concentración de ovoalbúmina por un método directo (Absorbancia en 280 nm) •A partir de los valores de absorbancia en 280 nm de 3 muestras de ovoalbúmina, obtener la concentración. Considerar dilución al ¼. Comparar los resultados de la parte B con la concentración de la muestras de ovoalbúmina obtenidas en la parte A, concluir cuál era la muestra recibida e informar su concentración. Tubo (nº) H2O (ml) BSA 2 mg/ml (ml) Solución de ovoalbúmina (ml) Homogenato de hígado de rata (dil 1/20) Reactivo de Biuret (ml) 1-2 - 1,0 3-4 - 1,0 5-6 - 1,0 7-8 - 1,0 9-10 - 1,0 11-12 - 1,0 13-14 0,6 - 0,4 1,0 15-16 0,5 - - 0,5 1,0 Complete el protocolo de trabajo para realizar la curva de calibración y la determinación de la concentración de proteínas de una muestra de ovoalbúimina. * Para la curva de calibración, no superar los 2 mg de BSA. Qué muestras se podrían cuantificar mediante absorción UV en 280 nm: a. Ovoalbúmina b. Homogenato de hígado c. Ambas muestras d. Ninguna de las 2 muestras empleadas
