CULTIVO BACTERIANO

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CULTIVO BACTERIANO 
1\f.ETABOLISMO BACTERIANO 
Las bacterias deben wmar del medio exterior los nutrientes 
necesarios para constnm sus e[e.m.entos constimtivos (citoplasma. 
membrana, par<-"Ó. etc. ) y producir trabajo. Este trabajo está repre­
sentado prJr las funciones vitales, como crecimiento. reproducción, 
movimiento. Lüs nutrientes son el sustrato (sustancia) sobre el 
que actúan enzimas que luego de una serie de reacciones obtiene 
energía en fom1a de ATP. Al conjunto de reacciones enzimáticas 
se lo conoce como ·'metabolis:mo bacteriano". Las reacc.iones de 
biosíntesis (anabolismo) se encadenan a las reacciones de degra­
dación (catabolismo) por el ATP, ya que este compuesto interviene 
en la mayoría de los procesos de intercambio de energía. Según 
la fuente principal. de carbono que utilícen, los microorganismos 
se cia'>ilican en "autótrofos", cuando usan el CO
2 
atmosférico, y · 
"heterótrofos". cuando requieren de fuentes orgánicas de carbono. 
Las bacterias que se han adaptado a crecer en tejidos animales son 
heterótrofas y requieren compuestos orgánicos para vivir. 
La transformación de la energia puede tener lugar aeróbica o 
ana.eróbicamente .. Existen tres vías principales de producción de 
ATP: la respiración , que tiene lugar en presencia de oxígeno y da 
como productos finales CO
2
y H
¡
D; es un proceso de oxidación de 
l as células vivas por el cual el oxígeno en las bacte1ias aerobias es
el aceptar de hidrógeno para el H, ex.traído del sustrato; luego, la
fe.rmenta.cíón, que tiene I ugar sin ·ox íget10 en condiciones anaero­
bias y remp law a éste por otro aceptor de electrones como el nitrato
o el sulfato; y por último, l.a fotosintesis, que obtiene energía por
absorción de luz visible a rravés de ia cl.orofila, pero que no nos 
compete e.n el estudio de la microbiología veterinaria. 
De acuerdo con los requerimientos de oxígeno las ba.cterias 
se clasifican en: 
Bac.terias aerobias estrictas: !as que requieren oxigeno como 
aceptor terminal de ele.ctrones y no proliferan en c.ondíciones 
de anaerobiosis (es decir, en ausencia de oxígeno). Ejemplo: 
Mycobacterium bovis. 
Bacterias anaerobias estrictas: las que no emplean oxí.geno 
para su proliferación y metabolismo, sino que obtienen su 
en.crgia d.e reacciones fermentativas. Las especies de Bacte­
roides y Closiridíum tetani son ejemplos de anaerobios. 
Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia 
ü ausencia de oxígeno, pero la energía la obtienen por fer­
mentación. E_jemplos: algunas especies de C/ost,-idium y las 
bacterias acidolácticas. 
Anaerobios facul.tativos: son bacterias que proliferan mediante 
procesos oxidativos, utilizando oxigeno como aceptor tem1inal 
de electrones, o en anaerobiosis, empleando reacciones de fer­
mentación para obtener energía: sobreviven tanto en condiciones 
aeróbicas como anaeróbicas. Especies de estreptococos, estafilo­
cocos y las enterobacterias (por tj., Escherichía coh) están entre 
los numerosos anaerobios facultativos que causan enfermedad. 
Bacterias microaerófilas: son las que requieren de oxígeno 
como aceptor terminal de electrones pero con una tensión 
menor de <\ a la requerida por l.o-s aerobios, en general de l 
a [ 2% de C\ . No proliferan en la superficie de un medio só­
lido en aire y prol iferan apenas (si lo hac.en) en anae.rc>biosis. 
Algunos estreptococos son microaerófilús . 
Capnoico o capnófilo: se denominan así las bacterias que se 
desarrol.lan mejor en presencia de anhídrido carbónico. 
CULTIVO DE MICROORGANISMOS 
Se. llama cultivo al proceso que consiste en propagar micro­
organismos brindándoles las condiciones ambientales adecuadas. 
Las bacterias adaptadas &l hombre y a los animales tienen la capa­
cidad de desarrollarse en medios nutritivos fuera del hospedador 
(in vitro). Los microorganismos en crecimiento y reproducción 
deben hacer répl i.cas de sí mismos, por lo que necesitan ei aporte 
de todas las sustancias necesarias pa.ra recrear su composición 
química y realizar su metabol ismo . . Los nutrientes deben briri­
darles estos elemen1os en una fórma accesible desde d punto 
de vista metabólico. Además, estos microorganismos re.quieren 
energía metabólica para sintetizar macromoléc.ulas y conservar 
los gradientes químicos esenciales a trnvés de sus membranas. 
DESARROLLO O CRECIMIENTO 
Está dado por la multiplícación bacteriana en el medio de cul­
tivo, con una progresión geométrica :i. velocidad variable, según se 
trate de microorganismos de crecimiento rápido, mediano o l.ento. 
La mayoria de las bacterias poseen un tiempo de división de 20 
minutos, por ejemplo, las enterobacteri.as; en otro extremo, Afrco­
bacterium bovis tiene un tiempo de multipficación de l 2 horas. 
Colonia. 
Cuando una bacteria crece sobre un medio de c.u.ltivo sólido, 
no puede moverse, y al mul tiplicarse en fom1a geométrica, las 
sucesivas generaciones de bacterias quedan ubicadas unas sobre 
otras hasta hacerse. visibles macroscópícamente. Este crecimiento 
o don originado a partir de una sola bacteria en medio sólido se
denomina colonia y presenta aspectos particuiares de acuerdo con 
el género y la especie ba.cteriana; al estudiar sus caracteristicas se 
deben tener en cuenta la forma, e l tamaño, el color; los bordes, la.
altura, la superficie y el aspecto o la consistencia.
Población 
Es el desarrollo bacteriano en medios de cultivo líquidos, 
en donde no pueden diferenciarse entre sí los distintos microor­
ganismos; las características más importantes son : turbidez del 
medio; formación de velo superficial (su consistencia, espesor 
y cantidad) y presencia de sedimento (su aspecto. cantidad y 
coloración). 
CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO 
Las bacterias. como organismos procariolas. se multipl ican por 
fisión binaria. Esteproce;o dura entre I O minutos y 24 lmras, dependien­
do del microc,rganismo� pero la mayoria de. las bacterias de importancia 
tr,ediec üene un ttempo de generación de entre 20 mirmtos y 2 horas-
En cada generación se duphca el número de individuos 
Partiendo de un número injcia] de bae,teria..-: N0• al cabo de una 
ge1.1eradón tendremos 2 x. N0. en la siguieme generadón, :l 2 >: 
'.'L v <1si �ucesivamenre: ía públación aumenta con el exponente 
d� :i, por to que se expresa como -·crecimiento exponencial", 
Primera generación: :2 x N,, 
Si:�andi �l!eneración: 2 x :/ x N .:F x N -· ~ <I <í 
Ter;;er.J generación: 2. x 2 x 2 N0 .t' x !\,, 
Este- crecimiento exponencia.i o Jogarün:!Jco e:xistirí2. en cori� 
.:fü: ione:� ideales si no hubiera agor.amiento de! medio de cuhivo, 
acumulación de metaboiito-s tóxicos. variación de pH� etc. In v ivo 
esto rnmroco ocurre ya que ias deft·nsas del hospedad.or obsra­
e-ulizan el d.esarroHo logaritmico. En eI laboratorio, ia curva de 
trec-imicnto bacteriano puede evaiuarse en medio l íquido. 
Como se trata de un crccimienio exponencial, para obtenet 
en el dibujo una Hnea recta se grafica e l logaritmo del número de 
células viables en función de[ tiempo, Cuando- 1.m cuttivo pum 
de bacterias se inocula a un m.ed.fo de cuhivo Hquido se obtienen 
cuatro fa.ses principales: 
l. Fas� de adaptación o latencia
Este retraso e-s el periodo de adecuación al nuevo medio de 
cultivo y la necesidad de acumular CO� y enzimas pnra iniciar su 
metab-Olismo. Es la demora para alcanzár una velocidad constante 
de desarroUo. Cuando el medio de' cultivo nuevo-es idéntico- ai que 
provienen las bacterias y éstas se encuentran en fase. exponencial, 
esta tase no se produce, 
2. Fase de crecimiento ex.ponencia! o logaritmico
Se inicia cuando ta velocidad de crecimiento constante al�
canz.a su mayor valor. Esta fase está influenciada por la genética 
de la bacteria y las condiciones del medio de cultiv,:,. como pH. 
temperatum1 composición -del medio de cultivo, etc 
3. Fase estacionaria
Como e.t medio at que hacemoi:: referencia no se rt..nueva, co­
mienzan a acumularse metabolitos tóxicos. se modifu:a el pH del me­
dio y desciende el nivel de nutrienw.s, la velocidad demultiplicacíón 
se retrasa y hay un equilibrio entre bacterias vivas y muerias. 
4. Fase de muerte
Cuando continúa el crecimiento en e.! medlo de cultivo viejo se 
produce una inversión numerica con respecto a la fase ex.ponendal 
Bn este período son má..._ las bacterias muerta,; que las vi ·vas, ha....,ta 
que se termlnac:on la muerte de todas. Si setrarade-bac.terias con ca­
pacldad de esporulación,. este fenómeno se produce en esta fase. 
FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE 
EL CRECIMIENTO BAC.'TERlANO 
Temperatura 
Los microorganismos tienen una temperatura óptlma de 
crecimiento en donde adquieren una velocidad máxima de repro­
ducción. Por encima de e.'{fa temperatura máxima las bacterias se 
alteran y mueren. Por debajo de la temperatura óptima las bacterias 
Temper11tura 
re fsse de fat.encia y adapra:oón 
h : fo5,C ¡o-g;;ritruiu de crecimiento 
e. fa.,;:t' de- meseta o e,,;.1:a-cionaria 
d: fase de muerte 
Figura l O� l . Gráfico del cre-etmicnto bact.eri :.:1.n0 nornwl . 
en lentecen su merabohsmo pero siguen crez:iendo. hast:. que :a un.::. 
tempc-rntura rnennr detíen.en sn <le$arrollo. Dé acuerd0 c1;n la tem­
peratura ópúma !ns micmorganismos se clasifican en: psicrófilos. 
con r,mgo$ de entre l O y 20 ''C como ia� bacterias marinas: mcsófi­
los., con tempcramra optima entre 2() y 40 ºC: te.r-mófüos entre 50 y 
60 ºC y termotoierantes con una temperatura óptima en ei rango 
de los mesófüos pem que tolerar. hasta 50 ºC. l..()$ mktoorg:mismos 
que de.."Seribiremos en nuestra materia Sútl mesófüos. adaptados a 
la t�mperatura corporal del hombre y los animales. 
pH 
La mayoria de lo� microorganismos crecen en rangos de. pH 
cercanos a la neutralidad, entre 6,8� 7,4. Muy pocos toleran l& acidez 
o son acidófüos oomo el Acetobí.K1er o HeJicvbacwr: Los ffimgos 
prefieren pH bajos c-<11no 5 o 6. Para mantener ei pH de ios medios
de. cultrvo cuando las bacterias son sensfüles, se requieren &11lf�ts 
como el bicarbonato o los fosfatos inorgánicos. Eí pH éS un factor 
a tener en cuenta para un aislamiento selectivo.
Actividad del agua 
La actividad del agua (A.), o agua disponible.. es fündamenlal 
para las reacciones bioqufmicasde la bacteria. por eso la mayona 
de: íos mkroorganísmot. no crecen en ambientes de hipem:;.molari• 
dad como soluciones azucaradas o hipersaladas, Algunas bacteria& 
de importancia médica resisten las c-0ncentradones airas Je sal 
(Staph,vlococcus)_ Muchas bacterias marinas no crecen cuando 
la concentración de sal es inferior al 1 -010. 
Nutrientes 
La calidad y cantidad de nutrientes disponible$ lnfü:.ye eri h 
velocidad de crecimiento bacteriano y su carencia constituye. un 
fücmr limitante del desarrol lo 
Potencial de oxidorreducción (E.) 
L.as bactenas. aerobias necesitan un F.11-de 0,2 a0.4 y 135 anaerobias 
estrictas de --0,2 o menor. En cultivos líquidos mhros,. las b&:tenas 
aerobia,;; consumen e! O., v crean condici-Ones. para e! desarrollo de lo:­
anaerobios; en cultivo �o de anaerobios se de.ben at:egar agentes 
reductores como tioglicolato. cisreina o ambientes libres de O, . 
CULTIVO DE MICROORGANISMOS 
AEROBIOS IN V1TRO 
Se entiende por medio de cultivo a una me,,da equilibrada 
de componentes nutricionales que reúnen )as condiciones para 
pemmir !a multipl icación in viuo de los gérmenes que a.il í se 
siembran Comiene una fuente de carbono_ nitrógi:.--no y azufre" 
UJ1a fuente mineral, 'l factores de crecimiento que la bact.eria es 
incapaz de sinret!zar como cíert.os aminoácidos, purinas. 
pirl­midinas y vitaminas, Además dUf'.dnte e,l crecimiento ;;e 
deben regular d pH , la temperatura._ la airea:ión, ia 
com,'.emraclón de sal� y la potencia j6ni� del med}o.
Los reqoisitos p:ua que una sustancia sea considerada medw de 
cuírivo deben ser íos siguientes:
• pH: generalmente cercano a la neutral idad {7 .2-7A-?.
" Composición quimica: debe responder a la.-s exigencias
nutricionales del ürganlsmo a cultivar. ;:� 
• Estcrihdnd: ei medio de cu!ti\'O ha de ser e-ste-riíizado para
evitar que lo:- gérmenes que normalmente lo Cúntami:nan
en su prepaídtión no interfieran en el desarroUü de la <.'epa
que pretendemos cultivar.
* Humedad: requisito de todo mediú sóíid0 de reciente pre�
paradón; con el tiempo los· medios se desecan. y se hacen
inaproptados para el de&atToilo bacteriano.
Finalidades de un medio de cultivo 
Aislamiento- de microorganismos en coi(}nfas purd&. 
Estudio de características culturales. 
Estudios de acth,idades metabólicas. 
Preparación de vacunas y antígenos. 
Conservación de gérmenes en colettión. 
Obtención de grandes masat;: microbianas para estudios 
físicos y químicos, 
Obtención de gérmenm con fines industriales (preparación 
de productos lácteos, vitivjnícoias. antibióticos, enzima� 
tlcos y ensilajes). 
MEDIOS DE CULTIVO 
Composición y propiedades 
Los medlos de. cultivo pueden tener una composición química 
definida o no definida. Antiguamente se utilizaban los extractos 
de carne o de ouos tej idos que oonstitufan una fuente de proteínas 
y azúcares, La faita de homogeneidad en la composición y en la 
¡:,replll"JCión, los hacían de esca.sa confiahilídad para ser usados en es­
ludios científicos debido a-las pocas probabilidades de reproducir los 
resultadosob!enidos. Para aportar la fuente de nitrógeno y carbono a 
los medios, en lucrual idad se usan hidrolizados proteicos llamados 
p<ptonas, obte111dos generalmente por hídr6ijs1s enzimática de leche, 
carne, levadura... etc, , que mantienen sus propiedades en cuanto a 
aminoácidos y vitaminas. Existen diferentes tipos y calidades de 
peptonas por lo que debe prestarse atención en su elección, 
El medio también posee cloruro de sodio que tiene como fim­
clón nivelar hl presión osmótica. Si el medio de cultivo requiere 
sangre, ésta se hemoliza sí no hay una presión 01'mótica adecuad.a. 
Un medio de c.ultivn <,ptimo para la investigación microbiológica 
ha de contener, corno minllno� carbono. nitrógeno: azufre
1 
fósforo 
y sales inorgánk:as. En muchos tasos serán necesarias ciertas 
vitaminas y otras sustancias inductoras del credmiemo, Siempre 
han de estar presentes las sustancias adecuadas ¡,ara �iercer de 
donantes o captadores de electrones para las reaccion.es química.'ii 
que tengan lugar. También ios medios pueden tener indicadores 
de cambios de ¡,H en las reaec,ones metabúlicas, 
Una fónnuia básic-a de caldo peptonado es la siguiente: 
Peptona !O g
ClorJro de sodio 5 g
Agua destilada esp. l 000 mi
Para lograr que un medio de cultivo sea shhdo. é- la fónnuh:: 
básica se le agrega un solidJficante. Este puede ser agar sílice, 
gelatina o gel poliacrílico. En la acrualidad se uií!iza el agar que 
es un polisacárido derivado de algas marinas, que. se di�uelve 
a temperatura de ebuHidón y vuelve a soiidificarse a 42 (le Se 
encuentra ya incorporado en los medios de culuvo Cümerc�ies_ 
o puede agregarse a los caldos en una pniporción <le! 2%,
La mayoría de los microorgani..<,.--mos crecen en un p-H cerca.no
a la neutraltdad. por eso � importante verificar el µH del medio 
de cuhívo lue1to de la esteri lización, Para no contammar todo e: 
medio se frac¡iona una pequeña cantldad en un ruho y al final de 
la e&terfüzaeión se roma el pH del medio frnccíona<lo 
La esteril izadón se realiza generalmente: r-fl:r autoclave . va­
por fluente o filtrndón, Para volúmenes de )Oü mi se esteril i1.a z. 
! 2 l ''C durante 1 5 minutos, Se aumenta el liempo para mayore.s
volúmenes. Cuando d medio tiene urea. hidratos de carbono e,
aminoácidos termolábiles, ia temperatura de esterilización se
reduce-, o se usa la film1Clón.
El agregado de suplementos como sangre requ1.ere- técn!Cas 
ssépticas, tanto en la extracción de la sangre como en 1.a moor­
poraclón al me.dio de cultivo. 
Antes de su usü los medios deben controlan.e para verificar 
su esterilidad, incubándolos a 37 "C durante 24 horas . La; placa.< 
de agar sangre no se ineuban porque pierden calidad. s6lo se 
incuban algunas placas representativas del lote durante ] :>emana 
y el resultado seextrapola al total del lote. 
Clasificación de los medios de cultivQ 
Los medios de cultivo pueden clasificarse por su cor..sistencia 
o por su finalidad. Se debe tener en cuenta q.ue dentro de estm,
últlmos, un mismo medio puede ser dasificad-0 en mas de una 
categoría: por ejemplo. el medio EMB es selectivo (impide ei 
crectmiemo de bacterias gram.positivas) y es diferencial (pe,rrni!e
díferencfa.r la activfdad sobre la lactosa ),
Por su consistencia 
Liquido: también denominado caldo, posee elementos nutri� 
úvos esenciales disueltos generalmente en a&_.� destiiadtt-
Semisólido: su consistencia es leve y gela1 i110sa y se obtiene 
agregando agar a! caldo en concentración del O, 7%: también 
se to ctmoe-e como agar blando o agar punción. Se frac-cic�a 
en tubos de hemóiísis para siembra en puntura, 
Sólído: llamado también agar estría y agar duro o placa, ob­
tiene su consistenci.e por el agregado de una mayor cantidad 
de agar al caldo original, por lo general al 2':%, , En cultivc,s 
de rutina, el medlo sólido se fracciona en placas de Pe.tri o en 
tubos en los que e! medio se deja solidificaren piano incii.nado 
en un ángulo de IO' respecto a la horizontal. El resultad" es 
e! "agar en pico de fiauta:". 
Por w finalidad 
Medio de transporte: esm1 medio liquido o semisó!1tki. Pennire 
el mantenimiemo de la muestra clínica sin modificaciones en 
cuanto a caiici.ad y cantidad de microorganismos presentes, hasta 
su procesamirntüen el laboratorio. No tiene nutrientes, Slnú agua,. 
sales y tm amortiguador de pH. Ejemplo: meóio de Stuart. 
Medio de enriquecimiento: es un medio líquido selectivo 
que permite d crecimiento preferencial de clertas bacterias 
patógenas. Se usa cuando la muestra clínica tit:me muchos 
n1krno•\;,an isrnc.s, por :!je:mplo. el ét::.ldo tetrationaJü o cal<lo 
sdenito para materia fecal que se �-mpk:a como medio de en­
riquedm1ento preliminar en el aislamiento de saimonelas. En 
esrc med�o crecen las hac1erias mejor adaptadas y se inhibe -el 
crecimiemo de ias bacterüu; cohformes y de lo$ emerOCOCZ)S-. 
Medio mínimo: contiene la m ínima cantidad de nutri-entes 
1 n<:ctsarios para el desarrollo de !os micrnorganismcs 
Comt'í:n o sim ple: es aquel que reuniendo los elementos 
mirnmos perm ite el de-sarroUo d-e la mayor parte de las hac-
1erias no exigente:.. 
Enriquecido : e� un medio simple con el agregado de $U�1anci:� 
que 1n.imenran ;;u poder nntriüvo ( sangre. suero. extracte- de 
levadura. vitarninas) en proporción Jd J aJ 10° ·6. Esre mtxlio 
5e 1,�:a para b3cterbs exigentei; como cstreptucnco:: o mkopüis­
mas. Nü debe confundirse con medio de enriquecimiento . 
Sdecfrro: es d mr::<lio que- permite :,;elec::-kmar cierto� mi� 
croorganismos frenando ,�l dcsarrolio de otros. Estu �e k;gr::i_ 
con el agregado de susm.ncias. tnhibtdoras .:om(l antih•úticos. 
ciertos colorantes, azida de sodin, sales biliares. etc . Ejem­
plos: medio hípersalado de Chapman para Staphvlococcus 
(contiene' una elevada concentración de cioruro de: sodio 
roportaóa casi exclusivamente púr esta..'i bacterias); d agar 
�angre. con polimixlna B y neomkina usado para aislar a� 
tre.ptococos hemo!lticos del grupo A contiene antibióticos que 
inhiben el desarrnlio de los bacilos gram:negativos. También 
la ie.mpc-rarura de inc:abadón hace t-:;elec.tivo a un medio de 
cuhlv-0, por ejemplo, la U1cuboción a 42 t,C dci agar cetrimlde 
;;ele"c fona Pseudomo».a:; aeru.ginosa. 
Diferencial: es el medio que permite diferenciar bioquímica� 
mente a las bacterias por so actividad mctaoólica. Pogee un 
sustrato. sobre el que actúa o no la bacteria. y esa actividad ::;e 
rc.veia por variación del pH del medio o por algu.nz actividad 
enztmátíca que modifica el aspecto del medio de cultivo. 
Cuando io.s sustrato}: son azúcares o aminoát-idos, el medio 
posee un indicador de pH . De acuerdo con la actividad me� 
tabóHca de la bacteria sobre ese sus-trato, vira o no et pH del 
medio y éste cambia de color o la colonia tiene una coloración 
particular que permite diferenciarla. EJemplü: agar EMB que 
permite ver la actividad bacteriana sobre la lactosa. Otros 
e;iemplos son el agar sangre que evalúa hemofísinas o el. agar 
DNA que determina la producción de DNAsa, etc. 
Especia l : por las su.stancia..c; que lo integran. este medio 
cumple con las exigencias vi tales de detennína<los micro� 
organismo� que únicamente en eHos pueden desarrollar en 
forma óptima 
Preparación de un medio de cultivo comercial 
En ta actualidad, los medios de cultivo -son fórmulas comer­
ciales en polvo adecuados para preparar con el agregado de agua 
destilada. Tarnbién existen medíos líquidos o sóhdm, listos para 
fraccionar o para usar inme-diatamente. 
L-0s med,o• que se expenden c-0mo polvo deshidratado deben 
guardarse a temperatura ambiente al abrigo de la luz y con la 
tapa bien cerrada. Debe regístrarse la fecha de .apertura inicial. 
Se debe leer atentamente el rótulo ya que hay medíos que tienen 
agregados especiales, oomo et medio agar cetrimide al que se le 
agreg:a glicerina. y algunos· no �e esterilizan en autoclave., com<i 
e.t c,gar SS y ei :iektoen.
E! material de vidtw usado en la preparaclón se debe enjuagar 
con agua destilada y secado. Nuncs se debe Henar mas de los 2,-J 
del recipiente para evitar desbordes en el au1od.avad0. L.B etapas 
en la preparación son fas siguientes: 
l ) Pesar Ja cantidad indicada en el prospec.10 de! medie., elegidü 
sobí'e papet afladir agua desrilada. dejar hwnedar y hervir
durante- l rninuto u balkt Maria. nunca a directo. 
2 ) Ajustar e! pH s� fo.era necesario �on OHNa o HCí, frac• 
donar y e.erras con tapa pl2slica 0 -d.e algodim_ El .algüdón 
puede cubrirse cor, una envo-lrurnde papel. nunca con papel 
a luminio ya que &sre nnpide la penetración del var¡or en lá 
e.srerihzacíón por autoclave. 
3 ) EJ ú l timt• paso es ia esterilizadún por autoclave. Debe 
recordase que hay medie:: que no se au-toc!avan. asi comu 
Oay orros e-speciales que por su:; componentes permiten 
tJnjcamente lo fütra.cíón, 
4 l Los med10s de cultivo preparados deben guardarse e.n h..:> 
ladera a 4 °C. Antes de s.u uso se debe dejar que ,;1dqui eran 
la temperatura amb1ente. 
Los siguientes son [os medios de cuhix10 de uso más fw:uente: 
en el laboratorio de microbiología para ínocu !adón primaria, En 
el Apéndice se describe ia composición de los mismos . 
* Agar tripteina soya o agar base sangre o ag.ar infusión
cerehro-c.orn7...ón. Son la base para la preparación del ngar
sangre que a el medio enriquecido por excelencia. Este
medio se funde a baño Maria y cuando alc.:an.7..a 55 <>C ;;e le
agrega sangre. desfihrinada a.! 5- l 00/út a.girando hasta. logra:­
!a: homogeneización total . Se usa sangre de camera que es
la que da mejores resultados en )a visualización de hemó·
Hsts, En casos especiales se usa sangre hamana o de. O"".ras
especies animales. Otra aplicación es en la preparación del
agar chocolare, El agar sangre se-colocanue.vame.1te a bafi.o 
Maria a 80'C y se agira hasta que el color del medio cambia
de rojo a chocolate. No debe dejarse más tiempo ya que i,1 
sangre se ''cona'· y no queda una distribución homogénea,
* Agar CLDE (agar cisteina-lactosa defióe:nte en el_ec-trólí�
tos) (Agar Brolactin de Merck'} Se lo usa príncipalniente.
pana e:1 cultivo de microorganismos pre·sentes en o:lna.
(urocultivo}. Permite el des.arrollo de entembac\eri as,
algunos cocos y levaduras
• Agar EMB (eosin methi!ene l,lue). Es un 111edio diferencial
y selectivo . Es un medio base con lactosa y sacaros� y
tiene como mdicadores azul de meti1eno y eosina; es ideal
para el aisla.miento de enterobacterias y Pseudonumas de
materiales. diversos. No desarrollan S1reptococcu5 y los
Staphylococcus y Emerococcus lo hacen pobremente.
-" Agar SS (Salmonella-Shigella}. Util para coprocuitjvos en 
la lnvestigadón de estos dos microorganismos. El medio 
ín.hibe gran parte de la mkrobiota contaminante presente en 
las heces. Posee lactosa, citrato férrico y citrato de sodio; 
como indicador poseerojo neutrú y como inhibidores de 
los coliformes, verde bri llante y sales biliares. 
oj,t Agar Lo-wenste-in Jenscn. Es uo medio c.on base de huevo, 
selectivo púr el verde de maiaq,uita, usado para aisla.miento 
de rnicobacterias. 
• Caldo rioglicolato. Es un digesto pancreático <le c:,seína
con caldo de soja y glucosa, Ei tiogiicolato reduce el E,.
Crecen la mriyorfa de íos mitroürganism.:is. induidos iós 
anaerobios_ 
* Agar MüHer-Hmton. Destinado a [a prueba de antibjogra­
ma por difusión
Algunos de los medlos más usados para la lipificac1ón bio­
química de las bacterias son: 
* Medía TSI o K ligler- Este medio se denomina trip-!e azúcar
hierro y en su cotnposici6n hay sac:arnsa. glucosa y iactosa.
Pennile detectar ires caracteristic:a.s de k)S microorganis�
mos: la prn<lucción de gas. por fem1enr.aciór1 de azUC�$.
la fennentacíón de la lactosa o lactosa y sac5:wsa. y la
producción de suifurc, de: hkirógeno gaseoso. Es ru: medio
diferencrnf que pemlite fa tipificación bioquimica de los
bacíios gramnegativos. y se- usa fundame-ntaimeníe en ia
diJerendación de enlerobacterias.
* l\.fedio BAM (Buenos Aire½ modificado-). Es un medio
semis:ól ido que pennhe ver si el mkroo:rg-ánismü produce:
la enzima ureasa y si es o no móvil
* Medio bilis esculina. Es un medlu que pe-rnütc <lifcrenc.ia­
cütr los esrrep1.ococos de los enterococos. En este medio el
en:t.erococo transforma la esculina en esculetina y el medio
adquiere una pigmentación negruzca.
En el capítulo de identificach)n bioqu.ím•ca de los microor­
ganismos se describen otros medios. 
AISLA.MIENTO 
Proceso o conjunto de métodos que deben aplicarse ¡,ara 
conseguir bacterias en cuhivo puro, separando las bacterias que 
se desea estudiar de los microorgamsmos contaminantes: se 
realiza en medios sólidos. El ais]am1ento y crecimiento inicial 
de microorganismo..� de un espécimen cHoko se conoce como 
aislamiento primario. 
Métodos generales de aislamiento 
baeteriano en un medio sólido 
Diseminación e11 u11a placa 
El medio de cultivo sólido elegido se debe fundir en baño 
María hirviente, dejar e.nfriar a ± 45 1)C y volcar en placa de Petri, 
y dejar sohdifi.c.ar. Para evar1orar e¡ exceso de humedad del medio, 
se coloca la placa en e.stufa de cultivo a 37 ºC boca abajo, 24 
horas. No hay necesidad de al>rir las placas. Esto permite también 
hacer un control de esterilidad del medio. 
Para ei aislamiento se puede oolocar una ansada de la muestra 
en estudio (materia fecaL orina, saugre, esputo, etc,) e.p un punto 
periférico de la placa, y con el ansa, trazar una estrfa apretada 
de poca extensión; quemar y enfriar el ansa, Si la muestra es 
un hisopado. colocar el hisopo en un punto periférico e hisopar 
apretadamente, luego continuar con el ansa. 
Par,d realizar ia primera siemhra ciega\ la placa se gira en el 
sentido conrr:ario de las agujas del reloj y se arrastra material de 
la estría primaria al medio sin sembrar, en fonua perpe.ndlcular; 
,quemar y enfriar nuevamente el ansa. 
Seguido de una segunda siembra ciega, se gira nuevamente 
ia placa arrastrn.ndo material de la segunda estría al tnedio nuevo 
en forma perpendkula,. 
Girando finalmente- por tetcera vez. la placat sin esterilíz.ar 
el ansa, trazar una estría fin;.! de agotamiento en e! medio sin 
sembrar e incubar, 
f..r, '.'SLl '<!trd. f¡¡¡(\t¡j \.1'1 gtM; 
t\út>&:ru & b:ltter.ruc q1u ¾' 
-0Í:iH\1Íl\iWlfl iut'JtL 
....-,,--., 
A�,{ 5C i,r.cvrnlr,111 
eOiooiE iúd1vffluá!tt 
figura Mérodo de diseminación en uno placa. 
Al quemar el ansa el número de colonias disminuirá de la 
primera a la última estria, permitiendo eJ aislamiento buscado. 
Diseminación en varias placas 
Se usan varias placas con medio sól ido. Colocar en un ex­
tremo de la placa ia muestra cUnica y con espátula de. Dtigalsky 
previamen.tc flameada y fria, -diseminar la muestra en toda la 
su¡,er:ficie de. la pllll:a, 
Tomar una segunda placa y repetir la diseminación con la 
espatula sin flamear. 
Al repetir la operación c.on otras placas. la cantidad de bac­
terias: irá disminuyendo progresivamente� obteniéndose al final 
coion!2s aisladas. 
Dilución (m,!tod(J empleado para conte(J viable o unidade.s 
formailoras de c.oloniJls) 
Esta técnica se utiliza. fundamentalmeme:, en microbiología de 
a.,,oUa y alimenro;; a fu, dede!ftminarsu calidad big1éníca; pore¡ernplo 
eI recuento de bacterias mesófüas aerobias en ia leche es la prneba 
"de oro" para evaluar lacalídad bacteriológica de ésta. Una ubre sana 
aporta no más de 10()0 bacterias mesóñiasiml de lecJie. 
Se realizan diluciones de urui. muestra probiema sobre ]a que 
se desea averiguar el número de bacterias viabíes. Se efectúa la 
siembra de \L"l<1 alicuct.a de cada di]udón sobre medio sól.i-do . Luego 
de incubar cada di lución, se cuenta el número de colonias aisladas 
y se multiplica por el factot de dilución, obteniéndose el número 
de bacterias por mHilitro áe muestra. 
TECNlCA 
• Fundir rubos con agar placa en bafio l\íac·ía hirviente, dejar
enfriar a ± 45 'C y volcar en ¡,lacas de Petri; dejar soíídificar
y evaporar el exceso de humedad colocándolas boca abajo
en estufa de cultivo,
1 
l
., Tomar un.a. hmerfa de tubo;_,; y en cad;:t uno colü-c.ar 9 :nl de 
solución físio!óg1ca. Las dHucwnes son en base. l ú 
. En d primer tubo colocar l ml de muestro, mezdar rotando 
el ruho enire la;i manos y rondar ( dilución l 0- 1 o l -'1 O} 
� Tom:i:r l rnl de la diluc1ón ! 0- 1 y ai;tregado al segundo rubo.
;nadar y rotular (di luci ón i o·:- o t ! l OO\ completar l:a:.: 
dii\1ciones haru terminar (por dt!ución lO• ' i : <::embra: 
dos placas por dilucibn de la sigu iente forma : 
'?z si e.i inócufo es de O ,5 o 1 mL, d...,"'t)::- coiocarsé :.:t1 la placa 
'✓acta ei volumen de siembra y debe agregarse snbre, 
ti el agar fundido- y enfriado a ::: 45 °C: homogenei�r 
:::on movimie-nms de mtaeión en ambo� sentido-s.. deja! 
�.oii difü::ar e !n;:uhar a Y7 1C 
""'" :Si el inúculú et de 0,05 o O. l mi pnmc:ro se plnquca t'i 
ag_ar y luego, con a:,.ruda de una espátula, se extiende el 
:útal del volumen de &.íembra por inda la superficie-de 
L:1 placa, Üit�ubando posterionnetHe a 3 7 "C Siempre 
se comienza sembrand(1 a partir <le la mayor di!ue-ión 
, menor eoncemración de bacierias). 
� Rffucnto: se cuentan Jas placas con un de�arroUo entre 
JO y 300 tolonias; luego de aplicar la !,fguieme fórmula s:e 
promedian los re.:c:ulta<los de cada dilución. 
Número de colonias. x factor de dlludón = bacterias viahleSiml 
factor Je dilucíón ~ inversa de La dilw::ión x inversa del, 
volumen de- siembra 
Ejemplo de cálculo, (pata una sola placa) 
NUmern de colonias contadas en la placa N" 3 "' 50 
Fac!or de dilución ; iü ' ( i !HlOO) : inversa de h dilución' !000 
VulUrnen de siembra = OJ ml ( I/ 10) : inversa del volumen de 
siembra; ! O 
50 x 1000 x JO; 50(W00 bacterias/mi de muestra (5, lfr')*, que 
también � sude expresar como unidades formadoras de. c.olonias 
por mi (CFC/ml) 
Otra aplicadón del número de bacteflas viables es en el 
uroculüvo , La orina de vc:,jjga es estéril pero ai pasar por Ja 
uretra puede sufrir una contaminación con bacterlas uretrales. 
Para otorgarle crédito a la infección urinana alta, se realiza un 
recuento-de bacteria.-: por mí de c,dna: q este recue,nto es menor 
de i (!' hacterias/ml se corisid-eran producto de una c-0ntamlnadón 
y el anAlists se informa negativo. 
Ttc.1CA: la placa con medio de cultivo se siembra con un 
ansa ::a.librada de l O µl: este. volumen equivale a 0,0 J mi. Se 
incuba 24 horas a 37 4C y posteriormente se cuenta ei número 
de colonias. luego se muttlplíca por la inversa de la dilución 
y se obtiene ef número de bacteria�/mL 
Ejemplo: 30 bacterias x 100 = 3 x lú' bacterias/mi 
Métodos especiales pani obtener cultivos puros de 
bacterias a partir de muestras contaminadas 
Calor 
Cuando a partir de una muestra se quieren seleccionar bacte� 
rías esporuladas, se aplica sho<:k de calor, E,ste consiste en someter 
al cultivo cóntaminado • una temperarura de 80"C durante 1 5 a 
Disemínaóón 
DesarroHo de cofonia.s aisladas 
Figura . Metodo de rllseminadém con espámla de Drigalsk;¡. 
30 minutos: asl se diminan las formas vegetativas y sólo quedan 
viables las esporas, 
Temperaturas disgenésicas de cultivo: ios medíos sembrados 
se incuban a 44.5 ºC (± 0,5 <•et a esta rem.penüura solamente 
de.sarro Ha Esclu:richia colr. !o cual permite. su ais lamiento de los 
cüiifom1es contaminantes:. 
Medú,s de cuftii,o disgenésicos 
Se denominan así loK medios que tienen pnrler selectivo sobre 
aJgunas bacterias gracias a ciertas sustandas que los integnin 
( cloruro de sodio, bilis, alcohol fenilelil icol, p,'1: eilas pueden 
fa\'orecer el desarrollo de determinados microo-rganismog y frenar 
o disminuir la proliferaClón de bacterias no deseadas.
Sustancias químicas 
Para tratar muestras mix1as se uliliza eí alcohol ctHic.o de SO''C 
durante I hora� asi se aislan selectivamente los mícroorganismos 
que fonnan esporas, 
hwcufadón en animales de laboratorú, 
Se emplean animaies altamente susceptibles a ta bacteria que 
se desea eislar (por ej ., ratón parae! Streptococcus pneumordae). 
Re-:.ilizan.do la ínocuiaclón por la viaapropiada, los contaminantes. 
quedan retenidos en eJ punta de inoculadón y las bacterias pató� 
genas ínvaden rápidamente et organismo, pudiendo ser aisladas 
en, estarlo puro en sangre, hlgado, bazo, etc, Siempre que sea 
posihle, se deberá evitar el uso de animales de laboratorio, Es12 
t&",Ajjca también se denomina filtración biológka, 
TECNICAS DE Cl'lTlVO 
Trasplante 
También U amado repique, resiembra o suhculü vo, es ei pasaje 
de las bacterias vú1h]e:s de un cultivo a un me-dio fresco, 
De medio líquido a medio liquido: se realiza con ansa e.'1 
aniU-o o pípela Pasteur. 
De medio líquido a medio sólido en tubo: el ansa en agu¡a 
cargada se Ucva al fondo de un tubo con agar en pico de flau� 
ta. se la apoya sobre e! medio de culti.vo y se desíiza con un 
movimiento de zigzag a medida que se la extrae del rubo . 
I>e medio sólido a medio líqu ido: con ansa o aguja. se
lleva el inóculo y se lo deposita sobre las paredes del rubo ,
contactando con el caldo.
De medio sólido a medio sólido: con ansa o aguja. se repite 
la siembra en estría descrita a.,teriormeni"e. 
MORFOLOGIA Y ASPECTO 
DE LAS COLONIAS 
Y POBLACIONES MlCROBIANAS 
Desa.JTollo del cultivo en medio líquido 
El cultivo de rutina en caldo se realiza en tubo de ensayo con 
1 0 mi de medio o en tubos de hemólisis con 3 mi de caldo. Las 
características de las poblaciones son: fonnación de velo. amllo, 
enturbiamiento (característico). y depósíw (característico) 
Desarrollo superficial 
1 . Formación ·d.e. a-n illo: puede ser de tamaño variado, 
adherido o no a la pared del mbo; consis1encia varia.da 
(pelicula teuue, grumosa o membranosa): aspee.to diverso 
(seco, húmedo, etc . ) . 
2 . Formación de pe.licula o velo: pue-.<le ser de diferente 
consistencia, gruesa o fina, lisa. o mgosa, humeda o seca, 
ascendente por el tubo; al agitar puede mantenerse en la 
superficie o caer al fondo del tubo. 
3. Formación de precipitado floc.uloso: al agitar el tubo el
precipitado desciende formando largos flóculos hasta el
fondo del tubo (la floculación es la díspersión de grumos
sólidos en una solución coloidal).
4. Formación de. película membranosa: formad.a por una
membrana más gruesa que la forma pel i.cul.ar o de velo.
5 . Desarrollo superficial ausente: cuando se trata de bacte­
rias microaerófilas o anaerobias absolutas n.o se observa
ningún desarrollo superficial, sí se advierte turbidez del
medio en la parte inferior.
Turbidez del medio liquido 
Muchas bacteria� desarrollan produciendo enturbiamiento del 
medio debido a la abundante suspensión celular. Esta turbidez 
tiene distimos grados y se la clasifica según su mayor o menor 
intensidad en leve, moderada y fuerte, y por su duración en 
transitoria o persistente. 
Formación de. sedimento 
Muchos cultivos presentan sedimentos de diferente aspecto. 
Se clasifican en: ftoculoso cuando el aspecto es granuloso grueso, 
granular, cuando es granuloso fino. escamoso y viscoso . La canti­
dad de sedimento formado puede ser nula, escasa o abundante. 
Desarrollo en cultivo sólido 
La morfología colon ial en medio sólido es característica de 
cada tipo bacteriano. Es útil su observaci6n en un cultivo primario 
para definir si se. trata de un cultivo puro o la muestra esta conta­
minada. Las características más importantes son: pigmentación, 
fonna, dime.nsiones, elevación, contorno y superficie. 
El color depende de la presencia de pigmentos carot:enoides. El 
Staphylococcus aureus, por ejemplo, presenta pigmento amarillo. 
La superficie puede ser lisa. rugosa, muco�, anular concéntrica 
o con surcos radiales. La superficie iisa se debe a la presencia de
cápsula o a las cadenas laterales de los polisacáridos de la mem­
brana ext:erna de los gramnegativos y esta muchas veces asociada 
a la virulencia del microorganismo. Las colonia� rugosas tienen 
una superficie seca formada por células que carecen de cápsula o 
que crecen en forma filamentosa. En algunos microorganismos las 
e.epas rugosas no poseen virul.enci.a. Un caso inverso es el A{vcobac­
terium tuberculosis cuyas cepas patógenas presentan colonias seca.,
por el "factor cuerda" y las cepas mutantes de menor víruíencia son
de aspecto más liso. La superficie. mucosa se. observa en bacrerias
fuertemente capsuladas como Klebsielia.
Las fonnas varían desde puntiforme (< 1 mm de diámetro ) 
hasta circular, filamentosa, rizoide o irregu lar. 
El borde puede ser e.mero, ondulado, lobulado, mellado, 
ti.lamentoso o festoneado. 
La altura puede ser velada., plana. convexa o realzada. 
Otros rasgos son el olor y los caracteres óptíc.os. Ei olor es a 
veces característico de algunas bacterias; por ejemplo, Pseudo­
monas tiene olor a flores. Los caracteres ópticos incluyen aspecto: 
opaco. traslúcido, opalescente o iridiscente. 
CULTIVO DE MICROORGANISMOS 
ANAEROBIOS 
Las bact.eria.s anaerobias estrictas requieren tensión de oxíge­
no reducida para su crecimienio. por lo que no se desarrolt.m en 
la superficie de medí-os de cultivo en atmósferas de aire normal 
(aerobiosis) ni en ambientes con [0% de C0
2 
(microae.rofilia). 
Solamente se desarrollan en atmósferas anaerobias con 5- 1 0%, 
de H,. 5- 1 0% C0
1 
y 80-90%, de N
i 
Métodos para obtener anaerobiosis 
Físicos 
Producción de vacío: las bacterias se cultivan en un reci­
piente, que se some.te a vado por extracción del aire con una 
bomba de vacío o con una trompa de agua. 
Ebullición : el medio de cultivo se somete a ebullición por 
1 O minutos y Juego se enfría bruscamente con agua helada 
o bielo. Dei.pues de sembrar el microorganismo se sella la
superficie con vaselina líquida, lanolina o aceite.
l mi de la 
sustancía a analiz.ar 
y asi 
sucesh·amente 
Cada tubo contiene 9 mi de diluyente 
Figura. Método de dilución en tubos. 
Fio:tira J0-5. U1ilízac1ón dd método dt: difusión para muestras 
cli;ic}i::; \pm t;_\ ... urocultivú), Cantidad a:proximi1d11 de bll.ckti;.;:< 
en !a muestra incial de acuerdo c0n e'.! número de coltmias i:.n !t,::: 
distintos rrazos 
RempJazo de-gases; el medio de cultivo esta en un-recipiente. 
en el que s.e remplaza el O, por otros ga:ses como H
1
_, N;, CO�. 
ü mezdas gaseosas. Ei mit.odü más rradiclonal es el de. Novy
qoe remplaza aí O; por H" producido por la n:.acción del ácido 
sulfúrico (SO 4H) con gran.atlas de d.tK .. 
OuÉmicos 
- Por el agregado al medio de cultivo de sustancias reductoras
no tóxicas para los rnicroorg:anisnms.
La mayoría de fa� cepas de Clostrid,um patógenas: crecen 
en un medio iíqmdo aj que se le agregan tejidú> ammales como 
carne., higado, etc. Estos tejidos actuan como agert1es reduct:::ires 
(caldo Tarozzi_). 
Glucosa: el agrega.do de glucosa al l Ü/ú a un aga-r m1tritivo 
sembrado por puncióp en profundidad logra bueno:, r-.::sulta• 
dos p.anl obtener cultivo:> puros. de anaerobios. Este método 
no e_-; adecuadocu.ando la bacteria fermenta IB gfocosa por la 
abundtmte formzdlm de gas y ruptura del medio 
Tioglicofato de sodio: es. el medio reductr,r de uso rná.s frecuen­
te. Se io emplea a una concentraciónde0.05 a O, I l:,-6, con 0107% 
de agar para aumentar la viscos,dad y reducir la extensión del 
Elevación 
O. por convección. Generalmente se !e agrega un indi::-..adür de
anaerobiosls ó()mc azul de metHeno o resa.zurma. Si la acc-ión
reductora es adecuada. desa¡r_..rece eí color del indicador exce¡,­
tn en la superficie. Se incuba en cóndícioncs aerobias.
La eficacia de los medim líquidos reducmres aun1e11ta sl se 
agrega.(}, 1 %1 de agar ya que éste disminuye las cn!Tlenres de 
convección que pueden llevar el O� hada el fondo del tubo. 
Hierro: la;'. limaduras de hterro e induso los clavo:-; de hierro, 
actúan de manera e:ficaz como reductores agregados a los 
medios liquides:, El hierro debe conservarse e�téri! e-n frase-os. 
Antes de. agregar las limaduras. el medio debe. hervirse durante 
l O minutos y enfriarse rápidamente. Usar de in::nediatc.
Cisteina: se utilb-..a agregada al medio líquido en uru: con­
centración final de 0.3 a 0.5 mghnl. 
Acido ascórbico: en concenrrae-ión del O, l %, en medio líqui­
do es un eficaz agente reduclor 
Formalde-hído snlíoxfüido de sodio: a�reg_:,do a medlcs 
et1mp!ejos en una concentración de 0,03�0,05°1;1 es un buen 
agente reductor. 
Métodos combinados 
jarra de anaerohiosis (Me lntosh J' FildesJ 
Los cultivos se incuban denWJde 'J.1l frasco de vidrio resisten� 
te o policarhona10 en e.l que eJ úXigeno se combina con h!dróge-no 
por acción catalítica del platíno o negro de pakidio caliente, 
La jarra de poik.arbonato. con u., diáfi'letro interno de ! 2,5 cm, 
perrnite incubar varias pfacas de Petri o tubos en fom1a simultá­
nea, La tapa de Ia jarra hc:ne una abrazadera que permite et derre
hermético. Para generar la anaerobiosis hay <los :1-1610Jos. En el 
método origina! ia tapa. tiene dos grifos por donde, se introduce el 
hidrógeno. La tapa también üene dos terminales. conectados por 
dos conductores a una bobina suspendida dentro del frasco. Esta 
tiene un amianto recubierto de pala:dio-espon;oso, El arniamo está 
recubierto c.on una re·sistencia que se conecta con Jos terminales 
de la tapa. El sistema funciona cuando s.e colocan los cultivos y 
se de-na ia tapa. Se hace enrrar hidrógeno a la jarra por un grifo 
durante JO minutos mientras pe-tmanwc ahierto td otrú grifo para 
que se retfre e-1 aire. Luego se cierran ambo:- grifos y se. conecta 
la fuente de electricidad en ios. termioaies. Cuando se caliente. el 
paladio, comienza a formarse a.gua y se repite e-1 proceso de hacer 
Plana Baja convexa Alta convexa Plato 
Bordes 
Entero Irregular Crenado 
Figura Formas, elevación y bordes de las colonias. 
entrar hidrógenü y calentar el pala.dio hasta la eliminación de! 
oxígeno. Se usa un testigo de caldo con azul de metíleno que se 
hace incoloro cuando se alcanza la anaerobiosis total. 
El método más sencillo (Gaspak) consiste en colocar en la 
ja..'Ta. un sobre con una sustancia reductora. Los dos componentes 
básicos del sistema anaernbio son: un sobre generador del dióxldo 
de hidrógeno y de carbono. y un catalizador de paladio. El sobre 
a.bieno y el catalizador se c.olocan dentro de.! tarro de. GasPak.
Se- incluye un indicador de anaerobiosis.. Se coloca agua con una
pipeta y se tapa. A los 15 minuto:- se alcanza la anaerobiosis. y se
observa e.n ei interior de la jarra una neblina por ia condensación
del agua. La jarra se incuba a 3 7 ºC.
Indicadores de anaerobiosis 
Hay indicadores químicos y fisicos. y biológicos Los primero:-­
son coioranles que pierden su color en anaerohiosis por tmnsfor­
mación a su !eucobase. El azul de metileno al ()j�:(¡ agregado a una 
solución glucosa.da consrituyc et reactívo de Me lmosh. Tamhién 
se uriliza la resazurina agregada a los 1nedios liquidos< 
Como método biológico se utilizan ef.poras de Closzridium 
haen-wlytic:um o Bacillus swanAhermophilus que se incluyen e.n 
la jarra am1e.róbic2. y se mcuban junto con e! re-stó de la:-. plac:1� 
o tubos. Si este mícroorg:anismo desarrolla se- inflen: que la
anaerobiosis es correcta.
Demro de las bolsas plásticas sellable.s <Blo-Bag. Gas Pak 
Pouch, ere.) se colocan las placas.junto a un sistema generador 
de CO: e f(, y un indicador que correspondt-- a la annósfora que
se desea obtener. 
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