MICROSCOPIA

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MICROSCOPIA 
HISTORIA DEL MICROSCOPIO 
Fue un holandés fabricante de anteojos, Zacharias Jansen, 
quien, alrededor del año 1600 inventó el microscopio, lo que a 
la postre detenninó un gran avance para la medicina de la época. 
Robert Hooke, en 1665, con un microscopio construido por él. des­
cubrió la circulación sanguínea de los peces y la célula vegetal. 
Otro microscopista holandés, A. Van Leeuwenhoek, entre los 
años 1673 y 1723, realizó estudios con diminutas hipas por él 
talladas, alcanzando hasta 270 aumentos. De esta manera aportó 
valiosa información a los estudios histológicos de la época. . 
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Fue con el advenimiento de los microscopios compuestos 
cuando la microscopia logró un progreso considerable. Incesantes 
perfeccionamientos, tanto de la fuente de iluminación como de 
los oculares, permitieron que, en 1868, Emst Abbé y Car! Zeiss 
realizaran objetivos apocromáticos,. es�decir,. corregidos.de. esfe, 
ricidad y acromatizados para tres diferentes colores. 
El mismo Abbé.fue quien descubrió las ventajas de.los ob­
jetivos de inmersión y el aceite de. cedro como el líquido más 
apropiado para su utilización. Al mismo tiempo, demostró que 
se había alcanzado el máximo de resolución para la luz visible y, 
por lo tanto, que el poder resolutivo del microscopio dependía de 
la abertura numérica y de la longitud de onda de la luz. 
Microscopio simple o lupa 
Se llama microscopio simple o lupa a aquel formado por una 
lente positiva o convergente, que colocada delante de un objeto 
determina la formación de una imagen agrandada de aquél. 
Microscopio compuesto 
El microscopio compuesto está formado pr:iµiordialmente por 
dos sistemas ópticos, objetivo y ocular; ambas lentes positivas que 
se sitúan en los extremos de un tubo con un eje óptico común. 
El objeto a estudiar se coloca delante del objetivo, lente de 
gran potencia que forma una imagen real pero invertida del objeto. 
El ocular, que actúa como una lupa o microscopio simple, forma 
una imagen real, agrandada y derecha de la imagen. 
Básicamente el microscopio está integrado por el estativo y 
el sistema óptico. El primero está formado a su vez por el tubo, 
la platina, la columna y el pie. 
El tubo es el encargado de sostener el ocular enla parte superior; 
hoy en día existen tubos monoculares, binocu,lares y trioculares con 
una opción para cámara fotográfica o cámara de televisión. 
En.la parte inferior del tubo se encuentra el revólver donde 
van atornillados los objetivos; esto permite al operad9r cambiar 
fácilmente de objetivo con un simple m�vimiento giratorio y, por 
lo tanto, cambiar de aumentos. 
La platina es una plataforma rígida ubicada en fonna perpen­
dicular al eje óptico, y permite dos movimientos perpendiculares 
entre sí. La platina se áleja o acerca al objetivo mediante dos 
tomillos, uno macrométrico que permite una aproximación y uno 
micrométrico con el que se logra el foco exacto. 
La columna sostiene el tubo con su sistema óptico, la platina 
· y, por debajo de ella, el condensador, el diafragma y el. sistema
de iluminación. Asimismo se encuentra unida al pie que sostiene
todo el microscopio.
La parte óptica está formada por los objetivos y los oculares
situados por encima de la platina y por el condensador, el diafrag­
ma, el espejo y la fuente de iluminación por debajo de aquélla.
En muchos microscopios modernos, el espejo ha sido eliminado,
pues la luz incide directamente sobre el condensador.
La función del condensador es concentrar la luz en un cono
de manera que ésta atraviese el objeto a observar, transforman­
do los haces de luz divergentes en convergentes al salir de él y
penetrar en el objetivo.
Generalmente los condensadores están provistos de un diafragma
de iris, con el que se-regula lacantidaddeluzquese-desea-reeibrr.
Existen·distintosmodefus·decondensadores:'·el·condensador
de Abbéylos más comunes, los condensadores aplanático-apo­
cromático (fig'. 7-1 ), es decir, los -que corrigen para tres colores
del espectro y totalmente la aberración de esfericidad.
ILUMINACION EN CAMPO BRILLANTE 
Posiblemente, el método más eficaz de iluminación en campo 
brillante sea el deKohler. Mediante élse logra iluminar al espéci­
men con un cono luminoso uniforme.en-todo su campo angular, 
enfocado en su diámetro.mínimo en el plano del espécimen. El 
cono luminoso deberá estar confinado al área del espécimen, y 
coaxial con el objetivo y el ocular del microscopio. Reswniendo, 
consiste en alinear o centrar los distintos componentes para obte­
ner una iluminación adecuada sobre el espécimen a observar. 
ILUMINACION SOBRE CAMPO OSCURO 
Este tipo de iluminación se utiliza para la observación de 
partículas u organismos muy pequeños e invisibles con el método 
de iluminación en campo brillante. Es conocido que un objeto se 
diferencia del medio por el contraste que ofrece con éste mismo.
Si estas partículas invisibles son iluminadas en forma transversal, 
se hacen visibles. Esto sucede pues los rayos de luz de la fuente 
no penetran directamente en el objetivo, sino que lo hacen los 
difundidos por el objeto iluminado, los que se observan brillantes 
sobre un campo oscuro. 
Esta iluminación sobre campo oscuro se logra modificando 
los condensadores, de modo tal que; impida el paso de los rayos 
de luz centrales, pasando sólo los marginales en forma oblicua 
sobre el preparado. Así, la luz se difunde sobre las partículas a 
observar y penetra en el objetivo. Este es el llamado condensador 
paraboloide (fig'. 7-2A). Sobre la base del mismo principio, el 
condensador cardioide (fig. 7-2B) posee una pieza semiesférica 
de cristal en su parte central, la cual es plateada en la parte inferior 
y negra en la superior; de esta manera, los rayos de luz se reflejan 
en la cara plateada. Estos sufren una segunda reflexión sobre las
paredes exteriores del condensador desde donde se proyectan en
forma oblicua hacia el preparado.
MICROSCOPIOS DE FLUORESCENCIA 
Los microscopios de fluorescencia utilizan la propiedad que
poseen ciertas sustancias de emitir, bajo la acción de radiaciones
de onda corta, otras de longitud de onda más larga.
Los primeros microscopios de fluorescencia construidos por
K. Reichert ( 1911) utilizaban un arco voltaico de carbón, como
�misor de luz ultravioleta. Esta, una vez filtrada para selecdbnar
los rayos de luz requeridos, pasaba a través de un condensador de
campo oscuro; así, sobre un fondo oscuro, la parte fluorescente
de la muestra se observaba brillante.
Existen dos tipos básicos de equipos de fluorescencia: de luz
transmitida y de luz incidente o epifluorescencia; se diferencian en
la manera en que los rayos de luz inciden sobre la muestra.
Los microscopios modernos están dotados de lámparas de
mercurio de alta presión, aunque ellas no emitan luz ultravioleta.
Esto se debe a que los fluorocromos utilizados hoy en día no
requieren longitudes de.onda ultravioleta para excitarse.
Básicamente los equipos de fluorescencia transmitida funcio-­
nan como los microscopios de luz visible, es decir, la muestra
es iluminada desde abajo, pasando previamente por un filtro que
selecciona la longitud de onda apropiada (fig. 7-4). Una vez que
· la luz atraviesa la muestra, otro filtro absorbe las radiaciones no
requeridas, y permite sólo el paso de la luz fluorescente.
En los microscopios con epifluorescencia, la luz es guiada
desde arriba mediante un espejo dicroico, 1 previo paso por un filtro
excitador, a través del objetivo, para que incida sobre la muestra
(fig. 7-5). Esta emite longitudes de onda visibles. Mediante una
barrera de filtros colocada entre el objetivo y el ocular, se eliminan
las longitudes de onda no requeridas, y se obtiene así un fondo
oscuro sobre el que brillan las partículas ffuorescentes.
Las técnicas de inmunofhiorescencia se desarrollan utilizando
fluorocromos; los cuales se conjugan con determinados anticuer­
pos para la detección de antlgenos, sean éstos fijos o libres, en
un espécimen determinado;
Los fluorocromos más usados son lafluoresceína (coloración
amarillo-verdosa) y la tetrametilrhodamina (coloración roja), am­
bas fácilmente conjugables con las inmunoglobulinas.
MICROSCOPIA ELECTRONICA 
En 1924, Busch demostró que un haz de electrones podia ser
enfocado cuando pasaba a través de un campo magnético produ­
cido por un solenoide. Esta característica del haz de electrones fue
aprovechada por Ruska y Knoll para construir en 193 l el primer
microscopio electrónico (ME). Con este nuevo microscopio
lograron una ampliación de sólo l 7x; sin embargo establecieron
las bases para la óptica de los electrones. Así, en 1932, se logró
una resolución de 50 nm, y en 1940 se llegó a los 3 run,
Los modernos microscopios electrónícós poseen una resolu­
ción del orden de los 0,2 nm. Paralelamente, se han desarrollado
otros instrumentos de óptica electrónica, como por ejemplo el
microscopio electrónico de barrido, el cual revela detalles tanto de
superficie como intracelulares; el microscopio electrónico analíti­
co, el cual revela datos cuali y cuantitativos de los constituyentes
' . 
1 
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� 
w �-
Abbé Acromático Aplanático 
Figura Tipos de condensadores.
intracelulares, y el microscopio electrónico de alto voltaje, el que 
puede estudiar secciones gruesas con una resolución de O, 1 nm.
En el microscopio electrónico de transmisión (MET), un haz ¡ homogéneo de electrones pasa dentro de una columna con alto
vacío, 
delgada 
a alta 
como para 
velocidad, a 
transmitir 
través 
no 
de una 
menos del 
muestra 
50% 
lo 
de los 
suficientemente 
electrones 
·••1 que inciden' sobre ella. jEl microscopio de luz y el electrónico son similares en cuanto --
a sus componentes. Los dos poseen tres sistemas principales: el \sistema de iluminación, el de imagen y el de traslación de ima­
gen. El sistema de iluminación.está compuesto por la fuente de
radiación y lentes condensadoras (bobinas electromagnéticas) que
enfocan el b.az de ·electrones en er plano de Ia muestra; después
. J
de pasar a través de ella, el haz de electrones entra en el sistema 
de imagen, el cual está compuesto,J)QI' un ciettonúmer()de len- 1
tes. Estas producen la ampliación final de la imagen. Las lentes •-i
que intervienen son la lente objetivo, que produce una imagen
intennedia, y la lente de proyección, que produce la imagen final
ampliada: Esta puede set observada en una pantalla fluorescente
o registrarse en una placa fotográfica. Esto último comprende el
sistema de traslación· de imagen (fig. 7-6).
El microscopio electrónico de barrido (MEB}pennite no sólo
la observación de detalles con una alta resolución, sino obtener una
imagen sobre la superficie de cualquier objeto, y existen muy pocas
restricciones en cuanto al tipo y tamaño de la muestra a observar.
El MEB es básicamente similar al MET; se agrega a éste un
detector de electrones que recoge los que rebotan sobre la muestra,
produciendo una· señal que pasa por un amplificador de video y de
allí al monitor de televisión donde se observa la muestra (fig. 7-6).
La imagen tridimensional que se observa en la pantalla se 
fonna punto por punto y línea por línea mediante los electrones
secundarios que son emitidos por la muestra, que es explorada en
fonna intermitente y en toda su superficie por un haz principal.
A B 
Figura , Condensador paraboloide; B, Condensador cardioide.
l Dicroico: sustancia que ofrece distinto color, según se mire por reflexión o refracción.
Nuevas técnicas en microscopia electrónica 
� El uso de la ME ha permitido importantes avances en el 
estudio de las estructuras celulares. Sin embargo, el completo 
......) conocimiento de la organización celular pudo ser entendido 
estudiando tanto la estructura como la actividad bioquímica de 
los constituyentes citoplasmáticos. Un paso importante en este 
; camino fue introducido con las técnicas de histoquímica para la 
·, detección de enzimas con el ME.
Las técnicas inmunohistoquímicas combinan moléculas de metales 
pesados con anticuetpo5; estas partículas electrodensas son fácilmente 
observables con el Nffi, lo que penrute la localiz.ación de antígenos. 
En la actualidad, la utilización del ME en la biología molecu- l/..;. 
lar permite la observación de los ácidos nucleicos (DNA, RNA), 
· cromosomas, estructuras de la cromatina, etc.
Todas estas técnicas deben ser vistas como un procedimiento 
-·� i más a ser utilizado en conjunción con otros, para investigar los 
distintos aspectos de la biología. 
Microscopio de _barrido efecto túnel 
El primer prototipo de microscopio de efecto túnel fue construido 
porG. BinningyH. Réihrer(IBM.Zurich),peroreciénen 1981 pudie­
ron resolverse todos los problemas inherentes a su funcionamiento. 
Figura 7-3. Fotomicrografia tomada con el microscopio electrónico de 
transmisión. VtruS de la viruela aviar (Avipoxvirus). Servicio Central 
de Mi�ia Electrónica de la F acuitad de Ciencias Veterinarias 
de laUNLP. 
Luz fluorescente Radiación 
selecciooada 
\ 
Espécimen 
fluorescente 
Filtro barrera que 
detiene las radiaciones 
no queridas 
Radiación 
excitadora 
------• -----------• 
Filtro que selecciona radia­
ciones de longitud dé onda 
apropiada 
-------- -----• 
------- ---------
♦ 
Radiación no querida 
- - - -•
Figura. Esquema del funcionamiento de un microscopio de fluorescencia de luz transmitida. 
Ocular 
1 Adicional c=:::J, ..... ►
1 
1 
Filtro barrera c::cJ 
Objetivo 
Filtro excitador suple­
mentario 
Filtro 
excitador 
Lámpara de 
mercurio 
Espécimen 
Figura Esquema del funcionamiento de un microscopía con epifluorescencia. 
El microscopio de efecto túnel, como su nombre lo indica, se aprovecha de dicho efecto, uno de los más sorprendentes resultados de la mecánica cuántica. Para ésta, una partícula como un electrón no está ubicada exactamente en un lugar, sino que puede interpreta¡se como una onda'más o menos extendida, y no se le puede atribuir una posición puntual, sino una nube de posiciones en las cuales la partícula podría encontrarse. Semejante ubtpuidad permite que unelectrón(pueda con cierta probabilidad escapar de un átomo, remon�o las poderosas cadenas e�ctrornagnéticas que lo amarran a él, como si hubiera practicado un túnel a través de la barrera de potencial que lo tiene confinado. � ... El microscopío de efecfo,túnel se apróvecha"de estas habi­lidades escapatorias de los electrones. Una sonda (un electrón extremadam�te fino) se ace� a una'distanci¡¡ muy corta (unos diez millon�mos de miiímetro) de la superficié del metal a ob­servar, entre la punta de la superficie reina el� estricto vacío y 
una pequeña diferencia de potencial eléctrico. Los electrones de la superficie del metal, debido a su ubicuidad cuántica, pueden, con cierta probabilidad, abandonar los átomos de origen para dirigirse a la sonda intrusa, cavando un túnel cuántico a través del vacío que los separa de ella, y estableciendo así una "corriente túnel" que la sonda se ocupa de registrar. Ahora, como la intensidad de esa "corriente túnel" depende de la distancia entre la sonda y la superficie, conociendo una, se conoce la otra, a medida que la sonda barre la superficie, la intensidad de la "corriente túnel" va informando sobre el relieve y la topografia del metal, brindando una imagen muy clara de los valles y montañas producidos por la estructura atómica ultrafina de éste. La resolución del microscopio de efecto túnel es espectacu­lar -menos de un décimo del radio promedio de un.átomo-, ha permitido obtener mapas muy precisos de superficies de metales o de semiconductores, en los que cada átomo puede distinguirsede su vecino (ayuda inapreciable para las necesidades de la mi-
Fuente·de iluminación 
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,:., .... ;. '• 
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Lentes condensa­doras _.., 11 ' 
Caiión de electrones 
� Espécimen -...Lf3 / 
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condensadora � objetivo '-... �)
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Lente objetiv� 
intennedia 
. 
-+- Ojo humano 
Ocular 
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Espécimen � �::
,._ Lente proyectora 
Pantalla K fluorescenteTubo de rayos catódicos • 
Bobina de barrido Circuitosde barrido 
Microscopio óptico Microscopio electrónico 
de transmisión 
Microscopio electrónico 
de barrido 
Figura Esquema comparativo de la formación de imágenes en distintos microscopios. 
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i 
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croelectrónica moderna), y ha proporcionado también imágenes 
atómicas de moléculas de DNA. 
Microscopios de fuerza atómica 
Los denominados "microscopios de fuerza atómica" (G. 
Binning y H. Rohrer, 1985) también son capaces de reconstruir 
tal relieve pero no hacen acopio del efecto túnel sino de la fuerza 
electromagnética entre la sonda y los electrones de la muestra a 
analizar; la sonda entra en contacto con la muestra y detecta los 
efectos atractivos o repulsivos de las fuerzas atómicas. La resolu­
ción es similar a la del efecto túnel pero se utiliza para materiales 
no conductores, como la mayoría de las muestras biológicas. 
.. 
BIBLIOGRAFIA 
Aguilar Paris J. Teoría y Práctica del microscopio. Ed. Saber. Valencia. 
España. 1965. 
Bancroft JD, StevensA. Theory and Practice ofHistological Techniques. 
Churcbill Livingstone, Edinburgh. Second edition. 1982. 
Cicardo VH. Biofisica. López Libreros Editores S.R.L. Buenos Aires. 
Argentina, 8va. edición. 1987. 
HyattAD, Eaton BT. lmmuno-gold Electron Microscopy in V111.1S Diag­
nosis and Research. CRC Press. NW Boca Ratón Florida USA. 1993. 
Sommerville J, Scbeer U. Electron Microscopy in Molecular Biology. 
�.:. IRL Press. Oxford England. 1987 .