PRACTICA TECNICAS DE COLORACION MICROORGANISMOS

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E.A.P. Ingeniería Agroindustrial 
	INDICE
 Páginas:
· INTRODUCCIÓN……………………………………………………….… 2
· OBJETIVO…………………………………………………………………. 3
· FUNDAMENTO TEORICO………………………………………………...3
· PARTE EXPERIMENTAL ………………………………………………..6
· RESULTADOS ………,………………….………...………………….……7
· DISCUSIÓN DE RESULTADOS…………………………………………7
· RECOMENDACIONES……………………………………………………7
 
· CONCLUSIONES …………..……………………………..………….…..8
· CUESTIONARIO…………………………………………………………..8
· APENDICE…………………………………………………………………9
· BIBLIOGRAFÍA……………..………………………………………….…1O
TÉCNICAS DE COLORACIÓN DE MICROORGANISMOS
1. INTRODUCCIÓN
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste entre la célula y el medio que la rodea es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse también para localizar estructuras específicas en la célula o para distinguir entre tipos diferentes de células.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. 
Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopia son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
2. OBJETIVO
Estudiar las técnicas de coloración de microorganismos más empleadas en microbiología para su diferenciación y estudio microscópico.
3. FUNDAMENTO TEORICO
3.1 TINCIÓN DE GRAM
Se puede utilizar a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gran positivas y gran negativas.
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos con cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado todas las células, tanto las gran negativas como las gran positivas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células gran positivas como las gran negativas se encuentran en la misma situación.
 Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (gran positivos) no se decoloran mientras que otros (gran negativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células gran positivas son todavía azules, pero las gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gran negativa se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gran negativas son roja grosella mientras que las Gran positivas permanecen azul.
Figura 1: La tinción de Gram.
Finalmente, el carácter de gran positivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son más gran positivos que otros y algunos son gran variables, es decir, unas veces gran positivos y otras gran negativos. La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico.
TINCIÓN ÁCIDO – ALCOHOL RESISTENCIA
Esta tinción sirve principalmente para clasificar mico bacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto el ácido – alcohol sensible como las resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensible de color azul quedando las células ácido – alcohol resistente de color rosa.
Figura 2: La tinción ácido – alcohol resistencia.
Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.
Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde del verde malaquita
	Figura3: La tinción de esporas.
4. PARTE PERIMENTAL
4.1 Materiales
Porta objeto
Microscopio
Asa de siembra
Mechero
4.2 Muestras
MC carne
APS arroz
4.3 Reactivos 
Agua destilada
Cristal violeta
Lugol
Alcohol cetona
Safranina
4.4 Procedimiento experimental
· En el centro de una lámina porta objeto se coloca una gota de agua destilada.
· Con ayuda del asa de siembra se toma una alícuota del cultivo muestra y extender en la lámina.
· Llevar al mechero y flamear hasta fijar la muestra.
· Colocar 2 gotas de cristal violeta y dejar actuar por 2 minutos.
· Lavar con agua de caño, añadir lugol y dejar actuar por un minuto. Seguidamente enjuagar con agua de caño.
· Decolorar con alcohol-acetona cuidadosamente para evitar llevarse el frotis.
· Añadir 2 gotas de fucsina básica o safranina y dejar actuar por un minuto.
· Secar y observar en el microscopio a menor aumento y luego a mayor aumento.
· Hacer los esquemas de sus observaciones. Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
5. RESULATADOS
	muestra
	Tipo de bacteria
	
	MC carme
	estreptococos
	Gran positivas
	APS arroz
	
	Gran negativo
6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración se debe:
En las bacterias Gram negativas: 
 La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodoque se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea.
En las bacterias Gram positivas:
 Al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
7. RECOMENDACIONES 
Al enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo.
8. CONCLUSIONES
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
 CUESTIONARIO
¿Cuál es la acción que cumple el lugol en la coloración Gram?
En el lugol (KI) el ingrediente activo es el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. En conclusión el lugol es un mordiente, sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijación en las bacterias.
¿Cuál es la razón del uso de alcohol – acetona?
El alcohol-acetona se usa para realizar la decoloración, sustancia que es soluble en el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (gran positivos) no se decoloran mientras que otros (gran negativos) lo hacen.
¿Cuál es el fundamento de la coloración Gram?
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano. Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez.
¿Qué es un peptidoglicano y cuál es su importancia en las bacterias?
ANEXO
Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.
Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas)
Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.
BIBLIOGRAFÍA
· TÉCNICAS DE TINCIÓN, ACUA NATURA
· Aulton Michael E., Ciencia y diseño de formas farmacéuticas, 2° edición, Ed. Elsevier España, 2004..
· Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-13-066271-2.
· Søgaard M, Nørgaard M, Schønheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin Microbiol 45: 1113.
	
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