INFORME 2 Tincion de Gram - Adelfo Morales Gonzalez

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Tinción de Gram 
RESUMEN
La tinción de Gram es una coloración diferencial que permite identificar distintos tipos de bacterias según se coloree su superficie por lo tanto el objetivo de este trabajo es conocer las tinciones gram , identificar y diferenciar los tipos de tinciones gram y su uso, el laboratorio se realizó de manera virtual en donde por medio de videos se observó la preparación de una muestra de bacterias con Tinción de gram para su posterior observación microscopica con el fin de identificar bacterias Gram positivas y Gram negativas según su coloración obteniendo como resultado para las Gram positivas una coloración violeta en donde se identificaron bacterias como coco y para las Gram negativas una coloración azul oscuro en donde se identificaron bacterias como la E.coli.
INTRODUCCIÓN
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853- 1938), que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana. Christian Gram, desarrolló una técnica de tinción que permite separar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas.
Se le llama bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul-violeta, y se denomina bacterias Gram negativas a las que se decoloran y después se tiñen con safranina. Esta diferencia de tinciones se debe a la estructura de las paredes celulares de ambos tipos de bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen una pared gruesa compuesta de peptidoglucanos y polímeros, e impermeable, que hace que resiste la decoloración. En cambio, las bacterias Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglucanos más una bicapa de lipoproteínas que se puede deshacer con la decoloración. (Rodríguez et al 2018 ). Este trabajo tiene como fin conocer las tinciones gram , identificar y diferenciar los tipos de tinciones gram y su uso.
ESTADO DEL ARTE 
Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. (Beveridge TJ. 2001). 
Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglucano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las características tintoriales ( Breakwell DP, 2009).
La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona.
Bacterias Gram Positiva: Ejerce una notable influencia en la resistencia frente a varios antibióticos, sobre todo a los que actúan sobre la pared de peptidoglicanos, que es el punto débil estas bacterias. Hay que pensar que el antibiótico no induce resistencia, solamente actúa en una interferencia clara de la humanidad en el proceso de selección natural. 
· De modo pueden visualizar las bacterias Gram+ de color azul-violáceo
· La pared de las bacterias Gram+ ejerce un efecto protector o de resistencia contra numerosos antibióticos que tienen que atravesar esta estructura para llegar a su interior y ejercer su efecto antibacteriano. Sin embargo, el mantenimiento de esta estructura se convierte en el punto de ataque de varios antibióticos, afectando fácilmente en la viabilidad de estas bacterias y creando una susceptibilidad diferente a los mismos entre las bacterias Gram+ y gram-.
· La clave es el peptidoglucano -más conocido como mureina-, uno de los principales constituyentes de la pared celular, formando una gruesa capa en los Gram+
Bacterias Gram negativas: 
· se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta. 
· la pared es mucho menor y se encuentra entre dos membranas que dificultan su acceso a los antibióticos.
· se utiliza un colorante de contraste para visualizar los microorganismos Gram- como la fucsina o safranina. 
 Figura 1. Observación de una coloracion Gram+ y Gram-
METODOLOGÍA
El laboratorio se realizó de manera virtual en donde por medio de un video se observó la preparación de una muestra bacteriana con tinción de gram como se describe a continuación: 
En un portaobjetos con una pequeña gota de agua destilada previamente se disolvió una pequeña cantidad de cultivo bacteriano en la que se preparó una fina extensión de un frotis disolviéndose en el agua, luego con la ayuda de un mechero encendido se flameó un cubreobjetos por la parte de debajo de la muestra por 1 minuto, posteriormente teñimos la muestra de la siguiente manera.
El frotis se cubrió con cristal violeta durante 1 minuto y luego se retiró el colorante mediante un suave lavado con agua deslizándose sobre el portaobjetos para no desprender la muestra seguidamente se aplicó lugol a la muestra durante 1 minuto y se realizó un lavado como en el paso anterior, posteriormente se retiró el colorante de las células con alcohol etanol goteando sobre el portaobjetos, hasta que las gotas de etanol salgan casi incoloras. Las células Gram- pierden el colorante violeta y las Gram + seguirán violetas Por último se agregó safranina como colorante de contraste, y se lavó como en los pasos anteriores con agua este colorante solo marcara a las células Gram- .
Se realizaron observaciones microscópicas en 4x hasta 40x y en 100 usando aceite de inmersión para determinar cuáles bacterias observadas eran Gram- y cuales eran Gram + .
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se pudo observar la morfología de cuatro muestras de bacterias como se ve en la figura 1-4, que se tiñeron con tinción de Gram observando su gran utilidad por lo que gracias a ella se puede apreciar con claridad el núcleo y el citoplasma de las bacterias además es un método que permite clasificar estos microorganismo como se observa en la figura 1 donde se clasificaron por su forma agrupación y tipo de tinción, las dos primeras muestras corresponden a bacterias con formas de cocos siendo para la figura 1 una agrupación de estafilococos y la figura 2 una agrupación de estreptococos ambas muestras corresponden a bacterias Gram positivas ya que su pared celular está formada por una gruesa capa de peptidoglicano, a diferencia de la figura 3 y 4 donde se observaron bacterias con formas de bacilos y una agrupación para la figura 3 de diplobacilos y la figura 4 de bacilos siendo estas dos últimas de tipo Gram negativas ya que la pared de estas bacterias tienen una pequeña proporción de peptidoglicano además de una capa de lipopolisacáridos en su membrana externa por lo que no se tiñen igual a las Gram positivas.
CONCLUSIÓN
La tinción de Gram es de gran utilidad en microbiologíaya que hace parte de las herramientas que se utilizan en los laboratorios para detectar enfermedades infecciosas ya que por medio de esta se obtiene información acerca de células bacteriana que puedan causar algún tipo de alteración en el cuerpo al igual que es de gran utilidad para orientar el tratamiento antibiótico.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Investigue otros dos ejemplos de coloración de tinción diferencial
RTA: 
· Tinción de Ziehl Neelsen: para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis, las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. Contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene cera
· Tinción diferencial Método de Wirtz: Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas esporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente y safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante (Santambrosio & Garibaldi, 2009).
2. Cuáles son las fuentes de error más comunes en la coloración de gram
 Edad de la bacteria.
 Errores del operador.
 Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglucano y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñen como gram negativas),Es por esta situación que junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. Coli).
3. Qué es tinción selectiva y explique algunas técnicas utilizada en la
Microbiología
RTA: Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar una estructura celular determinada, algunas bacterias tienen la capacidad de producir endosporas y/o producir exopolisacáridos conocidos como cápsulas. Las endosporas bacterianas estructuras de resistencia que se caracterizan por presentar varias capas compuestas de proteínas y azúcares complejos, mientras que en el protoplasto de la misma existe un complejo de dipicolinato de calcio, debido a esta composición, es muy difícil que los colorantes penetren, por lo que al aplicar una tinción simple, estas aparecen como cuerpos incoloros (dentro o fuera de la célula). No obstante es posible teñirlas mediante la aplicación de métodos drásticos. Con respecto a la cápsula, esta es una cubierta extracelular constituida por agua y polisacáridos que se acumulan alrededor de la célula, estos componentes no se combinan con los colorantes, por lo que para la observación de la misma se emplean tinciones negativas con las que se oscurece el fondo de la preparación y de esta manera se contrastan las cápsulas (Molinillo, 2019).
4. Explique el fundamento de la tinción de endosporas, ¿Por qué se debe
calentar la preparación? ¿Qué dificultades se tendrían si no se adiciona la
safranina al final de la tinción.
Debido a la composición de las esporas, éstas se tiñen con algunos colorantes. Las esporas, ya sean exosporas o endosporas, son una forma de resistencia de los microorganismos.
la preparación se calienta para estimular al microorganismo a espolural
Se utiliza safranina como contraste para poder visualizar mejor el microorganismo y sus esporas si no se adiciona habría problemas a la hora de visualizar los microorganismos.
5. Explique el fundamento de la tinción negativa ¿Qué tipo de información se
obtiene?
La tinción negativa tiñe el fondo de la preparación y no el microorganismo desde el punto de vista formal no es una tinción previamente dicha porque no fija los microorganismos. Se parece más a una preparación en fresco. Su realización es sencillísima, consiste en colocar la muestra húmeda sobre el portaobjetos y mezclar con tinta china. La tinta cubre toda la preparación a excepción de las cápsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con capsula sin color.
BIBLIOGRAFÍA 
· Santambrosio, E., Ortega, M., & Garibaldi, P. (2009). Tinción y observación de microorganismos. Trabajo práctico. Universidad Tecnologica Nacional, Departamento De Ingenieria Quimica
· Molinillo-Mellado, L. (2019). LABORATORIO MICROBIOLÓGICO. PROPUESTA DIDÁCTICA: TÉCNICAS Y MICROORGANISMOS EN LA ALIMENTACIÓN.
· Rodríguez PA, Arenas R. Hans Christian Gram y su tinción . Dermatología Cosmética, Médica y Quirúrgica. 2018;16(2):166-167.
· Breakwell DP, Moyes RB, Reynolds J. Differential staining of bacteria: capsule stain. Curr Protoc Microbiol. 2009. Appendix 3: p. Appendix 3I.
· Beveridge TJ. Use of the Gram stain in microbiology. Biotechnic & Histochemistry. 2001; 76: 111-118.
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