Biologia de los microorganismos-1068 (409)

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194 G E N Ó M I C A , G E N É T I C A Y V I R O L O G Í A
con radiactividad. Los productos se separan por electroforesis 
en tubos capilares y las bandas de fluorescencia se detectan con 
láser. Como cada una de las cuatro bases utiliza una marca fluo-
rescente de un color diferente, las cuatro reacciones se llevan a 
cabo en una misma carrera del gel de electroforesis y los resul-
tados son finalmente analizados por un ordenador (Figura 6.2).
(usualmente 10–20 nucleótidos) y secuencia definida, que son 
sintetizados de manera artificial. Los cebadores son segmentos 
cortos de DNA o de RNA que inician la síntesis de cadenas nue-
vas de ácidos nucleicos. Durante la replicación del DNA in vivo 
se utilizan cebadores de RNA, pero en biotecnología se emplean 
cebadores de DNA, ya que son más estables que los de RNA.
En el método de Sanger la secuencia se determina haciendo 
copias del DNA original de cadena sencilla mediante la enzima 
DNA polimerasa. Como se ha tratado previamente ( Sec-
ción  4.4), esta enzima añade trifosfatos de desoxirribonu-
cleótidos a la cadena creciente de DNA. Sin embargo, en la 
secuenciación de Sanger, se incluyen cantidades pequeñas 
del didesoxirribonucleótido correspondiente en cada una de 
las cuatro mezclas de incubación —una para cada una de las 
cuatro bases: adenina, guanina, citosina y timina (Figura 6.1). 
El didesoxi análogo es un reactivo específico terminador de la 
cadena ya que, al no contener el grupo 3 -hidroxilo, la elonga-
ción de la cadena no puede continuar después de su inserción. 
Durante el proceso, se obtienen cadenas de DNA de diferentes 
longitudes debido a que los didesoxirribonucleótidos se inser-
tan aleatoriamente, y estos fragmentos son separados mediante 
electroforesis en gel según su tamaño (Figura 6.1).
Originalmente se utilizaban cuatro reacciones separadas (y 
cuatro carreras independientes en el gel) en cada secuenciación, 
una para cada fragmento terminado en cada una de las cuatro 
bases del DNA. Las posiciones de los fragmentos se localizaban 
usando precursores marcados (al principio radiactivamente, 
pero ahora con fluorescencia). Mediante la alineación de las 
cuatro carreras de didesoxiribonucleótidos y la localización de 
la posición vertical de cada fragmento respecto de su vecino, 
se puede leer la secuencia de DNA directamente desde el gel 
(Figura 6.2).
Los sistemas de secuenciación automática de DNA usan ceba-
dores (o nucleótidos) marcados con fluorescencia, en lugar de 
Tabla 6.2 Métodos de secuenciación del DNA
Generación Método Características 
Primera generación Método didesoxi de Sanger
(radioactividad o fluorescencia; amplificación del DNA)
Tamaño de lectura: 700-900 bases
Usado para el proyecto del genoma humano
Segunda generación Pirosecuenciación 454
(fluorescencia; amplificación del DNA; masiva en paralelo)
Tamaño de lectura: 400-500 bases
Usado para secuenciar el genoma de James Watson 
(completado en 2007)
Método Illumina/Solexa
(fluorescencia; amplificación del DNA; masiva en paralelo)
Tamaño de lectura: 50-100 bases
Genoma del panda gigante (2009; Beijing Genome 
Institute) genoma del hombre de Denisova (2010)
Método SOLiD
(fluorescencia; amplificación del DNA; masiva en paralelo)
Tamaño de lectura: 50-100 bases
Tercera generación Secuenciación de una sola molécula, HeliScope
(fluorescencia; única molécula de DNA)
Tamaño de lectura: hasta 55 bases
Mejora mucho la exactitud para DNA fósil
Secuenciación SMRT, Pacific Biosciences
(fluorescencia; única molécula de DNA; guía de onda de 
«modo cero» o ZMW)
Tamaño de lectura: 2.500-3.000 bases
Cuarta generación Secuenciación por Ion Torrent
(cambio iónicos por pH; amplificación de DNA)
Tamaño de lectura: 100-200 bases
Genoma secuenciado de Gordon Moore, cofundador de 
Intel y creador de la ley de Moore, 2011
Secuenciación por nanoporos, Oxford Nanopore
(corriente eléctrica; única molécula de DNA; tiempo real)
Tamaño de lectura: miles de bases
Utiliza la unidad portátil MinION que es aproximadamente 
del tamaño de un lápiz memoria USB.
Figura 6.1 Didesoxinucleótidos y secuenciación de Sanger. (a) Un
desoxirribonucleótido normal tiene un grupo hidroxilo en el carbono 3′, 
mientras un didesoxirribonucleótido no lo tiene. (b) La elongación de la cadena 
termina cuando se incorpora un didesoxirribonucleótido.
O
H
Base
Cadena de DNA
Dirección de
crecimiento
de la cadena
O P
O–
O–
O CH2
O
H
Base
OH
3′
5′
5′
O P
O–
O–
O CH2
5′
2′ 3′ 2′
H
OH ausente 
DidesoxirribonucleótidoDesoxirribonucleótido normal 
No hay 3′-OH libre, la
replicación se detendrá aquí
3′
H H
O
H
BaseO P
O
O–
O
H H
H
O
H
BaseO P
O–
O–
O CH2
CH2
H
(a)
(b)
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