T3 QB - Proteínas 3

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@rose.studygram_
TEÓRICO 3
Función de las proteínas 
Todos los procesos biológicos se basan en la capacidad que poseen las proteínas y ácidos nucleicos de establecer interacciones moleculares específicas.
Reconocimiento molecular: las proteínas hacen “algo” que implica la interacción de la proteína con ligandos, entonces se manifiesta por la asociación de macromoléculas entre sí y con la molécula de medio y pequeño tamaño. Implica la unión física de moléculas.
Lo de pequeño tamaño hace referencia a una molécula pequeña o una porción pequeña de una molécula grande. 
Interacción ligando-proteínas 
Interacción reversible 
Ligando: molécula capaz de unirse reversiblemente a una macromolécula, además es capaz de ser reconocida por otra y provocar una rta biológica. 
¿Qué características tienen los ligandos?
· Tamaño y naturaleza química variable
· La unión está dada por interacciones débiles, las mismas que estabilizan la estructura 3D de la proteína. 
La interacción es reversible, el sitio donde la proteína se une al ligando se denomina sitio de fijación, este debe ser complementario al tamaño, forma y carácter (carácter químico) del ligando. A su vez, la interacción es específica, es decir, la proteína presenta una capacidad de discriminar entre 2 moléculas muy similares. Entonces en la imagen hay un ejemplo de varias proteínas posibles, frente a un único ligando donde presenta un forma específica que permite su unión a UNA PROTEÍNA. La forma del ligando hace que solo 1 de esas proteínas se active.
Interacción específica 
Complementariedad del sitio de unión del ligando
Modelo llave cerradura (siglo XIX)
Nos dice que las formas del sitio de unión y del ligando son estrictamente complementarias.
Esto evolucionó, llegando a la conclusión de que las proteínas cambian para adaptarse al ligando (modelo de abajo).
Modelo del ajuste inducido (1958)
En la fase inicial de la unión, la complementariedad es relativamente pobre, pero luego de la unión inicial la proteína sufre un cambio conformacional que “ajusta” la forma del sitio de unión a la del ligando. 
Las proteínas son flexibles, es decir, pueden cambiar su conformación. La unión ligando-proteína provoca el cambio para determinar la actividad de la proteína.
Modelo de selección conformacional
Se dice que hay un equilibrio de formas activas que se interconvierten entre sí, una con mayor afinidad con el ligando que es el que formará el complejo ligando-proteína → MODELO DE SELECCIÓN CONFORMACIONAL (la proteína cambia antes de unirse al ligando).
Complejos proteicos
En la célula las proteínas no están en sc, están en un líquido espeso donde hay pocas posibilidades de “nadar” en ese líquido. Entonces muchas proteínas que requieren de otras para su función, ya se encuentran asociadas → complejos proteicos. 
¿Qué diferencia hay con la estructura cuaternaria? En la estructura cuaternaria, hablamos de subunidades donde no hay actividad por sí solas. En los complejos, las proteínas tienen actividad por sí mismas pero se asocian entre sí para funcionar más rápidamente. 
Consecuencias de la interacción 
· el ligando no se modifica → transporte
· el ligando se modifica químicamente → enzimas
· la proteína sufre un cambio conformacional 
· modificación de la afinidad de otro sitio de unión de ligandos → cooperatividad
· modificación de la conformación del sitio catalítico de una enzima → activación o inhibición alostérica, es decir, se une ligando cambiando la conformación de la proteína y eso hace que el sitio activo cambie mejorando o dejando de funcionar.
Relevancia de los cambio inducidos:
· control de procesos metabólicos 
· regulación de la expresión génica
· control hormonal
Puede expresarse como un equilibrio
Si expresamos la cc de proteína como los sitios de fijación ocupados en relación a los sitios totales, los sitios ocupados consisten en el complejo ligando-proteína mientras que los sitios totales serán la suma cc ligando y cc proteínas libres, reemplazando llegamos a la expresión final. De esta ecuación puedo despejar cc PL y encuentro [L], realizo la curva. 
¿Qué particularidades tiene la curva?
· Si aumento la cc de ligando desplazar el equilibrio, a bajas cc de ligando tengo poca proporción de la molécula formando parte del complejo, mientras que a medida que aumento la cc, obtengo mayor cantidad del complejo ligando-proteína. 
· Alcanza un valor teórico de 1 por ello es una hipérbola rectangular, por más que ponga ∞ cc de ligando libre (no es posible) siempre va haber una proporción de proteína libre. NUNCA LLEGO A OCUPAR TODOS LOS SITIOS, decimos que es saturable. 
· Punto medio: tenemos la inversa de la Ka → cte de disociación, se usa mucho más porque tiene valor de cc de ligando mientras que Ka es inversa de cc. 
Este gráfico nos dice en que orden de cc están los ligandos, tiene que ver con la función de la proteína.
Ej: el antígeno debe reconocer patógeno, muy poco patógeno debe disparar la relación antígeno-anticuerpo, entonces necesito una proteína muy sensible que reconozca el complejo. 
Cuando el ligando es un gas
En este caso el ligando que se une a la proteína consiste en un gas, por lo tanto, no hablamos de cc de ligando sino en presión parcial y sabemos que la cc del gas es proporcional a la presión parcial del gas en fase gaseosa. Trabajamos con la más fácil de medir. 
P50: es la PO2 que me da el 50% de ocupación. 
Proteínas de unión a O2
¿Por qué requiero proteínas de unión? El O2 es muy poco soluble en el plasma y tampoco puede atravesar estructuras de protección (piel, etc) de los organismos superiores. Por ello a su vez requerimos de la respiración. 
El O2 hemoreactivo si lo tengo solo en sc tiende a oxidar todo, por lo tanto, hay que protegerlo para que llegue al extremo del organismo ¿cómo? Unión a un grupo hemo, es un anillo protoporfilinico que coordina un ion Fe2+, el Fe2+ es el único que sirve para transportar O2 y presenta 6 enlaces de coordinación:
· 2 quedan por fuera del plano del anillo del hemo. Cuando entra en la mioglobina hace interacción con el bolsillo y otro con la histidina.
· 2 quedan por dentro del plano del anillo del hemo. 
El Fe2+ une O2 y el Fe3+ no, por lo tanto el hemo no se puede quedar solo uniendo O2 porque sino oxida el Fe2+. 
Otras moléculas que son capaces de unirse al Fe2+ del grupo hemo son CO y NO con mayor afinidad que el O2.
Mioglobina
Para que el O2 que se une al Fe2+ no oxide al Fe2+ del hemo, éste está protegido en una proteína denominada globina. Presenta una forma particular de modo que se dispone alrededor del hemo.
Función: unirse al grupo hemo de modo que sirva para almacenamiento O2, entonces todo gira en torno al hemo central. 
En la imagen de arriba tenemos grupo hemo con 2 residuos de histidina (bolitas rojas), por medio de 1 histidina en posición 93 une el hemo. A la derecha de la imagen está representado el anillo de la histidina, Fe2+, hemo y el O2.
Imagen de la derecha → está la histidina en posición proximal/93 y la histidina distal/67 que coordina la unión del O2. 
Dentro de toda la proteína se pliega en torno al hemo, y las histidinas se encuentran rodeando al grupo hemo para proteger al O2 que no reaccione y no sea reactivo porque sino deja de funcionar. El entorno hidrofóbico de la globina protege al O2 de la oxidación. 
La estructura proteica afecta la unión del ligando
El hemo tiende a formar 1 plano, tenemos el Fe2+ en el centro coordinado hacia una histidina y el O2 que se une de una manera imperfecta. Cuando no hay O2 unido en esa posición hay H2O.
Problema: hay moléculas capaces de unirse mejor que el O2, ej: CO que presenta una afinidad 20.000 veces mayor que el O2 por el hemo libre pero solo 200x por el hemo en la mioglobina, por ello el CO es tóxico. 
Hemoglobina
Es una molécula de almacenamiento, es la reserva de O2 del músculo. Estamos hablando de la proteína de transporte de O2, de los glóbulos rojos el 94% es hemoglobina, por lo tanto su función principal es el transporte de O2 y su forma es particular de manera que atraviese los capilares, difiere enla mioglobina en la cantidad de subunidades que presenta 4. 
La hemoglobina de sangre arterial está saturada en O2 un 96%, mientras que la venosa un 64%. 
La hemoglobina es un tetrámero formado por dos subunidades α (de 141 residuos) y dos subunidades ß (de 146 residuos). La estructura de cada subunidad es parecida a la de la mioglobina, aunque solo tienen 27 aa en la misma posición. La interfase α1-ß1 involucra 30 residuos, la α1-ß2 19, están los monómeros en distintos colores. 
Conformación de la hemoglobina
Puede tener 2 estado diferente, uno R (relajado) con mayor afinidad por el O2 y a su vez, el O2 estabiliza ese estado; estado T (tenso) donde no hay O2 unido y por lo tanto hablamos de desoxihemoglobina. 
En el estado T el anillo del hemo está curvado, como que el Fe2+ no está perfectamente encajado, cuando une O2 fuerza a que el Fe2+ tome la posición central y que el grupo hemo este plano, eso hace que tire de la histidina proximal e induce un cambio de conformación en toda la estructura de la molécula de la hemoglobina. 
El estado T se encuentra estabilizado por mayor número de enlaces iónicos en la interfase α1-ß2 que el estado R. 
Unión cooperativa del ligando
Al hablar de enzimas vemos que tiene un sitio activo y además un sitio de unión de ligando diferente al del sustrato (positivo o negativo). 
En la unión cooperativa el ligando se une al sitio activo implicando un cambio conformacional que favorece un estado activo o inactivo. 
La hemoglobina tiene 4 subunidades diferentes, es decir, 4 sitios de unión de ligando. Si todas las subunidades fueran de alta afinidad veríamos una curva similar a la de mioglobina, si fuera de baja afinidad sería una curva más chata, sin embargo, la hemoglobina presenta un curva sigmoidea ¿por qué? justamente por el centro de cooperatividad:
· Al inicio cuando Hb no une ningún O2 estoy en presencia de baja afinidad.
· A partir de que se une un primer O2 a la Hb, provoca un cambio conformacional en las subunidades de manera que aumenta la afinidad, por ello se observa un salto en el gráfico. 
· Finalmente, en la última parte del gráfico se observa una hipérbola rectangular de alta afinidad. 
Las 2 barras de colores marcan PO2 en pulmones y tejidos, es decir, cuando PO2 es alta Hb puede unir casi todo el O2 donde la pequeña cuña en rosa consiste en O2 no unido a Hb. Cuando la proteína va a los tejidos PO2 es menor y por ello Hb debe poder ceder O2 a los tejidos, entonces en la curva estamos alrededor de situaciones de reposo donde puede ceder O2. Si la Hb fuera una proteína de alta afinidad tendría una curva alta teórico, entonces al llegar a los tejidos Hb no cede O2, en cambio con la afinidad baja tengo la curva de abajo que es funcional porque al llegar a los tejidos vemos que cede O2 pero está desaprovechada por la carga de Hb-O2 es baja. 
Ecuación de Hill
 
Modelos de mecanismo de unión en la unión cooperativa
Modelo concertado: va uniendo ligando gradualmente pero pasa de un estado de baja afinan a un estado de TODO alta afinidad
Modelo secuencial: la unión de un ligando hace que se produzca un cambio conformacional en sitios vecinos. 
Carboxihemoglobina
La unión de CO a una o 2 moléculas de Hb aumenta la afinidad de O2 en las demás subunidades, por lo tanto no entre O2 y perdemos funcionalidad. 
Comparación de las curvas:
La curva normal, y abajo esta cura de carboxihemoglobina uniendo 2 moléculas de CO que al medir PO2 partimos desde la mitad con 50% (muy alta afinidad) de saturación de la curva normal, solamente unimos 2 moléculas O2 y al llegar a los tejidos no cede ni un 10% de O2, esta diferencia no es compatible con la vida. 
Paciente anémico: presenta baja cc Hb por lo tanto transporta O2 eficientemente pero en menor cantidad de PO2, en reposo la actividad de la persona se encuentra relativamente bien. 
Efecto Bohr
Hb frente a la acidez, la curva se corre a la derecha es decir al PO2 en los tejidos, Hb cede mayor cantidad de O2 → EFECTO BOHR. no es un efecto significativo para la mioglobina. 
Cuando la sangre va de los pulmones a los tejidos, el pH inferior hace que se desplace la unión del O2 a las curvas de menor afinidad ¿cómo? CO2 es convertido un 70% en HCO3+ por la anhidrasa carbónica haciendo que disminuya el pH.
 Conclusión, en los tejidos la PCO2 y el pH favorecen la liberación de O2 de la Hb.
En los pulmones PO2 puede desplazar al CO2 y a los H+ de la Hb → EFECTO HALDANE.
El CO2 se une al N-terminal de Hb y forma un derivado con carga (-) mientras que el H liberado se une a histidina de la hélice 3 en la subunidad ß, este residuo protonado a bajo pH forma un par iónico con el Asp FG1, estabilizando el estado T. Entonces se favorece el estado T de menor afinidad por O2. 
2,3-BPG (bisfosfoglicerato)
Se forma a partir de 1,3-BFG, se une entre ambas cadenas ß. Se encuentra en grandes cantidades en el eritrocito y funciona como un efector alostérico de la Hb disminuyendo la afinidad de ésta por el O2. 
Presenta cc altas en altura alta. Además, aumenta en casos de hipoxia y fumadores. 
Un aumento en la concentración de 2,3-BPG disminuye la afinidad de la Hb por el O2 haciendo que se libere a los tejidos 
Hemoglobina fetal
La Hb fetal posee mayor afinidad por el O2 que la Hb materna ya que debe obtenerlo de la sangre de la madre. Posee subunidades γ en vez de ß.
Las subunidades γ no unen 2,3-BPG (cambio Ser x His146 en subunidad ß).
Anemia falciforme: una única sustitución de aa crítica, un ácido glutámico es reemplazado por valina en posición 6 entonces estamos cambiando un aa cargado por uno hidrofóbico. Si la sustitución es por otro residuo no sería tan importante. 
Lo que ocurre es que la Hb permite agregarse para formar fibras tan estables que los GR se deforman, y adoptan forma de Hoz, entonces ya no son plásticos y tapan arteriolas. Estos cúmulos provocan dolor al paciente. 
Una mutación de este tipo lleva a que no persista, aunque la enfermedad persiste por la continuidad de la forma heterocigota entonces algunas moléculas pueden llegar a adoptar esta conformación.
Interacciones antígeno-anticuerpo
Anticuerpo: es una proteína generada por el sistema inmune en rta a un antígeno.
Los antígenos son sustancias que inducen respuesta inmune porque el sistema inmunológico los reconoce como una amenaza. Características:
· exógena, son extrañas al organismo.
· inmunogénicas, es decir, capaces de inducir la rta inmune.
· reaccionan específicamente con componentes del sist. inmune.
· son de naturaleza química variada de gran tamaño molecular
· se localizan en la superficie de un patógeno o son producidas y liberadas por el mismo. 
Epitope o determinante antigénico: zona donde el antígeno se une al anticuerpo
El anticuerpo es una proteína globular, pero si se despliega se conforma de 2 cadenas liviana y 2 cadenas pesadas unidas covalentemente por puentes S-S. 
La unión de una cadena liviana con una pesada forman el paratope que corresponde a la zona de reconocimiento del antígeno. 
Inmunoglobulinas
Un anticuerpo tiene dos funciones claras:
· unir específicamente al patógeno que generó la respuesta inmune.
· reclutar células y moléculas que permitan destruir al patógeno al que se unió el anticuerpo.
Características:
· El dominio variable es el dominio V de unión al antígeno.
· El dominio constante C une otros componentes del sistema inmune 
· La región bisagra le da flexibilidad a la molécula. 
Características de la unión antígeno-anticuerpo:
· Especificidad: capacidad de discriminar al antígeno entre otras moléculas; está dada por la complementariedad entre el antígeno y el sitio de fijación en el anticuerpo.
· Espontaneidad: no requiere de E adicional.
· Reversibilidad: dado por el carácter no covalente de la unión. 
Es una reacción de complementariedad, que ocurre por múltiples interacciones débiles entre una porción del antígeno y AA del sitio de unión en el anticuerpo. 
En el lab nos sirve como molécula de reconocimiento. Sobre un soporte solido se ancla una proteína de interés, se agrega una proteína inerte para bloquearproteínas no especificas, para proteger los sitios libres en el soporte; hacemos la reacción primera que es la especifica, ahora esto es transparente, para ponerlo en evidencia utilizo un segundo anticuerpo que tiene unido una enzima que genera un reacción de color actuando sobre un sustrato para indicar la presencia de proteína. 
El primer anticuerpo no se modifica por una cuestión de costos 
Tener el anticuerpo secundario frente al primario, hace que tenga una zona cte común. Uso un único reactivo general anticuerpo secundario anti anticuerpo primario. 
Técnicas de laboratorio:
1. Western Blotting, se utiliza principalmente para identificación de proteínas. 
2. ELISA, permite la cuantificación de una proteína.
Motores moleculares
Miosina: formada por 6 subunidades, 2 cadenas pesadas y 4 cadenas livianas. Presenta un dominio globular en el extremo N-terminal y posee sitio de hidrólisis de ATP que permite la contracción muscular. 
Filamentos
· la miosina forma los filamentos gruesos. 
· monómeros de actina G polimerizan dando largos filamentos de actina F. 
· la actina F, junto a troponina y tropomiosina forman los filamentos delgados. 
 Organización de la fibra muscular 
Se forman por fusión de células. Las miofibrillas están en el citoplasma de las fibras musculares, se encuentran formadas por la repetición de las unidades contráctiles denominadas sarcómeros.
Cada sarcómero consta de 2 tipos de filamentos, gruesos (conformados por miosina) y delgados (conformados por actina y otras proteínas). 
Sarcómero: es la unidad contráctil conformado por una banda A + banda I. La contracción muscular los discos Z se acercan entre sí y los filamentos de actina se unen al disco Z, en esta unión participa la ⍺-actina, desmina y vimentina. 
En la linea M se organizan los filamentos gruesos, incluyen la paramiosina, proteína C y proteína M; la titina une el filamento grueso a la linea Z
Para la contracción muscular se requiere calcio: en reposo la concentración de Ca2+ es 10-7 M, durante la contracción, 10-5 M				
La titina, es la proteína más grande que se conoce (3000-4000 kDa), está formada por aproximadamente 244 dominios. 
Tipos de fibra del músculo estriado esquelético
· Tipo I: rojas y lentas → Obtienen energía por la vía oxidativa, Fuente de ATP = oxidación de ácidos grasos. Gran resistencia y escasa fuerza			
· Tipo II: blancas y rápidas → Obtienen energía por la vía anaeróbica, Fuente de ATP = glucógeno del músculo. Gran intensidad, poco tiempo. 
Mecanismo de la contracción muscular
1. En el estado de rigidez, la actina está unida a la cabeza de miosina en un ángulo de 45 (4).
2. Cuando se inicia la contracción (1), la miosina une una molécula de ATP y se libera de la actina.
3. La cabeza de miosina posee actividad ATPasa y causa la hidrólisis del ATP (2); los productos de la hidrólisis, ADP y P, permanecen unidos a la miosina.
4. La miosina forma un puente con una molécula de actina (3), en ángulo de 90
5. Una vez unida a la actina, la miosina libera el P. La liberación del P provoca un cambio conformacional en la miosina (golpe de potencia), produciendo el deslizamiento (4) hacia la línea M, que ocasiona el acortamiento del sarcómero.
6. Después del golpe de potencia, la miosina libera el ADP y el ciclo re-comienza.
¿qué es lo que ocurre a grandes rasgos?
· los filamentos gruesos de miosina se deslizan sobre los filamentos delgados de actina
· la miosina está unida a la actina
· por unión e hidrólisis de ATP la miosina se libera de la actina, se mueve y se una a otra molécula de actina. 
Regulación de la contracción muscular
A partir del Ca2+ acumulado en los sarcómeros. Los filamentos de actina se recubren de filamentos de tropomiosina y los sitios de unión de la miosina están bloqueados por la troponina. 
Troponina C: une Ca2+ que por cambio conformacional se desbloquea la troponina I que es la inhibitoria, hace que se permita la interacción de la miosina con el sitio de unión. 
Troponina T: se une a la tropomiosina.