T30 y T31 Regulación del ciclo celular

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REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR
Cap 17 Alberts; Cap 19 lodish
El ciclo celular es una serie de acontecimientos qué ocurre en manera secuencial. Tiene que ver con la división celular. En casa de organismos unicelulares el ciclo celular forma un nuevo organismo. En eucariontes crea células. 
Hay 2 eventos fundamentales: 
-duplicación del material genético
-Segregación del material creado en células hijas 
Ambos eventos requieren de una alta exactitud y precisión para qué las células hijas sean genéticamente idénticas.
Fases del ciclo: G1,S, G2, M. 
G1,S y G2 son la interfase (periodo de mayor duración) 
G viene de GAP (brecha), son fases preparativas.
La fase G1 varía en tiempo según diferentes factores. 
Cuando no se cumplen los requisitos necesarios para iniciar el ciclo celular se dice que la célula está en G0 (estado de reposo para la división), frente a señales particulares adecuadas puede volver a entrar en el ciclo y dividirse.
Mitosis (M): profase (condensación de los cromosomas, los centrosomas se dirigen a los polos de la célula para generar el huso mitótico), prometafase (se desorganiza la envoltura nuclear, metafase (ya está formado el huso mitótico y los cromosomas se ubican en el plano ecuatorial), anafase (los cromátides hermanas migran a cada polo de la célula) ,telofase (se reorganiza la envoltura nuclear y el citoesqueleto de la célula), citocinesis (división del citoplasma)
El ciclo celular está altamente regulado
Hay tres momentos del ciclo (puntos de control) importantes: 
· Start, punto de restricción, punto de inicio (la célula toma la decisión de entrar en el ciclo de división celular. Se censa/controla si el entorno es favorable). Una vez que lo pasa la célula se va a dividir, está comprometida a dividirse.
· Entre G2 y M está la entrada en mitosis. Se controla si el DNA se replica correctamente en la fase S (fase de duplicación). 
· Hacia el final de la fase M en la transición metafase y anafase. Se controla si todos los cromosomas están unidos al huso mitótico para que migren las cromátidas hermanas a cada polo de la célula en la anafase. 
Para controlar cómo se controla el ciclo celular se utilizaron distintos sistemas experimentales (organismos): células animales en cultivo (dan una aproximación mayor a la regulación del ciclo en mamíferos), levaduras (de fisión y de gemación, fueron importantes para encontrar genes que participan en el ciclo), invertebrados marinos, ovocitos y embriones tempranos de Xenopus Laevis (anfibios), estos últimos se usaron para identificar proteínas.. Los resultados entre especies son bastante similares, esto se debe a que los mecanismos generales de control y el panorama general del ciclo son universales y se conservan en todos los organismos porque las proteínas que participan en ellos como reguladoras se mantuvieron evolutivamente y surgieron muy temprano en la historia. 
Componentes clave del sistema de control del ciclo celular
· Complejos CDK ciclinas: Están formados por dos subunidades, una subunidad quinasa dependiente de ciclinas o CDK (en rojo) qué tiene actividad de quinasa y es la subunidad catalítica y fosforila proteínas en su residuo serina o treonina). El otro componente es la ciclina (en verde) que es fundamental para que el complejo tenga función de quinasa, es la subunidad reguladora ya que al unirse a la CDK permite que está tenga actividad y además es quien determinar la especificidad del sustrato que va a ser fosforilado.
La CDK tiene concentración constante y la ciclina es variable (patrón de expresión cíclico). La actividad de todo este complejo es cíclica también ya que depende de la concentración de ciclina. 
 
Complejos CDK ciclinas que intervienen en la regulación el ciclo celular: son 4. Varía la concentración de ciclinas:
En la figura se muestra la concentración de ciclina, la actividad del complejo va a ser paralela a ella 
· CDK ciclina G1/S (celeste) : Comienza a aumentar su concentración antes del punto de inicio y estimula el pasaje por este, tiene un pico y luego disminuye su concentración antes de la fase S
· CDK ciclina de fase S: Comienza a aumentar en G1 tardía, justo antes de la fase S y se mantiene constante hasta la mitad de la mitosis (en la transición metafase-anafase) y luego decae. Esto es necesario para duplicar el ADN
· CDK ciclinas de fase M: Aumenta un poco antes de M, hacia el final de G2 hasta la transición de metafase-anafase
· CDK ciclina G1: Regula el complejo de ciclinas G1/S
Importante ciclinas y CDK de vertebrado (hay que saberlo)
Ciclinas de fase M (ciclinas mitóticas):El experimento está explicando al final del capítulo en el lodish. Las primeras en ser identificadas. Para ello se utilizaron ovocitos de invertebrados marinos (erizo de mar, almeja). Experimento clásico de la biología: experimento in vitro de ovocitos de erizo de mar, los extractos de los ovocitos se pusieron en contacto con espermatozoides de erizos de mar. El lugar medio de incubación se le agrego metionina marcada con azufre 35 para después poder identificar las proteínas marcadas. Se incubaron in vitro y cada 10 min luego del minuto 26 luego de la incubación se tomaron muestras. Luego se corrieron las proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS y se reveló con radiografía y se vieron bandas. Se observa que para la mayor parte de proteínas la concentración aumenta con el tiempo. Sin embargo con la ciclina se observó un patrón cíclico de concentración. Cuando se graficaron los resultados se vio que se repetía un patrón. Además se observó el porcentaje de células en división, al graficarlo se vio que el porcentaje de células en división aumentaba inmediatamente después de aumentó de ciclinas mitoticas. 
Se repitió el experimento para corroborar la actividad de la ciclina con extractos de huevos de xenopus no fecundados que contienen todo lo necesario para un ciclo celular y se los incubaron con núcleos de espermatozoides de xenopus. Se graficó en rojo la actividad de CDK mitótica, que se midió por sí ese complejo tiene actividad quinasa por la fosforilación de algún sustrato, en este caso la histona H1. En azul se graficó la concentración de las ciclinas mitóticas. Se puede observar que van paralelas la concentración de ciclinas mitóticas con la actividad de CDK mitóticas. Se descubrió que las ciclinas mitóticas son limitantes de la velocidad de la mitosis. Tanto la actividad de CDK mitóticos como la concentración de ciclinas mitóticos aumentan antes de que se den los eventos mitóticos tempranos, lo que sugiere que estos complejos son necesarios para impulsar los eventos y luego para salir de la mitosis (eventos mitóticos tardíos)
En celeste los eventos mitóticos tempranos (condensación de los cromosomas, desorganización de la envoltura nuclear, formación del huso mitótico). En naranja los eventos mitóticos tardíos (descondensación de los cromosomas, reorganización de la envoltura nuclear y desorganización del huso mitótico). La raya rosa es la concentración del cdk mitótico y el azul es la concentración de ciclinas mitóticas. Se comprueba que las ciclinas mitóticas son las limitantes de la velocidad de la mitosis. 
(b) Luego se realizó el mismo experimento con los extractos de huevos de xenopus pero tratados previamente con RNAasa (degrada el RNA) en una concentración tal que solo se degrada RNA mensajero. Se observó que al agregar los núcleos de espermatozoides no aumenta la concentración de ciclinas ( y por lo tanto la actividad del complejo es nula). Es lo mismo haber agregado un inhibidor de la síntesis proteica. 
(c) El otro experimento era un extracto tratado con RNAasa y se le agregaba el RNA mensajero de la ciclinas mitóticas de tipo silvestre. Nuevamente, recuperaba el aumentó de ciclinas de tipo M y la actividad del complejo CDK de fase M , además se recuperaba la actividad de los eventos tempranos y tardíos. Las ciclinas mitóticas son la proteína crucial cuya síntesis se necesita para qué la célula pueda regular la actividad de la CDK mitótica 
(d) Otro experimentofue con un extracto tratado con RNasa y se le agrego mRNA de ciclina mitótica no degradable, por lo tanto ante el agregado de los núcleos de los espermatozoides aumenta la concentración de ciclina mitótica y la actividad del complejo, pero está se mantiene estable con el tiempo (No disminuye). Son evidentes los eventos tempranos pero no los tardíos.
La conclusión fue que la entrada en mitosis requiere la acumulación de ciclina mitótica pero la salida de mitosis requiere su degradación. 
Todo esto llevó a estudiar la estructura de ciclinas, que son similares pero no idénticas. 
Todas las ciclinas mitóticas tienen una secuencia especial llamada caja de destrucción de ciclinas. Las mutaciones en esta secuencia dan lugar a una ciclina no degradable (como en el experimento d)
Cómo se degradan las ciclinas? Tenemos el complejo CDK y una ubiquitina ligasa particular añade restos de ubiquitina a la ciclina y esa señal de poliubiquitinación la marca para su degradación. Las dos señales más importantes de degradación son la SCF y la APC/C o ciclosoma. La poli ubiquitina ligasa reconoce a la caja de degradación y poliubiquitiniza a la ciclina para que entre en proteasomas. 
En el ciclo celular hay dos transiciones dependientes de proteolisis mediadas por degradación proteica (irreversible): impulsan el ciclo hacia adelante.
· Transición de G1 a S: mediada por ubiquitina ligasa SCF (formada por 3 subunidades). Tiene como sustratos a las ciclinas de G1-S y degrada a un inhibidor de complejo de ciclina de fase S. 
· Transición metafase-anafase: mediada por el APC o ciclosoma, tiene varios sustratos, uno es una proteína que mantiene unidas las cromátidas hermanas (cuando se degrada estas se separan), otro son las ciclinas de fase S y M. 
Bases estructurales de activación de las CDK:
· Unión a la ciclina (sin ella la CDK es inactiva ya que tiene una conformación tal que hay una porción de la proteína llamada asa T o bucle T qué bloquea al sitio activo de la proteína, en dicha conformación los sustratos no se pueden unir y por lo tanto la kinasa permanece inactiva, cuando se une la ciclina cambia la conformación del complejo y el bucle T se desplaza, de manera tal que el complejo tiene actividad, sin embargo, no es totalmente activo, es parcialmente activo, tiene cierta actividad fosforilante pero no es lo óptimo. Para que sea totalmente activo tiene que haber otro cambio en la conformación, este se da con la presencia de fosforilaciones, hay una quinasa activadora de CDK (CAK) qué fosforila a la CDK en un residuo del bucle T, este grupo fosfato cambia ligeramente la conformación de la proteína y hace que esta sea totalmente activa.)
Además de la unión a la ciclina y la fosforilación, tenemos regulación negativa. Los mecanismos por los cuales se ve inhibida la actividad del complejo CDK ciclinas son fosforilaciones inhibidoras (se producen en sitios diferentes a donde se fosforila para activar), la quinasa que inhibe al complejo CDK es la quinasa Wee1. A su vez esa fosforilación inhibitoria es reversible gracias a la fosfatasa Cdc25 que quita el fosfato inhibidor. Este proceso es fundamental para activar el complejo CDK de fase M. 
El otro mecanismo que regula negativamente los complejos de proteína CDK son las proteínas inhibidoras de CDK, las CKI, que inhiben al complejo aunque este este unido a la ciclina y al fosfato. 
Un ejemplo de CKI es el de la imagen. Tenemos la proteína inhibidora P27 que inhibe el complejo. Este mecanismo mediado por inhibidores es importante para la regulación del complejo CDK G1/S y del complejo CDK de fase S. 
Hay ciertos momentos del ciclo donde la célula censa ciertas cosas para ver que todo esté en orden para poder seguir adelante con el ciclo: 
Lo primero que se chequea es la presencia de un medio extracelular favorable (que estén presentes los factores que inducen la proliferación, como la vía de MAP kinasa). En distintos momentos del ciclo se controla si hay daño al DNA, luego se controla si hay cromosomas no unidos al huso. 
Control de la transición G1/S en mamíferos: Regulada por dos proteínas: Rb (proteína del retinoblastoma) se une a E2F qué es una familia de factores de transcripción y la bloquea por lo tanto actúa como factor inhibidor de la transcripción. Además Rb actúa como represor de la transcripción, ya que recluta proteínas modificadoras de la cromatina que inducen la heterocromatinización.
Cuando la célula está en G0 sin señales mitógenas Rb está unida a E2F. Además de no dejarlo actuar, la Rb recluta proteínas modificadores de la cromatina (metilasas, acetilasas que inducen la heterocromatización) y bloquea la transcripción de esos genes. 
Cuando hay mitógenos o factores de crecimiento se desencadena la vía de las MAP kinasas que estimula la proliferación y esta termina en que se activa el complejo Ciclina CDk de fase G1/S que fosforila a Rb en muchos sitios (la hiperfosforila), entonces Rb se separa de E2F y comienza la transcripción de los RNAm que codifican por ejemplo para la ciclina E o A. Luego pasamos al complejo qué va a dar inicio a la fase S y se da inicio a la duplicación del DNA y de los centrosomas. Esto se conoce como la regulación de punto de inicio, start o restricción. Algunos genes que se activan son genes de respuesta temprana y otros de respuesta retardada que estimulan el avance en el ciclo celular. 
Para que se activen los genes de respuesta retardada tiene que haber síntesis de proteínas. Esto sugiere que una vez que los genes de respuesta temprana se sintetizan (los ARNm que se traducen a proteínas) las proteínas activan los genes de respuesta retardada. 
 
Serie de eventos como respuesta a un mitógeno o factor de crecimiento: 
· Activación de factores de transcripción preexistente (por fosforilación o proteolisis de un inhibidor)
· Los factores de transcripción activados en el núcleo estimulan la expresión de genes de respuesta temprana (síntesis del RNA m son c-fos, c-jun y c-myc)
· Los ARNm correspondientes a los genes de respuesta temprana salen del núcleo y son traducidos a sus correspondientes proteínas (FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN C-FOS, C-JUN Y C-MYC)
· Los factores de transcripción C-FOS y C-JUN entran al núcleo y estimulan la expresión de genes de respuesta retardada (RNAm) 
· Los ARNm correspondientes a los genes de respuesta retardada salen del núcleo y son traducidos a sus correspondientes proteínas (PROTEÍNAS NECESARIAS PARA LA PROGRESIÓN A TRAVÉS DEL CICLO DE DIVISIÓN CELULAR, como las ciclinas y las CDK)
La estimulación de la transcripción de genes es secuencial para impulsar a la otra fase. 
Los factores E2F tienen la capacidad de regular su propia transcripción, por lo que toda la célula se realimenta y aunque se retiren los factores de crecimiento y mitógenos la célula se divide igual. 
Ingreso en fase S: replicación del DNA
· Los cromosomas eucariontes se replican a partir de varios orígenes de replicación
· La replicación del DNA en los distintos orígenes, comienzan en distintos momentos durante la fase S
· Cada origen comienza la replicación sólo una vez por fase S 
· La replicación de todos los orígenes da como resultado la replicación de todo el DNA cromosómico 
Se mantiene el número correcto de genes a medida que las células proliferan.
Mecanismos moleculares:
Como se activa el complejo Ciclina CDK de fase S qué tiene qué fosforilar sustratos importantes para la replicación del DNA: El complejo Ciclina CDK de fase S está preformado en la etapa G1 pero está inhibido porque está unido al inhibidor sic1, sí hay mitógenos y la célula es inducida a atravesar el punto Start, el complejo ciclina CDK de fase S va a fosforilar a ese inhibidor y la fosforilación lo marca para su degradación proteasomal (SCF), está sería la primera degradación proteolítica, cuando es degradado el sic1 queda libre y activo el complejo CDK de fase S. La inhibición del inhibidor marca una irreversibilidad. El complejo de fase S activo genera la transcripción de genes que participan en el ciclo celular. 
En G1 tardíase encuentran formando los complejos pre replicativos en los orígenes de transcripción. Cuando se activan los complejos ciclina CDK de fase S se incorporan nuevas proteínas, entre ellas la helicasa y se forma un complejo de pre replicación. Se replica el DNA y tenemos 2 copias de cada cromosoma, una vez que concluye la fase S entramos a la fase M, previo a eso se activan los complejos ciclina CDK de fase M. En ella ocurre la segregación cromosómica, es decir, se reparte cada cromatide hacia cada polo de la célula.
Cuando todavía hay actividad de CDK tenemos a los orígenes de replicación unidos a un complejo proteico ORC (complejo de reconocimiento del origen). Esto sería en el final de la mitosis o fase G1 temprana, cuando comienza a bajar la actividad de la CDK. Cdc6 y Cdt1 se unen al ORC, formando el complejo pre replicativo. En G1 tardía cuando la célula tiene un medio extracelular favorable como para dividirse se activa la CDK de fase S y otras proteínas, 
como la CDK heterodimérica, ambos complejos proteicos fosforilan a los activadores de la helicasa que cuando están fosforilados pueden unirse a las helicasas en los orígenes de replicación y estimular a la actividad helicasa. Esa fosforilación hace que Cdc6 y cdt1 se desprendan del complejo proteico ya que no son necesarias, la primera es degradada y la segunda es dividida. 
En cada origen se replica el DNA hasta replicar el DNA completo de la célula. 
T31: Regulación del ciclo celular clase II 
 	
La figura representa lo mismo que las figuras anteriores de manera más simplificada. Muestra cómo se forma el complejo pre replicativo con el ORC asociado los orígenes de replicación, los factores de iniciación (Cdc6 y Cdt1) y cuando se activan los complejos kinasa CDK de fase S el complejo activo fosforila a varios de esos componentes. Cdc6 al ser fosforilado es degradado. Cdt1 es inhibida por otra proteína llamada geminina que la secuestra. Esto hace que no se pueda formar el complejo pre replicativo devuelta hasta que se complete el ciclo de división termine. También muestra el complejo de preiniciación como todo un complejo grande formado por muchas proteínas que se fosforilan al igual que las helicasas y esto favorece el inicio de la replicación. 
Una diferencia del alberts respecto al lodish es que el Alberts muestra que los complejos ORC también se fosforilan y eso también evitaría el reinicio de la replicación por qué recién se van a desfosforilar al finalizar la mitosis y al entrar a la nueva fase G1 cuando las ciclinas CDK se desactivan. 
Cuando hablamos de replicación del DNA de fase S además de duplicarse correctamente el DNA debe duplicarse la cromatina. La porción del genoma que está como eucromatina (fácilmente transcriptas) y otras que están como heterocromatina. Es importante que se herede el patrón de la cromatina ya que de esto depende la transcripción génica. 
También en la etapa S los complejos ciclina CDK de fase S además de estimular la replicación del DNA estimulan la síntesis de proteínas de la cromatina, por ejemplo las histonas y las proteínas no histónicas. Esas proteínas de la cromatina son ensambladas por factores de ensamblaje formando los nucleosomas. 
Esto se produce en la misma horquilla de replicación, haciendo el proceso más complejo. 
Para poder heredar los patrones de la cromatina deben acudir a este sitio proteínas modificadoras de la cromatina y proteínas asociadas a la cromatina. 
	Además de replicar el DNA y la estructura de la cromatina, algo muy importante es que las hebras duplicadas en el periodo S se tienen que unir. Las cromátidas hermanas van a permanecer unidas, no sueltas. Esto se logra gracias a un complejo multiproteico llamado complejo cohesina. Dicho complejo une las cromátidas hermanas en toda su longitud antes de la etapa de anafase. 
El complejo de cohesinas está formado por cuatro subunidades: 2 de esas subunidades la Smc3 y Smc1 son proteínas que forman parte de la familia de proteínas SMC qué significa mantenimiento estructural de los cromosomas, estas proteínas tienen dos hélices enrolladas y en un extremo un dominio denominado bisagra y en el otro extremo un dominio ATPasa. Estos dominios son unido o cerrados por otras subunidades proteicas que son la Scc3 y Scc1. La estructura de la cohesina tiene forma de anillo. 
Lo que se postula es que sería una exprese de abrazadera que abraza las cromátidas hermanas y las mantiene unidas. Este proceso de cohesión es esencial para qué las cromátidas luego se segreguen correctamente a cada polo de la célula. Antes de la fase S las moléculas de cohesinas se van a unir de manera lateral a la molécula de DNA (cromosoma), en este estadio las moléculas de cohesina no son activas. Cuando se entra en fase S intervienen proteínas llamadas factores de carga de cohesinas y se van formando los anillos que abrazan las cromátidas hermanas. Desde que termina la fase S, en G2 y hasta el principio de la mitosis las cohesinas juntan las cromátidas hermanas todo a lo largo. Sin embargo, al principio de la Anafase este complejo proteico llamado por una proteína llamada yugoyina y la fosfatasa PP2A es reclutado a la llama del centrómero. Entonces cuando se activan los complejos quinasas CDK de fase M y también se activan otras cinasas adicionales llamadas polo y aurora B que fosforilan a las cohesinas libres que no están protegidas por el complejo proteico, entonces al ser fosforiladas se liberan de los cromosomas y solo tenemos cohesión al nivel del centrómero. 
Entramos entonces en la mitosis por la activación previa de los complejos ciclina CDK de fase M por fosforilación. Se va a acumulando cicilina M por transcripción del gen, la CDK se quiere une a la ciclina pero tiene baja actividad, luego es fosforilado por dos tipos de quinasas, una activadora (CAK) qué fosforila en el sitio activador (el bucle T), también existen las quinasas inhibidoras (Wee1) donde la fosforilación mediada por estas quinasas disminuye la actividad. Por más qué el fosfato activador este presente, sí está el fosfato inhibidor el complejo está inhibido. En la transición G2/M se va acumulando el complejo fosfarilado activado en el sitio activador y en los sitios inhibidores. Se acumula pero es inactivo, se activa justo antes de entrar en mitosis cuando la fosfatas Cdc25 qué se activa por fosforilación y desfosforila a nivel del fosfato inhibidor (los quita). Ahí tenemos al complejo ciclina CDK-M completamente activo. Este complejo ciclina CDK una vez qué se activa tieene la capacidad de inhibir a la quinasa Wee1 (retoalimentación positiva) y también estimula la fosforilación de Cdc25 activandola (retroalimentación positiva)
La desfosforilación es más rapida qué la fosforilación.
Una vez qué se activna el complejo ciclicna CDK de fase M está fosforilan sustratos qué sirven para los eventos mitoticos. 
Los eventos mitoticos tempranos son: 
· La desorganización de la envoltura nuclear. 
· La formación del huso mitótico 
· La condensación de los cromosomas 
Los eventos tardios son los contrarios a los tempranos. 
Como se producen los eventos mitóticos tempranos? 
1) desorganización de la envoltura nuclear
 Está involucrada la fosforilación demuchas proteínas. Hay fosforilación de las laminas nucleares (una especie de malla o red de filamentos intermedios qué se encuentra en contacto con la envolutra nuclear interna). Los monómeros qué constituyen fibras son las proteínas laminas A, B y C y se forman los filamentos intermedios. Cada filamento de laminina está formado por un tetramero de laminas, Cada tetramero está compuesto por 2 dimeros de laminina superenrollados qué se asocian cabeza con cabeza o cola con cola. Cuando esa estrcutura es fosforilada por la CDK mitótica es fosforilado el residuo de serina proximo a los extremos y la estructura se desarma. 
Otras proteínas qué se tienen qué fosforilar para desarmar la estructura son las nucleoporinas, su fosforilación permite qué se disocien los complejos de poro. También se fosforilan proteínas estructurales de la membrananuclear interna qué está conectada con la cromatina, por lo qué la afinidad de las proteínas con la cromatina y por las laminas disminuye al ser fosforiladas: Todo esto se comienza a retraer hacia el REG y se desarma la envoltura nuclear. 
2) Formación del huso mitótico: 
Cuando la célula entra en division los mcrotubulos del huso mitotico cambian drasticamente. Las estructuras qué se organizan en el ensamblaje de los microtubulos son los centrosomas, previo a la formación del huso mitotico se duplican los centrosomas (etapa S), A partir de los dos centrosomas duplicados se organizan las estructuras del huso qué está fomrado por tres tipos de micrtoubulos (estrucutras polares, los extremos menos están localizados a nivel del centrosoma y los más se alejan del centrosoma.): 
· Astrales:Desde el centrosoma hacia la corteza celular 
· Cinetocoricos: Une cinetocoro con centrosoma (fundamental, las cromatides hermanas cuado la célula está en metafase tiene qué estar bien orientada.) 
· Interpolares:no unen cromosomas, se deslizan entre sí los que vienen de un polo y otro
Como se forma el cinetocoro durante la mitosis? La causa de que se forme esta estructura es que la CDK-M fosforila proteínas asociadas a microtubulos (MAPS) y fosforilación de proteínas motoras dependientes de microtubulos.
Duplicación del centrosoma: Durante la fase S, previo a la mitosis. El complejo ciclina CDK de fase G1-S fosforila múltiples componentes del centrosoma (Como los centriolos y la matriz pericentriolar junto con sus proteínas), la fosforilación de las proteínas favorece la duplicación del centriolo y la acumulación de la matriz. Entre G2 y M se produce la separación de los centrosomas hijos. El huso se ensambla por proteínas motoras (minimo 4 tipos). La dineina camina hacia el extremo menos se encuentra unida a algun componete de la corteza celular. Al caminar tira de la corteza hacia el poro y separa los centrosomas. Las quinesinas caminan al extremos más y favorecen el contacto del cromosoma con el extremo más. La quinesina 5 tiene dobke motor y camina hacia el extremo más favoreciendo el deslizamiento de los microtubulos de manera tal qué se tiene a separar los polos. La quinesina 14 camina hacia el extremo menos a diferencia del resto y acorta el polo. 
3) Condensación de los cromosomas: 
Se produce porque los complejos ciclina CDK de fase M fosforilan distintas subunidades de un complejo llamado CONDENSINA qué tiene proteínas de mantenimiento estructural de los cromosomas, forman una especie de estructura de anillo cerrado por proteínas. diferentes. Se postula qué a través del dominio ATPasa se genera energía para enrollar los complejos y ese proceso hace qué se acorte. 
Además de condensar la cromatina estas proteínas intervienen en la resolución de las cromatides hermanas. 
Los cromosomas se unen a nivel del cinetocoro al huso mitotico. El cinetocoro tiene tres capas y se forma a nivel del centromero (secuencia especifica de DNA sobre la cual se forma el cinetocoro). Hay sitios especificos de unión al microtubulo, la cantidad de microtubulos qué se unen a cada cinetocoro varia según el organismo. El extremo del microtubulo qué conecta con el cinetocoro es el exteemo más. hay una especie de anillo qué rodea al micrtoubulo y permite qué este se pueda polimerizar y despolerimerizar. 
El cinetocoro no es simplemente una placa, viene de una estructura alargada que tiene un anillo que rodea el microtúbulo, de manera tal que permite al microtúbulo en ese sitio polimerizar y despolimerizar. Es importante esto ya que al producirse la anafase, la fuerza que generan los microtubulos despolimerizándose, se arquean hacia el extremo – y la fuerza de tracción lleva al cinetocoro hacia el polo.
Las cromátides hermanas y sus cinetocoros tienen que estar biorientados: hacia polos opuestos. Se cree que se produce por ensayo y error. En principio el cromosoma se une de manera lateral al microtúbulo, hasta que en determinado momento la unión lateral se hace unipolar (una sola cromatide). Luego el cinetocoro libre captura microtúbulos que proceden del polo opuesto y se forma el cromosoma biorientado. 
El cromosoma en metafase tiene las cohesionas en el centrómero nada más; esas cohesinas tienden a juntar las cromátides hermanas. El microtúbulo que viene del huso por acción de la dinámica propia del huso, va a intentar llevar el cromosoma hacia su polo: ocurre en ambos polos, el cromosoma queda en el medio (plano ecuatorial) pero con una fuerza de tensión generada por los microtúbulos. Esta tensión es censada por la Aurora B, esto es un punto de control importante. 
Excepto esta situación de tensión, todo el resto de las uniones relacionadas a microtubulos son inestables, por lo cual rápidamente se desarman. Sólo es estable la tensión en el plano ecuatorial.
Una vez que todos los cromosomas están bien orientados en la placa ecuatorial (metafase) puede tener paso la anafase, proceso en el cual se segregan los cromosomas. Lo que dispara la anafase es que se rompen las moléculas de cohesina que unen las cromátides hermanas, por una enzima separasa que corta a la Scc1. Ahí corren hacia los polos cada cromátide. Esto sólo puede ocurrir si NO tengo cromosomas libres.
El complejo APC/ciclosoma tiene actividad ubiquitina ligasa y produce degradación de proteínas. Para actuar debe estar unida a un cofactor que es factor de especificidad, me dice exactamente qué degradará. El cdc 20 se une como cofactor y se degrada la segurina/securina, la cual estaba unida a la separasa (inactivandola). Cuando el complejo APC/ciclosoma + Cdc20 degrada la segurina, entonces la separasa corta la Scc1 y se liberan las cromátides hermanas. ¿Por qué se activa este complejo, en ese momento? Por un lado, en ese momento del ciclo aumenta la expresión del Cdc20 por aumento de transcripción. El complejo Cdk-mitótico tiene como sustrato la APC/C la cual al fosforilarse se vuelve activa. 
El proceso por el cual se separan las cromátides hermanas es la anafase. Se puede dividir en anafase A y B; son independientes y simultáneos (A arranca antes igual). La anafase A consiste en la despolimerización de los microtúbulos y la anafase B en la participación de proteínas motoras. En su conjunto, promueven la tracción de las cromátides hermanas hacia polos opuestos de la célula. La anafase A se produce por acortamiento de los microtúbulos cinetocóricos, generando fuerzas que llevan los cromosomas a lados opuestos. En la anafase B, el deslizamiento entre los microtúbulos interpolares hace que se separen y también hay una fuerza de arrastre desde los polos. Participan principalmente la quinesina 5 que camina hacia el extremo -, entonces lo que hace es deslizar dos microtúbulos y separándolos; y la dineína que camina al extremo -, llevando todo al polo de la célula. 
Los eventos tardíos de la mitosis / salida de la mitosis.
· Desensamblaje del huso mitótico.
· Descondensación de los cromosomas.
· Reorganización de la envoltura nuclear.
· Reorganización del RE y Golgi 
Todo por inactivación de las CDK-M y desfosforilación de los sustratos que habían sido fosforilados por estas.
¿Cómo se inactivan las CDK-M? El mecanismo principal es la degradación de la ciclina mitótica. Por otro lado, aumenta la síntesis de inhibidores de la CDK (los CKI). ¿Quién degrada la ciclina mitótica? El APC/C con el cofactor Cdh1 (mitosis tardía), en coordinación temporal con APC/C con el cofactor Cdc20 (mitosis temprana). La CDK multifosforila al APC, que se une a Cdc20 y atacan la segurina. También tiene como sustrato fosforilar a Cdh1, inhibiéndolo. Cuando avanza la mitosis, una fosfatasa (depende de la especie el nombre) le quita el fosfato a Cdh1 y eso permite que actúe. 
El reensamblaje de la envoltura nuclear va a relacionarse con la desfosforilación de todo lo fosforilado anteriormente. Cada cromosoma va a estar rodeado de una membrana emitida por el RE, que luego se unen todos y se forman los complejos de poro nuclear y las láminas nucleares. 
La citocinesis es la división del citoplasma;se da por un anillo contráctil formado por actina y miosina II en el medio de la célula. La proteína GTPasa Rho cuando está unida GTP y se activa, va a unirse a formina (implicada en formación de actina) y promueve el ensamblaje de filamentos de actino en la zona del anillo contráctil. Por activación de otras quinasas activadas por Rho, se fosforila la cadena ligera de la miosina, activándola y haciendo que interactúe con la actina para contraer el anillo.
En un principio, ocurre la fosforilación de la cadena liviana de la miosina en un sitio inhibidor, porque recién arranca la mitosis y no se puede separar la célula todavía. Pero otra quinasa la fosforila en un sitio activador, a pesar de que se mantiene inhibida. En la anafase tardío, por acción de APC desaparece CDK-M y aparecen fosfatasas, que sacan el fosfato inhibidor y permite activar la cadena liviana de la miosina y la contracción, entonces, del anillo contráctil.
¿Cómo determina el huso mitótico el lugar de la división? Hay tres modelos; dicen que determinados componentes del esqueleto mandan señales a la célula para determinar el lugar correcto de citocinesis. Modelo de estimulación astral (más o menos en la mitad entre centrosomas), el modelo de estimulación del huso central (la señal es emitida por los microtubulos interpolares que se interdigitan en la mitad de la célula, lo que envía señal a la corteza) y el modelo de relajación astral (postula que a nivel de los poros, los microtubulos astrales mandan información de relajación máxima en los poros, generando máxima tensión en el centro de la célula).
MECANISMOS DE VIGILANCIA O PUNTOS DE CONTROL EN LA REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR.
Son diferentes mecanismos que verifican que cada etapa se cumpla correctamente y que las conidicones internas y externas sean adecuadas para que la célula avance en el ciclo. La célula para, censa todo y toma la decisión de detenerse y reparar problemas, y sino avanzar.
Se controlan:
· El crecimiento celular / presencia de señales extracelulares (medio extracelular favorable) En unicelulares es presencia de nutrientes, en pluricelulares es factores de crecimiento.
· La correcta replicación del DNA.
· El daño en el DNA.
· La unión de los cinetocoros al huso mitótico, ver que estén biorientados.
· La posición del huso dentro de la célula.
El primer punto de control es el punto START/ de inicio / de prohibición. (explicado clase pasada).
El daño del ADN se controla todo el tiempo, pero principalmente en G1 tardío y S. Puede haber distintos tipos de daños en el DNA: dobles roturas (grave, puedo perder material genético), horquillas de replicación detenidas, apareamientos incorrectos del DNA, etc. Todos esos daños se regulan por dos proteínas quinasas: ATM y ATR.
Cuando estas proteínas detectan algún daño, activan otra serie de quinasas: Chk1 y 2. Estas van a dar la respuesta mediante la inhibición de cdc25, que desinhibe la CDK. En consecuencia, CDK se mantiene inhibida, detengo el ciclo si necesito reparar algo. Por otro lado, activa mecanismos de reparación en la célula. Existe un tercer mecanismo que es la activación de la proteína p53. Se conoce como proteína supresor de tumores: por la función que tiene, inhibe la formación de tumores, excesiva proliferación. Cuando se activa frente al daño de DNA, va a aumentar la transcripción de p21 que inhibe CDK en cualquier punto del ciclo. Si el daño no se puede reparar, induce apoptosis ya que es mejor para un organismo pluricelular perder una célula que reproducirla con anomalías. Cuando hay ausencia de daño en el DNA, p53 está en muy baja concentración porque mdm 2 la inhibe. Si hay daño, las quinasas Chk2 y 1 fosforilan el inhibidor y la proteína queda activa para actuar como es necesario.
El último punto de control es el de unión de cromosoma al huso; se chequea que estén unidos y biorientados. (ya lo vimos!!). Este punto de control tiene lugar ANTES de entrar en anafase. 
Cuando hay cromosomas que están incorrectamente unidos, se detecta falta de tensión que va a impedir la transición a Anafase. La proteína más importante es la Mad 2 (y otras proteínas adicionales) que se asocia al cinetocoro que no está unido al microtúbulo y todo ese compleja secuestra Cdc20. Sin Cdc20 en la APC, esta última no puede degradar las cohesinas y se frena la transición a la anafase hasta que todos los cromosomas estén correctamente biorientados. Cuando la tensión es adecuada, todo sigue su ciclo normal. Si este punto de control falla, se segregan mal los cromosomas; si se produce antes de tiempo la anafase, tenemos células hijas con cantidades anormales de cromosomas, generando las llamadas anomalías cromosómicas.