Informe de laboratorio cocos grampositivos

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LABORATORIO DE INFECTOLOGÍA
 
 
COCOS GRAM POSITIVOS: ASPECTOS PRACTICOS
 
INTEGRANTES:
MARÍA GABRIELA SIERRA DIAZ | 
MARIA ISABEL GUARDIAN VEGA | 
DIEGO ANGEL LOPEZ SAES | 
VALENTINA ESCOBAR SUAREZ |
PAULA RUEDA |
 
 
DOCENTE: YICETH ACOSTA
 
 
MEDICINA
 
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
SEDE VALLEDUPAR
2022
MATERIALES
· Asa bacteriológica.
· Escobillones.
· Mechero de Bunsen. 
· Agar Sangre.
· Peróxido de Hidrogeno.
· Portaobjetos.
· Agar manitol salado
· Agar con medio solido de ADN.
· Tubos de ensayo.
· Plasma citrato.
· Discos de Novobiocina.
· Discos de Bacitracina.
· Discos de Optoquina.
· Tubos de agar bilis esculina. 
· Caldo salado.
· Cepas bacterianas.
· Papel secante.
· Agua destilada.
· Colorantes de tinción de Gram.
· Microscopios. 
· Aceite de inmersión. 
INTRODUCTION
Biochemical tests are essential tools used to identify and classify microorganisms, including Gram-positive cocci bacteria. These tests involve observing how bacteria react to specific substances or conditions, providing valuable insights into their metabolic processes and characteristics. In the case of Gram-positive cocci bacteria, these tests help differentiate between various species, aiding in accurate identification and subsequent treatment strategies.
Through biochemical tests, we can assess factors such as enzyme activities, fermentation patterns, and metabolic pathways. These tests often involve observing color changes, gas production, or other visible indicators, which help microbiologists determine the bacteria's capabilities and potential virulence.
By understanding the unique biochemical profiles of different Gram-positive cocci bacteria, we can not only diagnose infections more precisely but also gain a deeper understanding of their behavior and potential antibiotic susceptibility. This knowledge is vital for healthcare professionals in making informed decisions for patient care and public health measures.
This is an algorithm that shows some of the most important tests to identify grampositive cocci:
 Fig 1
PROCEDIMIENTO
Estudiar requerimientos atmosféricos y nutricionales.
Realizar pruebas bioquímicas que permiten identificar el género y especie bacteriana.
Estudio de la morfología macroscópica y microscópica de la cepa.
Genero Staphylococcus
Prueba de la catalasa: La finalidad de la prueba es separar la familia Micrococcoceae (catalasa +) de los géneros Streptococcus y Enterococcus. 
Se colocó una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luego se transfirió una porción de colonia sobre el H2O2 realizándose una emulsión. La prueba se realizó con las colonias de S. epidermidis, S. pyogenes y E. faecalis. El desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva. 
	
Fig 2
Prueba de coagulasa: Permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genéricamente se denominan coagulasa negativos.
Se emulsionaron tres colonias (S. aureus, S. saprophyticus y S. haemolyticus) con 0,5ml de plasma citratado en un tubo diferente cada una. Se incubo a 35º y se chequeo la formación del coágulo a las 24 horas. Si se observa la formación de coagulo es positivo. 
Fig 3
Prueba de DNAasa: Permite diferenciar S. aureus que es la única especie dentro del Género Staphylococcus que posee DNAsa de las otras especies.
Se dividió el agar en dos partes trazando una línea con el asa caliente, en una parte se sembró S. epidermidis con el escobillón formando múltiples líneas en varias direcciones (fue un error) y en la otra parte se sembró S. aureus con el asa formando una línea (procedimiento correcto). El agar era una placa de medio solido que contenía ADN. Luego se incubo por 24 h a 35°. 
Si se forma un halo transparente (cambio en el agar) alrededor de la siembra la prueba es positiva.
	
Fig 4
Susceptibilidad a la Novobiocina: Separar S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa negativos. 
Se dividió en dos partes una placa de agar sangre, igual que en el procedimiento anterior, en una parte se sembró S. saprophyticus y en la otra S. epidermidis. Luego se aplicó el disco de novobiocina y se incubó a 35º por 24 horas. 
Fig 5
Prueba de fermentación del manitol en el agar-manitol salado: Tambien se dividió el agar en dos mitades, en una se sembró S. aureus y en la otra S. epidermidis. 
Este es un medio altamente selectivo para aislamiento de estafilococos patógenos en cultivos mixtos. 
	
v
Fig 6
Genero Streptococcus
 Prueba de Hemolisis: Se tomo una placa de agar sangre y se dividió en tres partes con un asa caliente, en una parte se sembró S. viridans, en otra S. pyogenes y en la otra parte Enterococcus faecalis. Esta prueba tenía la finalidad de revelar el patrón de hemolisis de cada microorganismo para luego clasificarlos como alfa hemolíticos, beta-hemoliticos y ganma-hemoliticos.
	
Fig 7
Sensibilidad a la bacitracina: Su objetivo es separar el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos betahemolíticos. 
Se dividió igualmente la placa de agar sangre en dos partes, en una se sembró S. pyogenes y en la otra S. agalactiae. En estos casos se realiza sembrando un gran inóculo, tomado con un isopo del cultivo puro, que se estría sobre una placa de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo confluente. Finalmente se colocaron los discos de bacitracina y se incubo a 37° por 24 h.
	
Fig 8
Fig 9
 Prueba de bilis esculina: Su objetivo Separar los estreptococos del grupo D de los demás grupos de estreptococos. 
Se realizó un sembrando en superficie de tubos de agar bilis esculina inclinado. En un tubo se sembró S. viridans y en otro tubo se sembró E. faecalis (durante el procedimiento se rompió uno de los tubos). 
 El ennegresimiento del medio indica prueba positiva.
Fig 10
 Prueba de CAMP: Se realizo estriando dos cultivos de estreptococo ß-hemolítico (S. pyogenes y S. agalactiae) en forma perpendicular a una estría de un estafilococo productor de ß-lisina (S. aureus) en agar sangre. Se incubo por 24 horas a 37ºC.
Fig 11
 Prueba de tolerancia a la sal (caldo salado): Se inoculó el caldo salado con las dos cepas de Streptococcus del grupo D a estudiar (S. viridans y E. faecalis) en dos tubos diferentes cada una y se incubo por 24 horas a 35º.
	
Fig 13
Fig 12
 Sensibilidad a la optoquina: Se realizo el mismo procedimiento mencionado en las pruebas de sensibilidad a antibióticos descritas anteriormente. En una parte del agar sangre se sembró S. viridans y en la otra S. agalactiae. Luego se colocaron los discos de opto quina y se incubo por 24 h a 37°.
El objetivo de esta prueba era diferenciar S. pneumoniae (sensible a optoquina) de otros streptococcus a-hemoliticos, pero no se disponía de esta cepa en el laboratorio. 
	Fig 14
Fig 13
RESULTADOS 
GENERO: Staphylococcus 
	
	Staphylococcus saprophyticus
	Staphylococcus epidermidis 
	Staphylococcus aureus 
	MORFOLOGIA MACROSCOPICA 
	En el agar sangre, forman colonias blancas, grandes, lisas, opacas y brillantes. 
	En el agar sangre, forman colonias blancas, elevadas, cohesivas y no hemolíticas.
	En el agar sangre, las colonias son doradas y pueden producir hemólisis.
	MORFOLOGIA MICROSCOPICA 
	Se observan como bacterias Gram positivas, en forma de cocos y se presentan en racimos 
	Se observan como bacterias Gram positivas, en forma de cocos y se presentan en racimos 
	Se ven como bacterias Gram positivas, en forma de cocos y se presentan en racimos 
TEST DE CATALASA
	
	Streptococcus pyogenes 
	Staphylococcus epidermidis 
	Enterococcus faecalis 
	RESULTADOS
	NEGATIVO
	POSTIVO
	NEGATIVO
 
PRUEBA DE LA COAGULASA
	
	Staphylococcus saprophyticus
	Staphylococcus haemolyticus 
	Staphylococcus aureus 
	RESULTADOS
	NEGATIVO
	NEGATIVO
	POSTIVO- se formó coagulo de fibrina 
PRUEBA DE DNAsa
	
	Staphylococcus aureus 
	Staphylococcus epidermidis 
	RESULTADOS
	POSITIVO
	NEGATIVO
SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA 
	
	Staphylococcus saprophyticus
	Staphylococcus epidermidisRESULTADOS
	Resistente- tuvo un halo de inhibición menor de 16mm
	Sensible- tuvo un halo de inhibición mayor de 16mm
PRUEBA DE FERMENTACION DEL MANITOL
	
	Staphylococcus aureus
	Staphylococcus epidermidis 
	RESULTADOS
	POSITIVO- fermentó en manitol
	NEGATIVO- no fermentó en manitol
GENERO: Streptococcus 
	
	S. Pyogenes 
	S. agalactiae 
	S. viridans 
	E. faecalis 
	MORFOLOGIA MACROSCOPICA 
	En el agar sangre, forman colonias pequeñas, redondas, transparentes y beta-hemolíticas, es decir, que producen una zona clara alrededor de las colonias por la lisis completa de los eritrocitos.
	En el agar sangre, forman colonias pequeñas, blancas o grises y beta-hemolíticas, es decir, que producen una zona clara alrededor de las colonias por la lisis completa de los eritrocitos.
	En el agar sangre, forman colonias verdes.
	En el agar sangre, forman colonias pequeñas, lisas, grises y no hemolíticas.
	MORFOLOGIA MICROSCOPICA
	Se observan como bacterias Gram positivas, en forma de cocos en cadenas.
	Se observan como bacterias Gram positivas, en forma de cocos en cadenas.
	Se observan como bacterias Gram positivas, en forma de cocos en cadenas.
	Se observan como bacterias Gram positivas, en forma de cocos que se presentan en pares con un ángulo entre ellos o en cadenas cortas. 
SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA
	
	Streptococcus pyogenes 
	Streptococcus agalactiae
	RESULTADOS
	Sensible- se creó un halo de inhibición mayor
	Sensible- se creó un halo de inhibición menor 
BILIS ESCULINA 
	
	Streptococcus viridans 
	Enterococcus faecalis
	RESULTADOS
	Negativa- no hubo ennegrecimiento 
	Positiva- si hubo ennegrecimiento 
PRUEBA DE CAMP
	
	Montaje 
	RESULTADOS
	Error en la prueba. No presentó zona de potenciación de hemolisis 
PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL 
	
	Streptococcus viridans
	Enterococcus faecalis 
	RESULTADOS
	Negativo 
	Positivo 
SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA 
	
	Streptococcus viridans
	Streptococcus agalactiae
	RESULTADOS
	Resistente
	Resistente
PRUEBA DE HEMOLISIS
	
	S. viridans (alfa)
	S. pyogenes (beta)
	E. faecalis (gamma)
	RESULTADOS 
	Hemolisis parcial 
	Hemolisis completa 
	Hemolisis leve
Fig 15
Fig 16
 
Bilis esculina
Caldo Salado
Fig 17
Cocos observados en el microscopio óptico con tinción de Gram.
Fig 19
Fig 18
DISCUSIÓN
En esta práctica de laboratorio se le realizaron pruebas bioquímicas a diferentes cepas de microorganismos, como los staphylococcus y los streptococcus. Las pruebas bioquimicas para los staphylococcus fueron, la prueba de la catalasa, la prueba de la coagulasa, presencia de DNAsa, susceptibilidad a la novobiocina y la fermentación de manitol; mientras que para los streptococcus fueron una prueba de hemolisis en agar sangre, sensibilidad a la bacitracina, bilis esculina, la prueba de CAMP, tolerancia a la sal y la sensibilidad a la optoquina.
Cada una de estas pruebas tiene un fundamento que explica el porqué de los resultados; estos fundamentos son:
Staphylococcus
· Prueba de Catalasa: La enzima catalasa que contiene el Staphylococcus epidermidis, descompone el peróxido de hidrogeno, en agua y oxígeno, lo que provocó burbujas. Esta enzima ayuda a la bacteria a protegerse del efecto nocivo que tiene el peróxido de hidrogeno. Por lo tanto, la prueba que tenía S. epidermidis fue catalasa positiva porque se formaron burbujas. 
· Prueba de Coagulasa: El Staphylococcus aureus posee dos tipos de enzima coagulasa, llamadas endocoagulasa, la cual actúa sobre el fibrinógeno del plasma y provoca la formación de grumos; y la enzima exocoagulasa, la cual actúa por medio del factor CRF, el cual se une a esta formando un complejo llamado coagulasa-CRF, que reacciona con el fibrinógeno del plasma y forma un coagulo de fibrina. Por esto, al día siguiente de realizar las pruebas, se observó la formación de un coagulo en la prueba de S. aureus.
· Presencia de DNAsa: La DNAsa es una enzima capaz de despolimerizar el ADN y esta prueba se realiza para poder diferenciar Staphylococcus aureus, que normalmente produce esta enzima, de otros Staphylococcus. El agar contiene un medio con ADN y al poner el microrganismo en contacto con ese medio, se evidenció un halo transparente alrededor de donde se sembró, indicando que el Staphylococcus aureus tiene la enzima DNAsa.
· Susceptibilidad a la Novobiocina: El Staphylococcus saprophyticus es resistente a la Novobiocina, al igual que varias especies de Estafilococos, así que en el agar se colocó un disco de Novobiocina en la siembra de Staphylococcus saprophyticus y otro disco en la siembra de Staphylococcus epidermidis. Un halo de inhibición de más de 16mm de diámetro indica una susceptibilidad a la Novobiocina, sin embargo, en este caso era menor a 16mm de diámetro, lo que indica resistencia. 
· Fermentación de manitol: Esta prueba se fundamentó en la capacidad que tiene Staphylococcus aureus de fermentar el manitol salado y producir ácido, que en el medio se observó de un color dorado o amarillo, lo cual evidencia la producción de ácido a partir del manitol. Mientras que la otra mitad del agar donde estaba la siembra de S. epidermidis mantuvo la coloración rosa o roja porque esta bacteria carece de la capacidad de fermentar manitol.
Streptococcus
· Prueba de hemolisis: Despues de determinar si es un coco Gram positivo catalasa negativo, se realizó en un agar sangre, el cultivo de tres cepas de Streptococcus para identificar si son Beta hemolíticos, que es aquel que produjo una hemolisis completa y se observó transparente en el agar. Alfa hemolíticos, aquel que produjo una hemolisis parcial y se observó una coloración verdosa; y por ultimo los Gamma hemolíticos, que no producen hemolisis. Sin embargo, ciertas cepas Gamma hemolíticas pueden producir una leve hemolisis en el agar. Por lo tanto, se observó que S. pyogenes realizo hemolisis completa (b-hemolisis), S. viridans tenia la presencia de halo verdoso (a-hemolítico) y E. faecalis presento un mínimo grado de hemolisis observándose una débil coloración verdosa (ganmahemolítico).
· Sensibilidad a la Bacitracina: El Steptococcus pyogenes fue susceptible al antibiótico Bacitracina, observándose en el cultivo un halo de inhibición. Esta prueba tiene el fin de separar Steptococcus pyogenes (sensible a la bacitracina) de los demás Streptococcus Betahemolíticos resistentes.
· Bilis Esculina: Hizo uso de Streptococcus viridans y Enterococcus faecalis. Los Streptococcus del grupo D son capaces de proliferar en un medio con bilis, porque hidrolizan la esculina transformándola en esculetina la cual se combina con el citrato ferroso del medio y forma un complejo de color negro por esta razón se observó el ennegrecimiento en la prueba de E. faecalis. 
· Prueba de CAMP: Los Streptococcus Beta hemoliticos del grupo B, producen un factor llamado CAMP, que aumenta la zona de hemolisis producida por un Staphylococcus productor de Beta lisina como el S. aureus. Se esperaba observar un mayor grado de hemolisis por parte de S. agalactiae (normalmente esta especie se evidencia como CAMP positivo en la prueba) pero no se obtuvo el resultado esperado probablemente porque hubo contaminación de la prueba o algún otro error durante el procedimiento. 
· Tolerancia a la sal: Los Enterococcus pueden crecer en un medio salado, cosa que los demás Streptococcus del grupo D son incapaces de hacer y por lo tanto no proliferan en el cultivo. Por la tanto la prueba de E. faecalis mostro turbidez y un cambio de coloración de purpura a amarillo-naranja lo que indica que la prueba es positiva debido a la capacidad de este microorganismo de crecer en medios con una concentración de NaCl de 6,5%.
· Sensibilidad a la optoquina: Se realizó la prueba con Streptococcus viridans y S. agalactiae, pero ninguno de los dos mostró un halo de inhibición debido a que ambos son resistentes a la optoquina. Esta prueba tiene el objetivo de diferenciar a S. pneumoniae, susceptible a la optoquina, de otros Streptococcus alfa-Hemolíticos, pero no se disponía de esta cepa en el laboratorio.Normalmente los halos de inhibición mayores a 15 mm son característicos de S. pneumoniae. 
Errores en las pruebas
A la hora de realizar ciertas pruebas bioquímicas en la práctica, se cometieron errores en algunos procedimientos por falta de conocimientos, como fue el caso de la prueba de la Bilis Esculina, en la cual el tubo de ensayo se cayó al suelo y se rompió; esto se pudo solucionar parcialmente colocando cinta de enmascarar alrededor del tubo. Sin embargo, esta prueba fue exitosa ya que si se pudo evidenciar el cambio de color de la Bilis Esculina. Por otro lado, en la prueba de presencia de DNAsa, se cometió un error a la hora de realizar la siembra, debido a que se utilizó un hisopo embebido en la colonia y se realizó un barrido en el medio, cuando en realidad, se tuvo que realizar con un asa y hacer una línea vertical en el medio. Sin embargo, esta prueba también fue exitosa, ya que el barrido con el hisopo se hizo con el microorganismo que no presenta la enzima DNAsa.
BIBLIOGRAFIA
· Murray, P. R., Rosenthal, K., & Pfaller, M. A. (2021). Microbiología Médica (9a ed.). Elsevier.
· Sastry, Apurba Sankar, & K, S. B. (2018). Essentials of medical microbiology (2a ed.). Jaypee Brothers Medical.
· Gram Positive Cocci - Bacteria Identification Algorithm Catalase(+). (2020, septiembre 3). GrepMed. https://www.grepmed.com/images/9959/microbiology-diagnosis-identification-algorithm-gpc-8 
 
Fig 2 
 
Fig 4