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QUÍMICA CLÍNICA En los capítulos anteriores se describieron la metodología y las herramientas básicas en toda clase de análisis. En este capítulo y los dos siguientes se describirán en forma espe- cífica los aspectos prácticos de analizar algunos materiales de diferentes tipos. Se aplicarán los conocimientos adquiridos en los capítulos anteriores, y los capítulos que siguen serán más una referencia para análisis específicos donde se sugerirán métodos que se pueden adoptar para resolver problemas analíticos en la realidad. En este capítulo se describirán en forma específica los aspectos prácticos de los análisis clínicos; los componentes clínicamente importantes de la sangre y la orina, inclu- yendo los electrólitos, proteínas y sustancias orgánicas principales; algunos de los proce- dimientos analíticos de uso frecuente en determinaciones clínicas importantes, es decir, los intervalos fisiológicos normales de los componentes y las condiciones bajo las que se puede salir de esos límites; finalmente, la sensible técnica de los inmunoensayos. Se usan ampliamente las técnicas espectrofotométricas para determinar muchos ana- litos de importancia clínica. Cuando se recurre a un examen médico se hace un análisis de sangre para asegurar que no haya indicadores de enfermedades comunes, como glucosa, colesterol, lípidos y nitrógeno de la urea. En general, los múltiples análisis se efectúan en un analizador automático basado en la detección espectrofotométrica; se emplean diferen- tes reacciones químicas, como las enzimáticas o las inmunoquímicas, para determinar los diferentes analitos. Los electrólitos, como el sodio y el potasio, tal vez se cuantifiquen con un instrumento automático que tenga electrodos selectivos de iones. Muchos análisis es- pecíficos más pueden necesitar técnicas de separación, como la cromatografía de gases o líquidos. Es probable que las pruebas para determinar drogas ilícitas se hagan con inmu- noensayos y confirmaciones con cromatografía (por ejemplo, gases-masas). Las secciones que siguen presentan información sobre cómo recolectar y preparar muestras, y mencionan algunas técnicas representativas para determinar analitos comunes. 24.1 Composición de la sangre La sangre entera se puede dividir en sus siguientes componentes generales: plasma, que contiene el suero y el fibrinógeno, y los elementos celulares, formados por eritrocitos, leucocitos y plaquetas, que se describieron en el capítulo 1. El plasma es la porción líquida de la sangre. Los glóbulos se separan del plasma centrifugando la sangre entera. Si se deja La mayor parte de los análisis de química sanguínea se practi- can en el suero. 24Christian(678-692).indd 67824Christian(678-692).indd 678 9/12/08 16:03:069/12/08 16:03:06 coagular la sangre, el fibrinógeno se separa con los glóbulos y queda el suero. La mayor parte de los análisis clínicos se practican en la sangre entera, el plasma o el suero, y de ellos, la mayor parte es el suero. También con frecuencia se analiza la orina. En la tabla 24.1 se resumen los intervalos normales de concentraciones de algunos componentes de importancia clínica en la sangre humana. Se debe subrayar que estos intervalos normales son aproximaciones. La tabla 5.3 muestra los principales componentes electrolíticos (cationes y aniones) de la sangre. Más adelante se describen los análisis de algunos de los componentes que se determinan con mayor frecuencia. También se descri- birá la importancia fisiológica de los resultados. Véase la composición de elec- trólitos en sangre en la tabla 5.3. Tabla 24.1 Información pertinente a muestras de sangre para exámenes químicosa Determinación Muestrab Intervalo normal Ácido úrico Sangre 3-6 mg/dL Ácidos grasos Suero 200-400 mg/dL Albúmina Suero 4-5 g/dL Amilasa Suero Hasta 150 mg/dL Amoniaco Sangre 40-125 �g/dL Azúcar en la sangre (glucosa) Sangre 65-90 mg/dL Bilirrubina Suero Directa hasta 0.4 mg/dL Total hasta 1.0 mg/dL Calcio Suero 4.5-5.5 meq/L Cloruro, suero Suero 100-108 meq/L Colesterol total Suero 140-250 mg/dLc Colesterol, ésteres Suero 50-65% del total Contenido de dióxido de carbono Suero 25-32 meq/L Creatinina Suero 0.7-1.7 mg/dL Depuración de creatinina 100-180 mL/min Fosfatasa ácida Suero Hasta 4 unidades Gutman Fosfatasa alcalina Suero Hasta 4 unidades Bodansky Fosfolípidos Suero 100-250 mg/dL como fósforo 4-10 mg/dL Fósforo inorgánico Suero 3-4.5 mg/dL Globulinas totales Suero 2.5-3.5 g/dL alfa-1 0.1-0.4 g/dL alfa-2 0.3-0.7 g/dL beta 0.4-0.9 g/dL gamma 0.6-1.3 g/dL Hierro en suero Suero 50-180 �g/dL Lipasa Suero Hasta 1.5 unidades Lípidos totales Suero 350-800 mg/dL Magnesio Suero 1.5-2.5 meq/L Nitrógeno de aminoácidos Sangre 4-6 mg/dL Nitrógeno de la urea (BUN) Sangre Hasta 20 mg/dL Nitrógeno no proteico (NPN) Sangre 25-40 mg/dL Potasio Suero 3.8-5.6 meq/L Proteína total en suero Suero 6.5-8 g/dL Sodio Suero 138-146 meq/L Transaminasa (SGO) Suero Hasta 40 unidades Yodo unido a proteína (PBI) Suero 3.5-8 �g/dL a Adaptado de J. S. Annino, Clinical Chemistry, 3a. ed., Boston: Little, Brown and Company, 1960. bS, suero; B, sangre. c Este intervalo varía con la edad. 24.1 COMPOSICIÓN DE LA SANGRE 24Christian(678-692).indd 67924Christian(678-692).indd 679 9/12/08 16:03:089/12/08 16:03:08 CAPÍTULO 24 QUÍMICA CLÍNICA 24.2 Toma y conservación de las muestras Con frecuencia, las muestras de sangre y orina se toman después de que el paciente ayunó durante cierto tiempo (por ejemplo, toda la noche), en especial para analizar el colesterol o la glucosa. En un estudio se demuestra que un desayuno promedio no tiene efecto apre- ciable sobre la concentración de dióxido de carbono, cloruro, sodio, potasio, calcio, nitró- geno de la urea, ácido úrico, creatinina, proteínas totales y albúmina. El fósforo del suero disminuye un poco 45 min después del alimento, pero no después de 2 h. PRECAUCIÓN: La toma y el manejo de la sangre y otras muestras biológicas re- quiere de gran cuidado, por la posible presencia de componentes de enfermedades trans- misibles, en especial VIH o sida. Deben usarse guantes de hule y con frecuencia también mascarillas. No deberían extraerse sangre ni otras muestras biológicas, ni manejar las muestras de individuos. Todos los experimentos están diseñados para usar materiales co- merciales o sintéticos que sean seguros (por ejemplo, suero congelado y secado). Se puede comprar suero animal, como de caballo o bovino (www.sigma-aldrich.com). Un experi- mento usa orina, la cual puede ser la del lector, de un animal, o sintética. Cuando se requiere suero para el análisis, la sangre se recibe en un tubo limpio y seco para evitar la contaminación y la hemólisis. La hemólisis es la destrucción de los glóbulos rojos con liberación de hemoglobina y otros componentes celulares que pasan al líquido que los rodea (suero o plasma). Cuando se presenta la hemólisis, el suero es apre- ciablemente rojo y no tiene su color paja normal. Una sustancia puede estar a una concen- tración mucho mayor en la parte celular de la sangre que en el suero o el plasma. Si lo que tiene importancia clínica es la concentración en el suero o el plasma, con la hemólisis se obtendrían muchos resultados erróneos, como en el caso de potasio, hierro, magnesio, zinc, urea, proteína (de hemoglobina) y otros. Por esta razón se deben centrifugar las muestras de sangre tan pronto como sea posible para separar el suero o el plasma de las células. Si se requiere plasma o sangre entera para el análisis, se recibe entonces la sangre en un tubo que contenga un anticoagulante. Con frecuencia se usa heparina (sal sódica); sin embargo, su efecto es temporal y su costo alto. Por tanto, un anticoagulante muy usado es el oxalato de potasio, aproximadamente 1 mg por mL de sangre. El oxalato precipita el calcio, que se requiere en el proceso de coagulación. Es obvio que el plasma preparado en esta forma no puedeanalizarse para calcio o potasio; muchos otros metales se precipi- tan con el oxalato, por lo que se suelen analizar en el suero. Lo que se acostumbra para preparar las muestras de sangre entera o de plasma es agregar la cantidad necesaria de oxalato en solución al tubo de recolección, y después secar el tubo en una estufa a 110�C. Con este procedimiento no se diluye la sangre. Por ejemplo, se tomaría 0.5 mL de solución de oxalato de potasio al 2% y se secaría para recibir una muestra de 10 mL de sangre. El oxalato de potasio hace que los glóbulos rojos se contraigan y el resultado es que el agua intracelular se difunde en el plasma. Así, el plasma se debe separar tan pronto como sea posible. Si se debe conservar una muestra en condiciones anaeróbicas, como en el caso de los análisis de CO2, se agrega aceite mineral al tubo de recolección, pues al ser más ligero que la sangre, la cubre. En estos casos debe usarse un tapón de corcho, porque el aceite causa hinchamiento a los tapones de hule. A veces se agrega un preservativo a la muestra, por lo general junto con el anticoa- gulante. El preservativo que se usa mucho con muestras donde se analiza la glucosa es el fluoruro de sodio, que es un inhibidor enzimático que evita la descomposición de la glucosa o glucólisis. Un miligramo de fluoruro de sodio por mililitro de sangre es lo adecuado. Como también inhibe otras enzimas, incluyendo la ureasa, no se debe agregar a muestras donde se analizarán enzimas o para urea basada en la catálisis de ureasa. La hemólisis contamina el plasma o el suero con compo- nentes celulares. Si se va a separar el plasma, se debe agregar un anticoagulante. 24Christian(678-692).indd 68024Christian(678-692).indd 680 9/12/08 16:03:089/12/08 16:03:08 Por lo general se pueden guardar las muestras durante uno o dos días si se refrigeran. Esto hace lentos los procesos enzimáticos y bacteriológicos, pero no los elimina; lo mejor entonces es analizar muestras frescas cuando sea posible. Las muestras siempre se llevan a la temperatura ambiente antes de analizarlas. Si se congelan, se conservarán largo tiempo y al mismo tiempo se suspenderá la actividad de enzimas en sangre. No debe congelarse la sangre entera, porque con ello se rompen los glóbulos rojos. Cuando se congelan, las muestras de suero y plasma se separan en capas de diferente composición, por lo que se deben agitar suavemente después de descongelarlas. Las muestras son más estables si se prepara un filtrado libre de proteína (PFF, pro- tein-free filtrate). Hay varios procedimientos para prepararlos. En el método de Folin-Wu o del ácido túngstico, se mezcla un volumen de sangre, suero o plasma con siete volúmenes de agua y un volumen de ácido sulfúrico 0.33 M, dejando que la mezcla se torne café. En- tonces se agrega un volumen de tungstato de sodio al 10% (p/v, Na2WO4 · 2H2O), y pasados dos minutos se filtra o centrifuga la proteína precipitada. En el método del ácido tricloro- acético (TCA) se mezcla un volumen de sangre, suero o plasma con nueve volúmenes de TCA al 5% (p/v), y después de precipitar las proteínas, se filtra o centrifuga la mezcla. Ambos métodos producen filtrados ácidos, pero son útiles para analizar muchas sustancias. Cuando la glucosa se analiza por oxidación (por ejemplo, con tartrato alcalino de cobre, vide infra), se obtienen resultados altos si se usan los filtrados anteriores. Un filtrado libre de proteína preparado con hidróxido de bario y sulfato de zinc elimina la mayor parte de las interferencias reductoras (véase el experimento 35). De este modo se obtiene un PFF esencialmente neutro, porque el producto Zn(OH)2 se precipita: Ba(OH)2 � ZnSO4 → B � a � S � O � 4 � � Z � n � ( � O � H � ) � 2 � La glucosa es estable en un filtrado sin proteínas porque se eliminan las proteínas gluco- líticas. 24.3 Análisis clínicos: determinaciones frecuentes La tabla 24.2 contiene un resumen de algunos de los componentes de la sangre que se determinan con mayor frecuencia y de los principios de algunos de los procedimientos que se emplean. Sólo son procedimientos representativos y en muchos casos hay numerosas variantes de diferentes procedimientos, que permiten varios grados de conveniencia, rapi- dez, sensibilidad, exactitud, precisión y otros más. Los principales electrólitos en el suero son: sodio, potasio, calcio, magnesio, cloruro y bicarbonato (CO2), y se determinan con bastante facilidad. Los metales se determinan con más facilidad usando métodos espectrofotométricos a la flama o de absorción atómica, aunque existen métodos colorimétricos para calcio y magnesio. El calcio, y con menos frecuencia, el magnesio también se titulan con EDTA. Para análisis sistemático de sodio, potasio y calcio se usan electrodos selectivos de iones. El bicarbonato también se analiza por titulación frente a un ácido valorado (véase el experimento 8), además de por un mé- todo manométrico. El cloro se determina mucho por titulación culombimétrica con ion plata electrogenerado. Las dos pruebas clínicas que se hacen con mayor frecuencia son las de glucosa san- guínea y nitrógeno en urea sanguínea (BUN, blood urea nitrogen). En los procedimientos que muestra la tabla 24.2 se cuantifica el total de todos los azúcares reductores, por lo que el resultado tiende a ser alto. Sin embargo, durante muchos años se han adoptado estos métodos como los normales. La determinación enzimática de la glucosa (capítulo 22) es un método establecido, y hoy se usan mucho analizadores enzimáticos de glucosa. El ácido úrico se determina con mayor especificidad de manera enzimática que por el método descrito. El ácido úrico en una alícuota separada de la muestra se destruye con la A veces es necesario un filtrado libre de proteína para evitar in- terferencias de matriz por parte de las proteínas. En el mundo se hacen probable- mente más análisis de glucosa que de cualquier otra sustancia. 24.3 ANÁLISIS CLÍNICOS: DETERMINACIONES FRECUENTES 24Christian(678-692).indd 68124Christian(678-692).indd 681 9/12/08 16:03:099/12/08 16:03:09 CAPÍTULO 24 QUÍMICA CLÍNICA Tabla 24.2 Algunos procedimientos de análisis clínicos Muestra Sustancia determinada analizadaa Método de medición Principio Ácido úrico Suero Espectrofotometría Filtrado libre de proteína con ácido túngstico; oxidar con fosfotungstato alcalino y medir el producto de reducción de fosfotungstato azul a 680 nm Azúcar (glucosa) Sangre o suero Espectrofotometría Filtrado libre de proteína con Ba(OH)2-ZnSO4; oxidar el azúcar con Cu(II) alcalino para formar Cu2O; el Cu2O se determina permitiéndole reducir el ácido fosfomolíbdico para formar azul de molibdeno, que se mide a 420 nm, o hacer reaccionar el azúcar con o-toluidina y medir a 635 nm Barbituratos Suero Espectrofotometría de ultravioleta Se extrae barbiturato en CHCl3, se vuelve a extraer en solución de NaOH y se mide la absorción UV a pH alcalino a 252 nm Calcio Suero Espectrometría de absorción Se diluye 1:20 con Na2EDTA 10 000 ppm atómica y se mide la absorbancia a 422.7 nm Cloruro Suero Volumétrico; culombimétrico Titulación con Ag� o Hg(II) Creatinina Suero Espectrofotométrico El filtrado libre de proteína (ácido tricloroacético) reacciona con picrato alcalino y se mide la absorbancia a 490 nm Dióxido de carbono Suero Manométrico; electrodo Método manométrico de Van Slyke; electrodo de CO2 Fosfatasa ácida Suero Espectrofotometría Incubar con glicerofosfato de sodio durante 1 h a pH de 4.9 para liberar fosfato; determinar fosfato como con fósforo inorgánico Fosfatasa alcalina Suero Espectrofotometría Lo mismo, pero incubar a pH 9.6 Fósforo inorgánico Suero Espectrofotometría Filtrado libre de proteína (ácido tricloroacético); hacer reaccionar con Mo(VI) para formar ácido fosfomolíbdico y reducirlo a azul de molibdeno. Medir absorbancia a 660 nm Hierro Suero Espectrofotometría de El hierro en elfiltrado libre de proteína se reduce absorción atómica a Fe(II) y se compleja con batofenantrolina; se mide la absorbancia a 535 nm Magnesio Suero Espectrofotometría de Diluir 1:20 con Na2EDTA al 1% y medir absorción atómica la absorbancia a 285.2 nm Nitrógeno de urea (BUN) Sangre Espectrofotometría (enzimático) Filtrado libre de proteína con ácido túngstico; incubar con enzima ureasa a pH 6.8 para producir NH3; determinar el NH3 con el reactivo de Nessler Nitrógeno no proteico Sangre Espectrofotometría Digerir el filtrado libre de proteína para formar (NPN) NH4HSO4, adicionar yoduro mercúrico alcalino (reactivo de Nessler) para complejar el amoniaco y medir la absorbancia a 480 nm Potasio Suero Fotometría de fl ama; electrodo Diluir 1:50 con NaCl 0.15 M y medir a 766 nm; electrodo sensible al ion K� Proteína total Suero Espectrofotometría Reactivo de biuret (tartrato de cobre alcalino); forma un complejo con las proteínas; medir absorbancia a 550 nm después de 30 min Salicilato Suero Espectrofotometría Formar complejo con nitrato férrico en solución ácida y medir absorbancia a 535 nm Sodio Suero Fotometría de flama; electrodo Diluir 1:50 y medir a 589 nm; electrodo sensible a ion Na� Yodo unido a proteína Suero Espectrofotometría (catalítico) Precipitar proteínas con ácido tricloroacético, reducir (PBI) a cenizas o digerir la proteína y medir el efecto ca- talítico de I− sobre la velocidad de la reacción entre Ce(IV) y As(III) midiendo la absorbancia de Ce(IV) a 420 nm pasados 20 min a S, suero; B, sangre. 24Christian(678-692).indd 68224Christian(678-692).indd 682 9/12/08 16:03:099/12/08 16:03:09 24.4 INMUNOENSAYOS enzima uricasa y se mide la disminución del producto de reducción fosfotungstato azul. La segunda alícuota sirve como testigo. El ácido úrico también se puede medir directamente por su absorbancia en la región ultravioleta a 290 nm, antes y después de incubar con uricasa. La albúmina y las globulinas se pueden analizar con el mismo procedimiento que para proteínas totales, después de fraccionar y salar con sulfato o sulfito de sodio. Si se requiere información más detallada sobre las fracciones de proteína (globulinas �, � y �), se puede usar electroforesis en gel de almidón para separarlas. Se usa análisis micro-Kjel- dahl cuando se requieren datos muy exactos; la exactitud aproximada del método del biuret es del 4%. Las fosfatasas ácida y alcalina son enzimas de la sangre y son activas en solución ácida y alcalina, respectivamente. El sustrato con que se analizan es glicerofosfato al pH adecuado. Estas enzimas hidrolizan al sustrato desprendiendo fosfato. Se pueden usar otros sustratos con fosfato. Los barbituratos, sustancias que normalmente no están presentes en la sangre, se pueden extraer de ella (no ionizados) en cloruro de metileno. Después se vuelven a extraer en hidróxido de sodio 0.45 M de manera ionizada. Esta forma absorbe en la región ultra- violeta, donde no absorbe la forma no ionizada. Con una gráfica del espectro de absorción se puede confirmar cualitativamente la presencia de barbituratos. La forma ionizada a pH de 13 a 14 presenta un máximo de absorción entre 252 y 255 nm, con un mínimo entre 234 y 237 nm; a pH de 9.8 a 10.5, una forma ionizada diferente tiene un máximo a 240 nm. Varias de las pruebas anteriores también se hacen a muestras de orina, y con frecuen- cia se pueden usar los mismos procedimientos. Debido a las diferentes concentraciones e interferencias podrán introducirse modificaciones en los procedimientos. En general, los análisis se hacen con una muestra de 24 h, es decir, orina recolectada durante un periodo de 24 h, porque la excreción total diaria de gran parte de las sustancias tiene mucho mayor importancia que la concentración en una muestra aleatoria. En la figura 24.1 se muestra la composición de la orina comparada con la del suero. Hay una necesidad definida de análisis en punto de atención para ciertas pruebas, cuyos resultados se deben obtener con rapidez. Por ejemplo, en un ataque al corazón, es muy importente el tiempo que transcurre entre la presentación del síntoma y el inicio del tratamiento para minimizar los daños cardiacos. La unidad de cuidados intensivos depende mucho de resultados rápidos de análisis de sangre, para confirmar un ataque cardiaco y proporcionar el cuidado correspondiente. Podría ser muy ineficiente llevar las muestras a un laboratorio y esperar los resultados. Entonces, la unidad de cuidados de urgencia puede tener un analizador enzimático al lado de la cama que requiera de manejo mínimo. Se le inserta una muestra de sangre, se oprime un botón y los resultados se obtienen en menos de un minuto. Uno de los analizadores con biosensor que más éxito ha tenido es el de glucosa que usan los diabéticos como monitores personales. El paciente sólo pone una pequeña gota de sangre (obtenida con una lanceta estéril) en una tira de prueba que contiene glucosa oxidasa, y la enzima cataliza la oxidación de la glucosa para formar peróxido de hidrógeno, el cual se mide entonces de manera electroquímica o fotométrica. Véase, por ejemplo, http://abbott.com/diabetes/diabetes.html y www.diabeticsupply.com. 24.4 Inmunoensayos Las técnicas de inmunoensayo tienen importancia para determinaciones específicas de hormonas, drogas, vitaminas y otros compuestos en cantidades de nanogramo o menores. En estos métodos reaccionan un antígeno y un anticuerpo específico para formar un com- plejo o precipitado. La primera aplicación analítica fue el radioinmunoensayo (RIA), con el que Berson y Yalow demostraron la capacidad para medir en forma selectiva pequeñas Los inmunoensayos pueden ser muy selectivos y sensibles. 24Christian(678-692).indd 68324Christian(678-692).indd 683 9/12/08 16:03:099/12/08 16:03:09 CAPÍTULO 24 QUÍMICA CLÍNICA cantidades de insulina (referencia 10). No fue sino hasta los últimos años de la década de 1960 y primeros de la de 1970 que se tuvo acceso al RIA para análisis rutinarios. En esa época, los métodos pasaron del laboratorio de investigación al laboratorio clínico en lo que debe ser un tiempo récord, demostrando que existía una necesidad real. Los inmunoensa- yos y los ensayos por unión competitiva relacionados se usan hoy mucho en el laboratorio clínico. La importancia atribuida a la técnica se ve además porque el Premio Nobel de Fisiología de 1977 fue otorgado a Rosalyn Yalow, después de la muerte de Berson, por desarrollar el método (www.almaz.com/nobel/nobel.html). En general, en las técnicas de inmunoensayo se produce una reacción competitiva entre un antígeno analito y un antígeno estándar que ha sido marcado, y compiten por sitios de unión limitados sobre el anticuerpo de ese antígeno. La marca puede ser de un trazador radiactivo, una enzima o un fluoróforo. A continuación se describirán la técnica 800 750 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 mEq/L 25 200 175 150 125 100 75 50 Orina Plasma HCO3 − Na+ Proteína Cl− No determinados Urea NH4 + Cl− Na+ SO4 2− Orina pH 5.4 Plasma sanguíneo pH 7.4 H2PO4 − K+ Ca2+ Ca2+ Mg2+ K+ SO4 2− Ac. Org. Ac. org. Creatinina Glucosa Urea N de otros HPO4 2− Mg2+ H2CO3 H2CO3 Figura 24.1. Comparación de composiciones de la orina y el plasma sanguíneo. Los no electrólitos se expresan como milimoles en la escala de mi- liequivalentes. Los valores en la escala incluyen todos los constituyentes (la suma de to- dos). (Según J. A. Gamble, Chemical Anatomy, Physio- logy, and Pathology of Extra- cellular Fluid. Cambridge, MA: Harvard University Press, 1950. Reproducción autorizada por Harvard University Press.) 24Christian(678-692).indd 68424Christian(678-692).indd 684 9/12/08 16:03:099/12/08 16:03:09 24.4 INMUNOENSAYOS de inmunoensayo, así como las bases comunes a todas las técnicas. También se describiránla fluorescencia y el inmunoensayo enzimático. PRINCIPIOS DE LOS INMUNOENSAYOS En los inmunoensayos se combina la sensibilidad de la radioquímica, de la fluorescencia o de los marcajes enzimáticos con la especificidad de la inmunología. La inmunología es el estudio de los antígenos y sus reacciones con anticuerpos, es decir, el mecanismo de defensa de un organismo frente a cuerpos extraños a través de los anticuerpos (figura 24.2). Un antígeno (por ejemplo, una hormona) es una sustancia externa capaz de producir la formación de anticuerpos en el organismo, y puede reaccionar con (unirse a) ese anticuerpo. Un antígeno siempre es una molécula grande, como una proteína. Un anticuerpo es una proteína con la capacidad de reconocer, por asociación estereoespecífica, una sustancia extraña al organismo que ha invadido, por ejemplo, bacterias y virus. Un anticuerpo es una proteína globulina de alto peso molecular, alrededor de 150 000 (véase la figura 24.3 para un modelo). Cuando la proteína tiene actividad como anticuerpo se llama inmunoglobulina (Ig). Realmente hay cinco inmunoglobulinas principales en el cuerpo humano (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), pero la más abundante es la IgG. La Ig está formada por dos cadenas ligeras de polipéptido de unos 214 residuos de aminoácido y una cadena pesada de unos 430 residuos. Están unidas por puentes de disulfuro formando una estructura flexible en forma de Y (figura 24.4). Cuando se trata enzimáticamente con papaína, se forman tres fragmentos de peso molecular aproximado de 50 000 cada uno. Dos son idénticos y conservan la capacidad de unirse con antígenos, de aquí que se refie- ran como Fab (fragment, antigen binding). El tercer fragmento no se une con el antígeno por sí mismo, pero se puede cristalizar de la solución, por lo que se le denomina Fc (frag- mento cristalizable). El fragmento Fc tiene composición notablemente consistente, y los fragmentos Fab tienen porciones de composición variable y se unen en forma específica a determinados anticuerpos. Los dominios clave están en los extremos terminales de las regio- nes Fab (regiones sombreadas en la figura 24.4), que forman los sitios de unión para el an- Antígeno (Ag[V1]) (cuerpo extraño) Producción de anticuerpo (Ab) Complejo anticuerpo-antígeno (AbAg) Antígeno Figura 24.2. Principios de las reacciones inmunológicas. Figura 24.3. Modelo de es- feras sólidas de la estructura de un anticuerpo. 24Christian(678-692).indd 68524Christian(678-692).indd 685 9/12/08 16:03:109/12/08 16:03:10 CAPÍTULO 24 QUÍMICA CLÍNICA tígeno (el fragmento Fc también se puede plegar para que su extremo se una con el antígeno, pero el Fab es el principal enlazante). Todos los anticuerpos tienen una estructura parecida, excepto por las partes variables de los fragmentos Fab que se unen a los antígenos. El anticuerpo reacciona específicamente con un antígeno para formar un complejo antígeno-anticuerpo. Se produce en el organismo (donde durará algún tiempo) sólo des- pués de que éste haya tenido cuando menos una exposición al intruso (por vacunación, espontánea o artificial). Un anticuerpo se produce para usarlo en inmunoensayos inyectando el antígeno en una especie animal para el que es extraño, y se recupera el suero que con- tiene el anticuerpo resultante (antisuero). La fuerza del complejo antígeno-anticuerpo se llama afinidad o avidez. Afinidad se refiere a la constante de asociación intrínseca entre un anticuerpo y un antígeno univalente, en tanto que la avidez se refiere a la energía total de unión entre los anticuerpos y un antígeno multivalente. La reacción total para establecer este enlace puede escribirse como sigue Ab � Ag � AbAg (24.1) Y la constante de formación es K � [AbAg] �� [Ab][Ag] (24.2) Las constantes de formación son bastante grandes, por lo regular de 108 a 1010. Las fuerzas de enlace son bastante débiles, de van der Waals, electrostáticas e hidrofóbicas, pero hay muchos grupos de unión. Las uniones se rompen (se disocia el complejo) agregando sales o aumentando el pH, la temperatura o la polaridad del disolvente. Todos los procedimientos de inmunoensayo se basan en el descubrimiento original de Berson y Yalow de que pueden detectarse, en forma radioquímica, bajas concentracio- nes de anticuerpos de la hormona insulina, que funciona como antígeno gracias a su capa- cidad para enlazarse con insulina radiomarcada con 131I. Entonces, la determinación de concentraciones desconocidas de antígeno se basa en que el antígeno radiomarcado y el no radiomarcado (de la muestra o de un estándar) compiten fisioquímicamente por los sitios de unión de los anticuerpos (radioinmunoensayo, RIA). Esto se ilustra en la figura 24.5. El recipiente inicial de reacción contiene una solución del anticuerpo (antisuero), antígeno marcado y la muestra sérica que puede contener antígeno no marcado (el natural, la sustancia a determinar). Al incubarlos, el anticuerpo (Ac) forma un inmunocomplejo antígeno-anticuerpo (Ag-Ac). En ausencia de antígeno no marcado, cierta fracción del an- tígeno marcado, Ag*, se une como Ag*-Ac. Pero cuando se agregan cantidades crecientes S S Regiones variables Región constante Ligera Pesada Sitio de unión a antígeno Fab Fc S S S S S S Figura 24.4. Anticuerpo. El antígeno analito compite con el antígeno marcado por los si- tios del anticuerpo. Se mide el antígeno marcado desplazado, sea en forma directa o indirecta. 24Christian(678-692).indd 68624Christian(678-692).indd 686 9/12/08 16:03:109/12/08 16:03:10 24.4 INMUNOENSAYOS de antígeno no marcado (Ag), los sitios de unión limitados en el anticuerpo se van saturan- do de manera progresiva, y el anticuerpo puede unirse cada vez menos al antígeno radio- marcado. Después de la incubación se separan los antígenos enlazados de los antígenos no enlazados (libres) y se mide la porción marcada (con radiactividad, fluorescencia, etc.) de alguna o ambas fases para determinar el porcentaje de unión del antígeno marcado. La solución del anticuerpo es diluida inicialmente para que, en ausencia de antígeno estándar no marcado o desconocido, se enlace 50% de la dosis con trazador de Ag*. Un menor enlace de antígeno marcado cuando se agrega la muestra indica la presencia de antígeno no marcado. Se prepara una curva de calibración usando soluciones estándar de antígeno de concentración conocida graficando el porcentaje de antígeno marcado que se enlazó, o bien la relación de porcentaje de enlazado a libre (B/F, bound/free) en función de la concentración de antígeno sin marcar. Con esta curva se puede determinar la con- centración desconocida del antígeno. En la figura 24.6 se muestra un ejemplo de una curva de calibración. Obsérvese el amplio intervalo de concentraciones (10−2 a 103 ng/mL en la región más lineal) y la gran sen- sibilidad. La pendiente de la curva de calibración, y en consecuencia el intervalo y la sensibilidad, dependen de la dilución inicial del anticuerpo. La sensibilidad es máxima con altas diluciones del anticuerpo, pero con un anticuerpo más concentrado se cubre un in- tervalo más amplio de concentraciones del antígeno. También, como se dijo antes, para obtener una sensibilidad muy alta se aconseja usar una dilución del antisuero que se enlace con casi 50% del antígeno marcado (usando una cantidad muy pequeña) en ausencia del antígeno no marcado. Esto se debe a que una disminución de 50% de la relación unido/li- bre (B/F) con un valor inicial de 1.0 (es decir, 50% unido inicialmente) se puede determi- nar con más exactitud que una disminución similar de porcentaje desde un valor inicial, por ejemplo, de 10 (91% enlazado). En el primer caso habría una disminución de 50% enlazado (B/F � 1.0) a 33% enlazado (B/F � 0.5), en tanto que en el segundo caso la disminución sería de 91% (B/F � 10) a 83% (B/F � 5). La sensibilidad de la parte inicial de la curva puede aumentarse usando cantidadesmínimas de antígeno marcado. Incubación Ac (anticuerpo) Ag* (antígeno radiomarcado) Ag (antígeno en la muestra o en el estándar) Separación Ag*–Ab y Ag–Ab (enlazados) Ag* y Ag (libre) Ag*–Ab y Ag–Ab (enla- zados) + Ag*–Ag (libre) Figura 24.5. Principios del radioinmunoensayo. −3 Valor para el paciente P o rc e n ta je e n la z a d o 50 40 30 20 10 0 −2 −1 0 1 Conc log (ng/mL) 2 3 4 5 Figura 24.6. Ejemplo de curva de calibración para in- munoensayo. 24Christian(678-692).indd 68724Christian(678-692).indd 687 9/12/08 16:03:109/12/08 16:03:10 CAPÍTULO 24 QUÍMICA CLÍNICA El principio competitivo de los inmunoensayos se puede aplicar a otros sistemas. Toda sustancia que pueda unirse en forma específica a una macromolécula se puede cuan- tificar aplicando el principio de unión competitiva de proteína. La macromolécula espe- cífica que se enlace puede ser una proteína de suero, como la globulina que se une a la tiroxina, un receptor específico o un anticuerpo. ESPECIFICIDAD DE LOS INMUNOENSAYOS Ningún antisuero de los que se usan en los inmunoensayos es totalmente específico hacia determinado antígeno. La especificidad está influida por: a) la heterogeneidad del anti- cuerpo, b) la reacción cruzada con otros antígenos y c) las posibles interferencias de la reacción antígeno-anticuerpo debidas a sustancias de bajo peso molecular que puedan al- terar el ambiente de la reacción. Determinado antígeno induce la formación de múltiples anticuerpos. Éste se puede combinar con los diversos anticuerpos en distintos grados, los cuales dependen de las constantes respectivas de equilibrio. Además, un solo tipo de anti- cuerpo puede tener una cantidad y ubicación variable de sitios de unión. El problema de la heterogeneidad se ha paliado con el desarrollo de mejores técnicas de purificación de antisueros. Además, la producción sintética de anticuerpos monoclonales, es decir, anticuerpos sencillos, permite tener gran especificidad. El problema de reacción cruzada con otros antígenos es complejo y debe considerarse por separado para cada tipo de antígeno que se mide. Se podrán necesitar técnicas espe- ciales de purificación. Entre los factores no específicos que pueden modificar la rapidez de la reacción antígeno-anticuerpo están pH, fuerza iónica, altas temperaturas, composición de la solución amortiguadora para el medio de incubación, heparina, urea y altas concentraciones de bilirrubina. Los estándares de antígeno y las muestras problema deben prepararse (diluirse) en un plasma libre de antígenos para eliminar las diferencias de composición. Se debe usar el mismo amortiguador u otro diluyente. Si no se dispone de plasma libre de antígenos de la misma especie, se puede usar plasma de una especie que no tenga reacción cruzada. PREPARACIÓN DEL ANTICUERPO Por supuesto, se requiere un antisuero adecuado para el inmunoensayo. La concentración del anticuerpo (llamada título) es importante, pero el criterio principal para establecer un antisuero adecuado es su especificidad y afinidad para el antígeno que se determina. El método general para inducir la formación de anticuerpos es inyectar de 0.2 a 2 mg del antígeno puro mezclado con el “auxiliar de Freund”, que es una mezcla de aceite mineral, ceras y bacilos muertos, que aumenta y prolonga la respuesta del antígeno. Entre los anima- les que se usan están conejos, ovejas, cobayos (“cuyos”), cabras, pollos o monos, dependiendo del volumen de antisuero que se desea y del grado de actividad extraña del antígeno. Las moléculas que son demasiado pequeñas para inducir la formación de anticuerpos (pesos fórmula de 1 000 a 5 000, llamados haptenos en oposición a los antígenos, como los polipéptidos menores o los esteroides) se unen a acarreadores como proteínas o com- puestos sintéticos antes de que sean inyectados. Entre los acarreadores comunes están la globulina gamma y la albúmina humana, péptidos sinéticos y polímeros. Una vez inmunizado un animal, puede ser inyectado varias veces para obtener dife- rentes lotes de antisueros. Los antisueros son productos comerciales para la mayoría de los ensayos para los cuales los antígenos marcados están disponibles. Los antisueros di- luidos se pueden guardar durante largo tiempo cuando se encuentran congelados. Una vez descongelados, se deben guardar a 4�C. PERIODO DE INCUBACIÓN PARA EL ANÁLISIS El tiempo necesario para llegar al equilibrio en la reacción antígeno-anticuerpo durante el análisis varía de algunas horas a varios días, dependiendo del antígeno específico que se esté No es igual que el título des- crito en el capítulo 5. Los analitos de hapteno deben unirse a moléculas mayores para inducir la formación de anti- cuerpos. 24Christian(678-692).indd 68824Christian(678-692).indd 688 9/12/08 16:03:119/12/08 16:03:11 24.4 INMUNOENSAYOS midiendo. En general, no se desea tener incubaciones largas (se puede dañar el antígeno por exposición prolongada a las altas concentraciones de las proteínas plasmáticas, a los oxidan- tes, etc.), por lo que en algunos procedimientos no se alcanza el punto de equilibrio. SEPARACIÓN DEL ANTÍGENO UNIDO Y DEL ANTÍGENO LIBRE Se usan varias técnicas para separar el antígeno unido del antígeno libre después de la incubación, con lo cual es posible determinar el porcentaje de unión mediante la respuesta de la marca. El complejo inmune es una sustancia proteica que se puede precipitar (des- naturalizar) con altas concentraciones de diversas sales [por ejemplo, (NH4)2SO4, Na2SO4] o con disolventes orgánicos (por ejemplo, acetona, etanol). La precipitación es uno de los métodos más usados. En general, el complejo precipitado se separa por centrifugación (aunque también se puede usar filtración) y entonces se puede medir la respuesta de la marca en cualquiera de las fases. La técnica del doble anticuerpo también se usa mucho. En este caso se emplea un segundo anticuerpo para precipitar el complejo primario antígeno-anticuerpo. Este segun- do anticuerpo se produce inyectando a un segundo animal la globulina gamma producida en el primer animal con el que se preparó el primer anticuerpo. Aunque con el uso de un segundo anticuerpo se introduce otra fuente de error, el método del doble anticuerpo tiene la ventaja de poder aplicarse en casi todos los inmunoensayos, y la separación es completa. Entre otras técnicas de separación se hallan la electroforesis (capítulo 21) y la unión del antígeno o anticuerpo con una fase sólida para usarlos como reactivo. ENSAYOS POR INMUNOFLUORESCENCIA Los anticuerpos y los antígenos se pueden marcar con tintes fluorescentes para después medir la fluorescencia (ver la referencia 12). Este método es popular por la mayor facilidad de manejo de los reactivos en comparación con las sustancias radiactivas y el problema del decremento de la radiactividad en función del tiempo. Los colorantes de uso frecuente son el isotiocianato de fluoresceína (FITC, fluorescein isothiocyanate) y la lisamina roda- mina B (RB 200). La proteína que se va a conjugar (reaccionar) con el tinte suele ser una mezcla de inmunoglobulinas y no debe contener otras fracciones de proteínas de suero porque la albúmina y otras globulinas se marcan con mayor facilidad que la globulina gamma, lo que haría que el método no fuese específico. Después del marcado se remueve el tinte sin reaccionar, y la proteína marcada se purifica mediante cromatografía de exclu- sión de tamaño. Con frecuencia, la fluorescencia de un antígeno marcado se apaga debido a una re- acción inmunoquímica, y se puede medir la disminución de fluorescencia sin tener que hacer una separación física. Esto es la base de los inmunoensayos homogéneos, en con- traste con los inmunoensayos heterogéneos, los cuales requieren una separación. INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS En este método el marcador que se usa es una enzima, por ejemplo peroxidasa, y la acti- vidad dela enzima sin reaccionar y el antígeno marcado se mide con una reacción enzi- mática apropiada. También aquí, en estas técnicas, con frecuencia se inhibe la actividad de la enzima con una reacción inmunoquímica, y se puede medir la disminución de acti- vidad en un sistema de inmunoensayo homogéneo. Estos inmunoensayos enzimáticos ho- mogéneos se suelen usar para la medición de moléculas de bajo peso molecular, como la digoxina, las anfetaminas y los medicamentos de prescripción. Los inmunoensayos enzimáticos se conocen en general como ensayos con inmuno- sorbente unido a una enzima (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assays). Véase la descripción original en la referencia 13. En la figura 24.7 se aprecian los diferentes tipos. Éstos son análisis heterogéneos. Los ensayos homogéneos (más adelante) no requieren separa- ciones. En este caso la marca es un fluoróforo. Su fluorescencia se apaga por la reacción inmuno- química. La actividad del marcador enzi- mático se inhibe por la reacción inmunoquímica. En la prueba ELISA, el antí- geno o el anticuerpo se adsorbe en una superficie de plástico. 24Christian(678-692).indd 68924Christian(678-692).indd 689 9/12/08 16:03:119/12/08 16:03:11 CAPÍTULO 24 QUÍMICA CLÍNICA Estos ensayos se practican en forma conveniente inmovilizando el antígeno o anticuerpo sobre una superficie sólida, como vidrio o partículas de plástico. Se evita la centrifugación adsorbiendo en tubos o discos de polipropileno o poliestireno. Éstos se lavan con facilidad y adsorben una cantidad reproducible de anticuerpo o antígeno. Se suelen usar pequeños pozos de plástico troquelados en una hoja (por ejemplo, 96 pozos) para procesar muchas muestras y estándares al mismo tiempo. Hay pipeteadores y medidores automáticos que se usan con ellas. Si un marcador enzimático se une al anticuerpo, éste es inhibido al reaccionar con el antígeno del analito; en este caso se trata de un ensayo de unión no competitiva de proteína (véase por ejemplo la referencia 11). En ELISA de unión competitiva, el anti- cuerpo del antígeno analito es adsorbido en la fase sólida mediante interacciones hidrofó- bicas. Entonces se agrega una cantidad conocida de antígeno marcado con enzima junto con la muestra que contiene antígeno no marcado. Siguiendo la incubación, los pozos se lavan y se adiciona el sustrato de la enzima para producir por lo regular un producto co- lorido vía una reacción catalizada por enzima. Se produce una coloración máxima (máxima reacción enzimática) si no hay antígeno en la muestra que compita por la unión con el antígeno marcado, y esto disminuye en proporción a la cantidad de antígeno en la muestra. En esta técnica se requieren cantidades relativamente grandes de antígeno purificado, para que el marcado sea uniforme. Los ensayos sándwich son no competitivos, dado lo cual la muestra se adiciona a los pozos que contienen al anticuerpo adsorbido, seguido (después de la incubación) por la adición de un anticuerpo marcado con enzima, el cual se une en proporción a la canti- dad de antígeno unido. El anticuerpo no combinado y marcado se separa por lavado, y entonces la fase sólida contiene el antígeno sándwich entre anticuerpos no marcado y mar- cado. Entonces, el color que produce la reacción enzimática es directamente proporcional a la cantidad de antígeno. En la prueba ELISA indirecta, el antígeno de la muestra se adsorbe primero en la fase sólida, sea en forma directa o a través de un anticuerpo, como se mencionó antes. El anticuerpo primario no marcado se adiciona, se incuba y se lava. Por último se agrega un anticuerpo secundario marcado (que surge contra la clase de inmunoglobulina de la espe- cie de la cual se originó el anticuerpo primario), se incuba y se lava. También aquí la actividad enzimática (intensidad del color producido) es proporcional a la cantidad de antígeno. La ventaja de este método es que se puede usar un anticuerpo “universal” con- jugado como el anticuerpo secundario contra todos los anticuerpos primarios usados de la misma clase de inmunoglobulina de la especie apropiada. Entonces no se requieren anti- Figura 24.7. Ensayos de ELISA. Ag es el antígeno analito. En la unión competitiva, el antí- geno analito y el antígeno mar- cado compiten para ocupar sitios en el anticuerpo adsor- bido. En los ensayos sándwich, el an- tígeno analito se une al anti- cuerpo adsorbido y después el anticuerpo marcado se une al antígeno marcado. En la prueba ELISA indirecta se usa un anticuerpo universal mar- cado. Ac ¬ E Ag Ag ¬Ac ¬ E Inmunoensayo enzimático con unión no competitiva. E se inhibe al combinarse. ¬Ac Ag ¬ E ¬Ac ¬Ag Ag ¬Ac ¬AgE ELISA competitiva. La cantidad de uniones Ag¬E decrece conforme aumenta Ag. ¬Ac Ag ¬Ac ¬Ag ¬Ac¬Ag Ac¬E ¬Ac¬Ag¬Ac¬E ELISA no competitiva en sándwich. La unión AcE aumenta en proporción de la cantidad de Ag. MM M MM MM 24Christian(678-692).indd 69024Christian(678-692).indd 690 9/12/08 16:03:119/12/08 16:03:11 cuerpos primarios marcados individualmente para cada antígeno analito. Los métodos de ELISA indirectos suelen ser más sensibles que los directos, tal vez debido a la unión de más de un anticuerpo secundario marcado a cada anticuerpo primario; además, los sistemas no competitivos suelen ser más sensibles que las determinaciones competitivas. Referencias recomendadas Objetivos de aprendizaje Preguntas ALGUNOS DE LOS PUNTOS CLAVE QUE SE APRENDIERON EN ESTE CAPÍTULO ● ¿Qué se mide en la composición de la sangre? (Figura 24.2, tabla 24.1, tabla 24.2), p. 678 ● Inmunoensayos: antígeno, anticuerpo; ensayo por inmunofluorescencia, inmunoen- sayo enzimático (ELISA), p. 683 1. ¿Cuáles son los principales componentes de la sangre? 2. ¿Qué es hemólisis y por qué es importante? 3. ¿Por qué con frecuencia se añade fluoruro de sodio a las muestras de sangre tomadas para analizar la glucosa? 4. ¿Por qué no deben congelarse las muestras de sangre? 5. ¿Cuáles son dos de los análisis clínicos que se practican con mayor frecuencia? 6. ¿Qué es un anticuerpo? 7. Explicar los principios de los inmunoensayos. ¿Qué marcadores se usan? ¿Cuáles son algunas de sus variaciones en sus aplicaciones? GENERAL 1. C. A. Burtis y E. R. Ashwood, eds., Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, 4a. ed., Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry, 1995. 2. C. A. Burtis y E. R. Ashwood, eds., Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3a. ed., Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry, 1998. 3. M. Reiner y D. Seligson, eds., Standard Methods in Clinical Chemistry. San Diego: Academic. Serie de varios volúmenes iniciada en 1953. 4. D. Glick, ed., Methods of Biochemical Analysis. Nueva York: Wiley-Interscience. Serie de volúmenes anuales, iniciada en 1954. 5. D. S. Young y R. B. Friedman, Effect of Diseases on Clinical Laboratory Tests, 4a. ed., Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry, 2001. 6. D. S. Young y R. B. Friedman, Effect of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 5a. ed., Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry, 2000. 7. J. Wang, Electroanalytical Techniques in Clinical Chemistry and Laboratory Medi- cine. Nueva York: VCH, 1988. REFERENCIAS RECOMENDADAS 24Christian(678-692).indd 69124Christian(678-692).indd 691 9/12/08 16:03:119/12/08 16:03:11 CAPÍTULO 24 QUÍMICA CLÍNICA INMUNOENSAYOS 8. J. T. Wu, Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting, and Clinical Applications. Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry, 2000. 9. C. P. Price y D. J. Newman, Principles and Practice of Immunoassay, 2a. ed., Ba- singstoke Hampshire, UK: Macmillan, 1997. 10. S. A. Berson y R. S. Yallow, “Immunoassay of Plasma Insulin”, Immunoassay of Hormones, Ciba Found. Colloq. Endocrinol., 14 (1962) 182. 11. T. A. Kelly y G. D. Christian, “Homogeneous Enzymatic Fluorescence Immunoassay of Serum IgG by Continuous-FlowInjection Analysis”, Talanta, 29 (1982) 1109. 12. C. M. O´Donnell y S. C. Suffin, “Fluorescence Immunoassays”, Anal. Chem., 51 (1979) 33A. 13. E. Engvall y P. Perlman, “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Quanti- tative Assay of Immunoglobulin G”, Immunochemistry, 8 (1971) 871. 24Christian(678-692).indd 69224Christian(678-692).indd 692 9/12/08 16:03:129/12/08 16:03:12
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