UNIDAD 2-2

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2do paso I OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA 
TINCIÓN DE GRAM 
W Uso C clasificar a las bacterias en Gram+ y Gram- 
 
 
 
W Pasos 
 
 
W Observación 
 
PREVIA COLORACIÓN 
DIRECTA 
W asepsia 
W recipiente estéril 
W representativa del proceso infeccioso 
C orina, 
C materia fecal, 
C LCR, 
C sangre, 
C material de heridas, 
C secreciones, etc 
1er paso I TOMA DE MUESTRA 
C Cubrir la preparación con cristal violeta 
C Lavar con agua y escurrir 
C Añadir solución yodada 
C Lavar con agua y escurrir 
C Decolorar con alcohol o acetona 
C Lavar con agua y escurrir 
C Añadir fucsina o safranina 
C Lavar con agua, escurrir y dejar secar 
 C Gram+ H violeta 
C Gram– H rosado 
TINCIONES 
C Preparación del frotis 
C Secado 
C Fijación 
C Tinción 
C Observación 
 
C Carga del ansa con la muestra 
C Colocación de la muestra en un porta 
C Colocación de un cubre 
C Observación 
 
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN 
W Uso C identificar bacilos ácido-alcohol resistentes (Mycobacterium) 
 
 
W Pasos 
 
 
 
W Observación C bacilos ácido-alcohol resistentes H rojo 
C Cubrir la preparación con fucsina fenicada 
C Volcar el exceso y calentar a la llama 
C Lavar con agua y escurrir 
C Decolorar con HCl en etanol 
C Lavar con agua y escurrir 
C Añadir azul de metileno 
C Lavar con agua, escurrir y dejar secar 
 
 TINCIÓN DE ESPORAS 
W Uso C identificar bacterias esporuladas (Bacillus, Clostridium) 
 
W Pasos 
 
W Observación 
 
C Cubrir la preparación con verde malaquita 
C Volcar el exceso y calentar a la llama 
C Lavar con agua y escurrir 
C Añadir safranina 
C Lavar con agua, escurrir y dejar secar 
 
Con anticuerpos fluorescentes 
 
TINCIONES FLUORESCENTES 
W Utilizan fluorocromos 
C Colocar una gota de tinta china sobre la muestra 
C Mezclar 
C Colocar cubreobjetos 
C Absorber el exceso con papel de filtro 
 
TINCIÓN NEGATIVA DE CÁPSULA 
W Uso C identificar bacterias con cápsula (Cryptococcus) 
 
W Pasos 
W Observación C halos blancos en fondo negro 
 
C célula vegetativa H rosa 
C espora H verde 
conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros 
componentes necesarios para el desarrollo de microorganismos 
3er paso I SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO 
Con naranja de acridina 
 
Con rodamina-auramina 
 
C agente gelificante 
Agentes reductores 
Fluidos corporales 
Indicadores de pH 
Sist amortiguadores 
Peptonas 
Extractos 
Agar 
Agentes selectivos 
Carbohidratos 
constituyentes 
C mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados 
C preparados deshidratados extraídos de tejidos animales o vegetales 
C aportan fact de crecimiento y sust que neutralizan inhibidores 
del crecimiento 
C mantienen el pH en el rango óptimo de crecimiento bacteriano 
C detectan variaciones de pH 
C permiten el desarrollo de microorg microaerófilos o 
anaerobios anaerobios 
C permiten el crecimiento de un determinado tipo de microorg 
C promueven el crecimiento y determinan si el microorg puede 
producir ácidos producir ácidos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GENERALES O NUTRITIVOS 
W Permiten el desarrollo de gran 
variedad de microorganismos 
DE ENRIQUECIMIENTO 
W Favorecen el crecimiento de un 
determinado tipo de microorg 
SELECTIVOS 
W Favorecen el crecimiento de un 
tipo de microorg inhibiendo el 
crecimiento de los demás 
DIFERENCIALES 
W Resaltan propiedades 
especiales de un determinado 
tipo de microorganismo 
DE TRANSPORTE 
W Se utilizan para el transporte 
y conservación de las muestras 
CROMOGÉNICOS 
W Poseen sust cromogénicas para 
detectar distintas ez producidas 
por los microorganismos 
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO 
S Según su estado físico 
M Líquidos C sin agar 
M Sólidos C agar 12-15g/L 
M Semisólidos C menor proporción de agar 
Agar sangre 
W Componentes: 
C Base: rica en nutrientes 
C Suplemento: sangre 
W Uso H comprobar capacidad 
hemolítica 
S Diferencial 
G MEDIOS UTLIZADOS HABITUALMENTE H 
Agar chocolate 
W Se obtiene al calentar el agar 
sangre 
S De enriquecimiento 
Agar MacConkey 
W Componentes: 
C Sales biliares 
C Cristal violeta 
C Lactosa 
S Selectivo para Gram- 
S Diferencial para distinguir las 
bacterias que fermentan lactosa 
y las que no 
Agar EMB o Levine 
W Componentes: 
C Eosina 
C Azul de metileno 
C Lactosa 
S Selectivo para Gram- 
S Diferencial para distinguir las 
bacterias que fermentan lactosa 
y las que no 
 
Agar S-S (Salmonella-Shigella) 
S Selectivo para Salmonella y 
Shigella en cultivos entéricos 
S Diferencial para distinguir 
Salmonella (fermenta CH) de 
Shigella (no fermenta CH) Agar Thayer-Martin 
W De enriquecimiento 
W Uso H aislamiento de 
Neisseria gonorrhoeae y 
Neisseria meningitides 
 
 
Medio Lowesten Jensen 
S Selectivo: Mycobacterium 
 
Caldo tioglicolato 
S De enriquecimiento 
W Uso H crecimiento de 
anaerobios (fondo), aerobios 
(superficie) y anaerobios 
facultativos (en todo el tubo) 
Infusión cerebro corazón 
S Nutritivo 
W Uso H elaboración de otros 
medios, pj: hemocultivo 
 
Medios para hemocultivos 
S De enriquecimiento para 
bacterias en sangre 
W Uso H detectar bacteriemia 
(bacterias en sangre) 
Preparación de los medios de cultivo 
C Seleccionar el medio adecuado 
C Pesar y añadir el volumen de agua necesario 
C Disolver el medio calentándolo y agitándolo 
C Esterilizar el medio en autoclave (121ºC por 5´) 
 Si no se plaquea en el momento: 
C el medio se solidifica por lo 
que se debe derretir a baño 
María 
Si se plaquea en el momento: 
C esperar a que se enfríe (40ºC 
- 45ºC) 
4to paso I PRUEBAS BIOQUÍMICAS 
A una colonia aislada del cultivo. Permiten identificar características metabólicas y propiedades 
químicas 
PRUEBA DE LA COAGULASA 
C Colocar plasma en un tubo de ensayo 
C Agregar una muestra de la colonia en estudio 
C Colocar a 37º durante 1,5 horas 
W Uso M determinar la capacidad de las bacterias de coagular el 
plasma por la acción de la coagulasa. Diferencia especies del género 
Staphylococcus. 
W Resultado M positivo C se observa una red de fibrina (coágulo) 
PRUEBA DE LA CATALASA 
C Colocar una gota de agua oxigenada en un porta 
C Cargar el ansa con la muestra y colocarla en el porta en contacto 
con el agua oxigenada 
W Uso M identificar bacterias que hidrolizan peróxido de hidrógeno 
en oxígeno y agua por acción de la catalasa 
W Resultado M positivo C liberación de O2 observable a simple 
vista (formación de burbujas) 
 
 
TSI (Agar Hierro Triple Azúcar) 
W Uso M determinar la capacidad de un microorg de fermentar CH 
(glucosa, lactosa y sacarosa) produciendo ácido o ácido con gas 
W Indicador M rojo fenol 
W Resultados 
H Pico de flauta 
H Fondo 
No fermenta CH 
rojo 
rojo 
Preparación de los medios para pruebas bioquímicas 
C Seleccionar el medio adecuado 
C Pesar y añadir el volumen de agua necesario 
C Disolver el medio calentándolo y agitándolo 
C Esterilizar el medio en autoclave (121ºC por 5´) 
C Esperar a que se enfríe 
C Preparar los tubos 
H tubo vertical M ansa recta, picadura 
H tubo inclinado (pico de flauta) M ansa recta, picadura, estriación 
Fermenta glucosa 
rojo 
amarillo 
Fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa 
amarillo 
amarillo 
PRUEBA DEL CITRATO 
W Uso M determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar 
citrato como única fuente de carbono produciendo alcalinidad 
W Resultados 
H Negativo C verde 
H Positivo C azul 
 
PRUEBA DE LA UREASA 
W Uso M determinar la capacidad de un microorganismo de 
desdoblar la urea mediante la ureasa produciendo CO2 y alcalinidad 
W Resultados 
H Negativo C amarillo pálido 
H Positivo C púrpura o fucsia 
 
PRUEBA DE LA FENILALANINA 
W Uso M determinar la capacidad de ciertos microorganismo de 
producir la desaminación oxidativa de la fenilalanina (aa) 
W Lectura M revelar con FeCl3 
WResultados 
H Negativo C amarillo 
H Positivo C verde 
 
 
SIM (sulfhídrico, indol, motilidad) 
W Uso M determinar si la bacteria es capaz de liberar ác 
sulfhídrico x acción enzimática sobre los aa que contienen azufre 
W Resultado M positivo C negro 
W Uso M determinar si la bacteria es capaz de desdoblar el 
triptófano produciendo indol 
W Lectura M revelar con reactivo de Ehrlich 
W Resultados 
M positivo C anillo rojo en la superficie 
M negativo C anillo amarillo en la superficie 
W Uso M determinar si la bacteria es móvil 
W Resultado M positivo C crecimiento fuera de la línea de siembra 
 
PRUEBA DE LA LISINA DESCARBOXILASA 
W Uso M determinar la capacidad de un microorganismo para 
descarboxilar o desaminar la lisina (aa) produciendo alcalinidad del 
medio 
W Resultados 
H Pico de flauta 
H Fondo 
Descarboxila 
violeta 
violeta 
 
No Descarboxila 
violeta 
amarillo 
 
Desamina 
rojo 
amarillo 
 
5to paso I ANTIBIOGRAMA 
Método utilizado para determinar la sensibilidad de una cepa bacteriana frente a distintos antibióticos 
MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR 
S A partir de cultivos monomicrobianos con colonias bien definidas 
C Preparar una suspensión de las colonias (en tubo) hasta obtener una turbidez correspondiente al 
testigo 0,5 de la escala de McFarland (Cl2Ba 0,5%) 
C Mojar un hisopo estéril en la suspensión. Escurrir el exceso contra las paredes del tubo y taparlo 
C Inocular la placa con el hisopo (agar Mueller Hinton) 
C Tomar con pinzas un disco de cada antibiótico y depositarlos sobre la placa 
C Incubar durante 24 horas 
S Resultado H antibióticos efectivos producen ausencia de crecimiento a su alrededor 
6to paso I SEROLOGÍA 
Detección de Ag O, H y K según corresponda mediante la reacción con Ac específicos 
Reacción Ag + Ac H aglutinación 
7mo paso I TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 
Permiten determinar directamente los genes que codifican factores de virulencia.