Tesis Doctoral Lambertucci Flavia

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FACULTAD DE CIENCIAS BIOQUÍMICAS Y 
FARMACÉUTICAS 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO 
 
 
Tesis de Doctorado 
 
“Rol del receptor del Factor de Necrosis Tumoral 
alfa (TNFR1) en la patogénesis de la enfermedad 
del hígado graso no alcohólico” 
 
Presentada por Flavia Lambertucci 
 
 
Rosario, Argentina 
 
2019 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“La conclusión final es que sabemos muy poco, y no 
obstante es asombroso que sepamos tanto, y más 
sorprendente aún que tan poco conocimiento nos dé 
tanto poder.” 
Bertrand Russell 
 
 
 
 
 
 
I 
 
“Rol del receptor del Factor de Necrosis Tumoral alfa 
(TNFR1) en la patogénesis de la enfermedad del hígado graso 
no alcohólico” 
 
 
Flavia Lambertucci 
Licenciada en Biotecnología 
Universidad Nacional de Rosario 
 
 
Esta Tesis es presentada como parte de los requisitos para optar al grado académico de 
Doctor en Ciencias Biológicas, de la Universidad Nacional de Rosario y no ha sido 
presentada previamente para la obtención de otro título en esta u otra Universidad. La 
misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a cabo en el Instituto 
de Fisiología Experimental (IFISE – CONICET), Área Fisiología, Departamento de 
Ciencias Fisiológicas, dependiente de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y 
Farmacéuticas, durante el período comprendido entre el 1º de abril de 2014 y el 31 de 
marzo de 2019, bajo la dirección del Dra. Ma. Teresa Ronco. 
 
 
Dra. Ma. Teresa Ronco, Directora 
 
Dr. Daniel Eleazar Francés, Co-Director 
 
Dra. Marta Casado Pinna, Co-Directora externa 
 
Dra. Elena N. De Matteo, Jurado de Tesis 
 
Dra. Stella M Mattaloni, Jurado de Tesis 
 
Dra. Fabiana García, Jurado de Tesis 
 
Defendida: 02/05/19 
 
II 
 
Parte de los resultados que se describen en el presente trabajo de Tesis fueron publicados 
en las revistas y reuniones científicas que se detallan a continuación: 
 
Publicaciones: 
 
“DISRUPTION OF TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA RECEPTOR 1 
SIGNALING ACCELERATES NAFLD PROGRESSION IN MICE UPON A HIGH FAT 
DIET”. 
Flavia Lambertucci, Ainelén Arboatti, María Guillermina Sedlmeier, Omar Motiño, 
María de Lujan Álvarez, María Paula Ceballos, Silvina Villar, Eduardo Roggero, Gerardo 
Pisani, Ariel Quiroga, Paloma Martín-Sanz, Cristina Carnovale, Daniel Francés, Maria 
Ronco. 
Journal of Nutritional Biochemistry. 2018. Aug;58:17-27. 
doi: 10.1016/j.jnutbio.2018.04.013. 
 
Presentaciones a Congresos: 
 
“ROLE OF TUMOR NECROSIS FACTOR-ALPHA RECEPTOR 1 (TNFR1) 
SIGNALING PATHWAY IN THE PROGRESSION OF HEPATIC STEATOSIS AND 
LIVER DAMAGE” 
Flavia Lambertucci, Ainelén S. Arboatti, Juan A. Monti, Gerardo B. Pisani, Eduardo 
Roggero, Ariel D. Quiroga, Cristina E. Carnovale, Daniel E. Francés, Ma. Teresa Ronco. 
Argentina. Buenos Aires. 2017. Abstract. Congreso. Reunión Conjunto de Sociedades de 
Biociencias 2017. 
 
“DISRUPTION OF TUMOR NECROSIS FACTOR-ALPHA RECEPTOR 1 
SIGNALLING PATHWAY INCREASES INTERLEUKIN-1 BETA LEVELS, 
EXACERBATES LIVER INSULIN RESISTANCE AND APOPTOSIS DURING A 
HIGH FAT DIET” 
Flavia Lambertucci, Ainelén S. Arboatti, Ma. Guillermina Sedlmeier, Eduardo Roggero, 
Ariel D. Quiroga, Cristina E. Carnovale, Daniel E. Francés, Ma. Teresa Ronco. 
 
III 
 
AMSTERDAM, THE NETHERLANDS. 2017. Abstract. Oral presentation. Congress. 
52nd annual EASL meeting. The International Liver Congress 2017. THE EUROPEAN 
ASSOCIATION FOR THE STUDY OF THE LIVER. 
 
“DISRUPTION OF TUMOR NECROSIS FACTOR ALFA RECEPTOR 1 (TNFR1) 
SIGNALING PATHWAY INCREASES INTERLEUKIN-1 BETA LEVELS, 
EXACERBATES HEPATIC INFLAMMATORY RESPONSE AND APOPTOSIS 
DURING A HIGH FAT DIET (HFD)” 
Flavia Lambertucci, Ma. Guillermina Sedlmeier, Ainelén S. Arboatti, Silvina Villar, Ma. 
Paula Ceballos, Eduardo Roggero, Ma. De Luján Álvarez, Ariel D. Quiroga, Cristina E. 
Carnovale, Daniel E. Francés, Ma. Teresa Ronco. 
Resumen. Congreso. LXI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación 
Clínica (SAIC). Buenos Aires, Argentina. Noviembre 2016. 
 
“ESTUDIO DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN HEPÁTICA DE INSULINA EN 
RATONES KNOCK-OUT PARA EL RECEPTOR TNFR1 (KOR1) EN UN MODELO 
DE DIETA RICA EN GRASA (HIGH FAT DIET, HFD)” 
Flavia Lambertucci, Ainelén S. Arboatti, Ma. Guillermina Sedlmeier, Silvina Villar, Ma. 
Paula Ceballos, Eduardo Roggero, Ma. De Luján Álvarez, Ariel D. Quiroga, Cristina E. 
Carnovale, Daniel E. Francés, Ma. Teresa Ronco. 
Resumen. Congreso. LX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación 
Clínica (SAIC) y Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS). Buenos 
Aires, Argentina. Noviembre 2015. 
 
“EL KNOCK-OUT PARA TNFR1 (KOR1) PROMUEVE LA APOPTOSIS HEPÁTICA 
EN DIABETES MELLITUS TIPO 2 (DBT2) GENERADA POR UNA DIETA RICA EN 
GRASA (HIGH FAT DIET, HFD)” 
Flavia Lambertucci, Daniel E. Francés, Celeste Molina, Gerardo B. Pisani, Juan A. Monti, 
Ma. De Luján Álvarez, Eduardo Roggero, Cristina E. Carnovale, Ma. Teresa Ronco. 
Resumen. Congreso. LIX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación 
Clínica (SAIC). Buenos Aires, Argentina. Noviembre 2014. 
 
 
 
 
IV 
 
Estancias en el exterior: 
 
Beca “iCOOP+”, del CSIC (Consejo Superior de Investigaciones Científicas), España. 
Programa CSIC de cooperación científica para el desarrollo iCOOP +. 
Proyecto: “Papel del TNFR1 en la función mitocondrial hepática asociada a estados de 
resistencia a la insulina y obesidad”. 
Estancia: Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV). 6 meses en 2017 y 3 meses en 
2018, bajo la dirección de la Dra. Marta Casado Pinna. 
 
Índice de contenidos 
V 
 
ÍNDICE DE CONTENIDOS 
ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS ..................................................................................X 
LENGUAJE ESPECIAL ............................................................................................. XIV 
RESUMEN .................................................................................................................... XV 
ABSTRACT ................................................................................................................. XVII 
1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................... - 1 - 
1.1 Enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD, de sus siglas en inglés: 
Non-Alcoholic Fatty Liver Disease) ....................................................................... - 1 - 
1.1.1 Prevalencia y mecanismos fisiopatológicos de NAFLD ........................ - 1 - 
1.1.2 Obesidad, resistencia a la insulina y NAFLD......................................... - 2 - 
1.1.3 Bases metabólicas de la patogénesis de NAFLD ................................... - 4 - 
1.1.3.1 Vías de señalización de la insulina y su asociación con NAFLD ... - 8 - 
1.1.4 Modelos animales de obesidad e insulino resistencia .......................... - 10 - 
1.2 Mecanismos involucrados en la progresión a NASH............................... - 12 - 
1.2.1 Activación de células esteladas y fibrogénesis ..................................... - 13 - 
1.2.2 Estrés oxidativo y disfunción mitocondrial. Relación con la resistencia a la 
insulina e inflamación ......................................................................................... - 14 - 
1.2.3 Apoptosis y autofagia ........................................................................... - 17 - 
1.2.4 -oxidación en NASH .......................................................................... - 19 - 
1.2.5 Proceso inflamatorio en la progresión a NASH ................................... - 21 - 
1.2.5.1 Citoquinas pro-inflamatorias y tipos celulares hepáticos implicados en 
la insulino resistencia y NAFLD ..................................................................... - 22 - 
1.3 Señalización de TNF- a través del receptor TNFR1 .............................. - 25 - 
1.3.1 Deficiencia en la señalización mediada por TNFR1 y su efecto sobre 
inflamación,obesidad e insulino resistencia ....................................................... - 26 - 
2 OBJETIVOS ...................................................................................................... - 29 - 
Índice de contenidos 
VI 
 
3 MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... - 31 - 
3.1 Reactivos .................................................................................................. - 31 - 
3.2 Estudios in vivo ........................................................................................ - 31 - 
3.2.1 Modelo experimental ............................................................................ - 31 - 
3.2.1.1 Eutanasia y determinaciones plasmáticas ..................................... - 32 - 
3.2.2 Prueba de tolerancia a la glucosa .......................................................... - 33 - 
3.2.3 Prueba de tolerancia a la insulina ......................................................... - 33 - 
3.2.4 Prueba de tolerancia al piruvato ........................................................... - 34 - 
3.2.5 Determinación de los niveles plasmáticos de insulina y citoquinas ..... - 34 - 
3.2.6 Evaluación histológica .......................................................................... - 34 - 
3.2.7 Determinación de la secreción de VLDL ............................................. - 35 - 
3.2.8 Análisis de la composición de AGL plasmáticos ................................. - 36 - 
3.2.9 Evaluación del daño oxidativo ............................................................. - 36 - 
3.2.9.1 Estimación de los niveles de lipoperoxidación ............................. - 36 - 
3.2.9.2 Determinación de la actividad de NADPH oxidasa ...................... - 37 - 
3.2.10 Ensayo de la actividad de caspasa 3 ..................................................... - 37 - 
3.3 Técnicas de manipulación de ácidos nucleicos ........................................ - 37 - 
3.3.1 Aislamiento de ARN y síntesis de ADN complementario (ADNc) ..... - 37 - 
3.3.2 Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real ........ - 38 - 
3.4 Técnicas para la determinación de los niveles de expresión de proteínas: 
análisis por Western Blot ...................................................................................... - 40 - 
3.5 Estudios in vitro ....................................................................................... - 42 - 
3.5.1 Aislamiento y cultivo de células hepáticas de ratón ............................. - 42 - 
3.5.1.1 Aislamiento y análisis por citometría de flujo de células no 
parenquimales hepáticas (NPCs) ..................................................................... - 42 - 
3.5.1.2 Citometría de flujo ........................................................................ - 43 - 
3.5.1.3 Análisis de apoptosis por citometría de flujo ................................ - 43 - 
Índice de contenidos 
VII 
 
3.5.2 Caracterización de la línea celular NCL-V3 ......................................... - 44 - 
3.5.2.1 Línea celular hepática NCL-V3 .................................................... - 44 - 
3.5.2.2 Cultivo y mantenimiento de la línea celular NCL-V3 .................. - 44 - 
3.5.2.3 Determinación de la captación de glucosa .................................... - 45 - 
3.5.2.4 Determinación de los niveles de glucógeno .................................. - 45 - 
3.5.2.5 Tinción con Rojo Nilo ................................................................... - 45 - 
3.5.3 Generación de una línea KO para TNFR1 a través de la técnica de 
CRISPR/Cas9 ...................................................................................................... - 46 - 
3.5.3.1 Técnica CRISPR/Cas9 para modificación genética ...................... - 46 - 
3.5.3.2 Diseño de guías, clonación y preparación de plásmidos ............... - 48 - 
3.5.3.3 Transfección clásica ...................................................................... - 51 - 
3.5.3.4 Detección de mutantes .................................................................. - 51 - 
3.5.3.5 Secuenciación y selección de clones ............................................. - 51 - 
3.5.4 Ensayo MTT ......................................................................................... - 52 - 
3.5.5 Respirometría de alta resolución utilizando Oxygraph-2K (OROBOROS) . 
 .............................................................................................................. - 52 - 
3.5.5.1 Células intactas .............................................................................. - 54 - 
3.5.5.2 Células permeabilizadas ................................................................ - 55 - 
3.6 Análisis estadístico de datos ..................................................................... - 56 - 
4 RESULTADOS .................................................................................................. - 57 - 
4.1 Estudio de la patogénesis de NAFLD derivada de una HFD en ratones KO 
para TNFR1 .......................................................................................................... - 57 - 
4.1.1 Establecimiento del modelo.................................................................. - 57 - 
4.1.2 Análisis de la respuesta a la insulina .................................................... - 58 - 
4.1.3 La interrupción de TNFR1 promueve la acumulación de grasa en el hígado
 .............................................................................................................. - 60 - 
Índice de contenidos 
VIII 
 
4.1.4 La ausencia de la vía de señalización mediada por TNFR1-KO produce una 
alteración en la secreción de VLDL .................................................................... - 60 - 
4.1.5 La interrupción en la vía de señalización de TNFR1 modifica la 
composición porcentual plasmática de ácidos grasos libres ............................... - 62 - 
4.1.6 Los ratones TNFR1-KO presentan una alteración en el metabolismo 
lipídico .............................................................................................................. - 63 - 
4.2 Inflamación, resistencia a la insulina y apoptosis hepática en ratones HFD-
KO .................................................................................................................. - 65 - 
4.2.1 La ausencia de señalización de TNFR1 aumenta la infiltración hepática de 
células F4/80+ ...................................................................................................... - 65 - 
4.2.2 Ratones TNFR1-KO presentan una disminución en la vía de señalización 
de la insulina hepática ......................................................................................... - 67 - 
4.2.3 Los ratones TNFR1-KO exhiben características de un estado pro-
inflamatorio en el hígado .................................................................................... - 69 - 
4.2.4 Evaluación del proceso apoptótico y daño oxidativo ........................... - 70 - 
4.2.5 La resistencia a la insulina y la apoptosis hepática son dependientes de 
IL-1 en hepatocitos KO ..................................................................................... - 73 - 
4.2.6 La interrupción en la vía de señalización de TNFR1 conduce a la progresión 
de una esteatosis simple a una etapa más severa de NAFLD durante una HFD ......... 
 .............................................................................................................. - 75 - 
4.3 Estudio in vitro de la deficiencia del receptor TNFR1 en el hepatocito sobre 
la función mitocondrial ......................................................................................... - 76 - 
4.3.1 Caracterización metabólica de la línea celular hepática NCL-V3 ........ - 76 - 
4.3.2 Caracterización de una línea KO para TNFR1 generada por medio de la 
técnica CRISPR/Cas9.......................................................................................... - 78 - 
4.3.3 La disrupción en la vía de señalización de TNFR1 modifica la respiración 
mitocondrial en células enteras y permeabilizadas ............................................. - 79 - 
4.3.4 Estudio de la expresión génica en células hepáticas WT y KO para TNFR1
 .............................................................................................................. - 82 - 
Índice de contenidos 
IX 
 
4.3.5 Estudios de los complejos OXPHOS mitocondriales y los procesos de 
reciclado celulares en ratones HFD-KO ............................................................. - 83 - 
5 DISCUSIÓN ....................................................................................................... - 85 - 
6 CONCLUSIONES ............................................................................................. - 99 - 
7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... - 101 - 
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................ - 116 - 
 
 
Abreviaturas y símbolos 
X 
 
ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS 
(por orden alfabético) 
 
 
ACC Acetil-CoA Carboxilasa 
ADN Acido DesoxiriboNucleico 
ADNc Acido DesoxiriboNucleico complementario 
ADNg Acido DesoxiriboNucleico genómico 
ADNmt Acido DesoxiriboNucleico mitocondrial 
ADNn Acido DesoxiriboNucleico nuclear 
ADP adenosina difosfato (del inglés, Adenosine DiPhosphate) 
AGL Ácidos Grasos Libres 
AGPIs Ácidos Grasos PoliInsaturados 
AKT/PKB proteína quinasa B (del inglés, Protein Kinase B) 
ALT ALaninoaminoTransferasa 
AMPK proteín quinasa activada por monofosfato de adenina (del inglés, AMP-activated Protein 
Kinase) 
ANOVA análisis de la varianza (del inglés, ANalysis Of VAriance) 
AP-1 del inglés, Activator Protein-1 
APAF1 factor activador de la proteasa apoptótica 1 (del inglés, Apoptosis Protease-Activating 
Factor 1) 
ApoB Apolipoproteína B 
ARN Ácido RiboNucleico 
ARNm Ácido RiboNucleico mensajero 
AST ASpartatoaminoTransferasa 
ATP adenosina trifosfato (del inglés Adenosine TriPhosphate) 
BAD del inglés, BCL-2-Associated Death promoter 
BAT tejido adiposo marrón (del inglés Brown Adipose Tissue) 
BAX del inglés, BCL-2-Associated X protein 
BCL-xL del inglés, B-Cell Lymphoma-extra Large 
BID del inglés, BH3 Interacting-Domain death agonist 
BSA albúmina bovina sérica (del inglés Bovine Serum Albumin) 
CCCP desacoplador de carbonil cianuro-p-trifluorometoxifenilhidracona 
CCR2 receptor de quimioquina CC tipo 2 (del inglés, CC2 Receptor) 
CD cúmulo de diferenciación (del inglés, Cluster of Differentiation) 
CDR dominios ricos en cisteína (del inglés, Complementarity-Determining Regions) 
ChREBP proteína de unión del elemento de respuesta a carbohidratos (del inglés, Carbohydrate-
Responsive Element-Binding Protein) 
CKs Células de Kupffer 
CPT1 carnitina palmitoiltransferasa 1 (del inglés, Carnitine PalmitoylTransferase 1) 
CRISPR repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (de sus 
siglas en inglés, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). 
Cyt c citocromo c (del inglés, Cytocrome c) 
DGAT diglicérido-aciltransferasa (del inglés, DiacylGlycerol AcylTransferase) 
DIO modelos de obesidad inducidos por la dieta (del inglés, Diet-Induced Obesity) 
dL deciLitro 
DM Diabetes Mellitus 
DMEM del inglés, Dulbecco's Modified Eagle Medium 
dNTPs del inglés, deoxyNucleotide TriPhosphates 
ECL del inglés, Enhanced ChemiLuminescence 
EDTA tetra acetato de etilendiamina (del inglés, EthyleneDiamineTetraAcetic acid) 
EGTA ácido etilenglicol bis (aminoetil éter) tetraacético 
Abreviaturas y símbolos 
XI 
 
ELISA ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (del inglés, Enzyme-Linked 
ImmunoSorbent Assay) 
ELOVL elongasa de ácidos grasos (del inglés, ELongation Of Very-Long-chain fatty acids) 
EO Estrés Oxidativo 
ERK 1/2 del inglés, Extracellular signal–Regulated Kinase 
eWAT tejido adiposo epididimal (del inglés, epididimal White Adipose Tissue) 
F Forward 
FACS del inglés, Fluorescence-Activated Cell Sorting 
FADD dominio de muerte asociado a FAS (del inglés, Fas-Associated protein with Death 
Domain) 
FADH2 flavín adenín dinucleótido (del inglés, Flavin Adenine Dinucleotide) 
FADS2 desaturasa de ácidos grasos (del inglés, Fatty Acid DeSaturase 2) 
FAS ácido graso sintasa (del inglés, Fatty Acid Synthase) 
FOXO actores de transcripción FOXO (del inglés, FOrkhead boX class O) 
g gramo 
GAPDH Gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa (del inglés, GlycerAldehyde-3-Phosphate 
DeHydrogenase) 
GC cromatógrafo de gases (del inglés, Gas Chromatograph) 
GFP proteína verde fluorescente (del inglés, Green Fluorescent Protein) 
Glc Glucosa 
GLUT transportador de glucosa (del inglés, GLUcose Transporter) 
GPAT glicerol-3-fosfato aciltransferasa (del inglés, Glycerol-3-Phosphate AcylTransferase) 
GSK3 glucógeno sintasa quinasa 3β (del inglés, Glycogen Synthase Kinase 3β) 
GTT prueba de tolerancia a la glucosa (del inglés Glucose Tolerance Test) 
H&E hematoxilina-eosina 
HCC carcinoma hepatocelular (del inglés, HepatoCellular Carcinoma) 
HDL lipoproteína de alta densidad (del inglés, High-Density Lipoprotein) 
HDR reparación homóloga dirigida (del inglés, Homology Directed Repair) 
HEPES ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfónico 
HFD dieta rica en grasa (del inglés High Fat Diet) 
HOMA-IR modelo de homeostasis de la evaluación de la resistencia a la insulina (del inglés, 
HomeOstatic Model Assessment) 
HRPT del inglés, Hypoxanthine-guanine PhosphoRibosylTransferase 
HSCs células hepáticas esteladas (del inglés, Hepatic Stellate Cells) 
HSL lipasa sensible a hormona (del inglés, Hormone-Sensitive Lipase) 
i.p. intraperitoneal 
IA Índice Apoptótico 
IFN InterFeróN 
IGF factores de crecimiento similares a la insulina (del inglés, Insulin-like Growth Factor) 
IKK  del inglés, Inhibitor of nuclear factor Kappa-B Kinase subunit  
IL InterLeuquina 
IL-1 R1 receptor de IL-1 tipo I (del inglés, Interleukin 1 receptor type I) 
IMC Índice de Masa Corporal 
IR receptor de insulina (del inglés, Insulin Receptor) 
IRS proteínas adaptadoras de los sustratos del receptor de insulina (del inglés, Insulin 
Receptor Substrate) 
ITT prueba de tolerancia a la insulina (del inglés, Insulin Tolerance Test) 
iWAT tejido adiposo subcutáneo o inguinal (del inglés, inguinal White Adipose Tissue) 
JNK quinasa c-Jun N-terminal (del inglés, c-Jun N-terminal Kinase) 
kb kilobases 
kg kilogramo 
Kitt constante para la tasa de desaparición de la glucosa durante la prueba ITT (del inglés, 
constant for insulin tolerance test) 
KO Knock-Out 
L litro 
LC3-I proteína asociada a microtúbulos de la cadena ligera 3-I (del inglés Light Chain 3-I) 
LDL lipoproteína de baja densidad (del inglés, Low-Density Lipoprotein) 
LPO LipoPerOxidación 
Abreviaturas y símbolos 
XII 
 
LPS LipoPoliSacárido 
M molar 
mA miliamper 
MCD deficiente en metionina-colina (del inglés, Methionine-Choline Deficient) 
MCP-1 del inglés, Monocyte Chemoattractant Protein-1 
MDA malondialdehído 
mg miligramo 
µg microgramo 
µL microlitro 
Mill Millón de células 
mM milimolar 
MS espectrómetro de masas (del inglés, Mass Spectrometer) 
MTC tricrómica de Masson (MTC, del inglés Masson's trichrome 
mTOR del inglés, mammalian Target Of Rapamycin 
MuRF1 del inglés, Muscle Ring Finger 1 
MyD88 del inglés, Myeloid Differentiation primary response 88 
NAD+ Nicotidamina Adenina Dinucleótido 
NADH dinucleótido de nicotinamida adenina (del inglés, Nicotinamide Adenine Dinucleotide) 
NAFLD enfermedad de hígado graso no alcohólico (del inglés, Non-Alcoholic Fatty Liver 
Disease) 
NASH esteatohepatitis no alcohólica (del inglés, Non AlcoholicSteato Hepatitis) 
NFB factor de transcripción nuclear κB (del inglés Nuclear Factor κB) 
NHEJ unión de extremos no homólogos (del inglés, Non-Homologous End Joining) 
NLRP3 del inglés, NOD-Like Receptor Protein 
nm nanometro 
NOD dominio de oligomerización de nucleótidos (del inglés, Nucleotide-binding 
Oligomerization Domain) 
NOX4 NADPH Oxidasa 4 
NPCs células no parenquimales (del inglés, Non Parenchymal Cells) 
OCR tasa de consumo de oxígeno (del inglés, Oxygen Consumption Rate) 
OSCP proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina (del inglés, Oligomycin Sensitivity-
Conferring Protein) 
oxLDL lipoproteínas oxidadas de baja densidad 
OXPHOS fosforilación oxidativa (del inglés, OXidative PHOSphorylation) 
p.c. peso corporal 
p38MAPK del inglés, p38 Mitogen-Activated Protein Kinases 
PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida (del inglés, PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 
Pal Palmitato 
PAM motivo adyacente protospacer (del inglés, Protospacer Adjacent Motive) 
pb pares de bases 
PBS solución buffer salina de fosfatos 
PDK cinasa dependiente de PIP3 (del inglés, Phosphoinositide-Dependent Kinase) 
PGK del inglés, PhosphoGlycerate Kinase I 
PH del inglés, Pleckstrina Homology 
PI3K del inglés, PhosphoInositide 3-Kinase 
PINK1 del inglés, PTEN-INduced Kinase 1 
PIP3 fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (del inglés, PhosphatidylInositol 3-Phosphate) 
PP2A proteína fosfatasa 2A (del inglés, Protein Phosphatase 2A) 
PPAR receptor activado por proliferadores de peroxisoma (del inglés, Peroxisome 
Proliferator-Activated Receptor) 
PTT prueba de tolerancia a la piruvato (del inglés, Pyruvate Tolerance Test) 
PUMA del inglés, p53 Upregulated Modulator of Apoptosis 
PVDF fluoruro de polivinilideno (del inglés, PolyVinyliDene Fluoride) 
qPCR reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (del inglés, quantitative Polymerase 
Chain Reaction) 
R Reverse 
RFU unidades de fluorescencia relativa (del inglés, Relative Fluorescence Units) 
RHM macrófagos hepáticos reclutados (del inglés, Recruited Hepatic Macrophague) 
Abreviaturas y símbolos 
XIII 
 
RIP del inglés, Receptor-Interacting Protein 
RIPA buffer de lisis de RadioInmunoPrecipitAción 
ROS especies reactivas del oxígeno (del inglés, Reactive Oxidative Species) 
ROX consumo de oxígeno residual (del inglés, Residual OXygen consumption) 
RQ cantidad relativa (del inglés, Relative Quantity) 
RRC capacidad respiratoria de reserva (del inglés, Reserve Respiratory Capacity) 
RT RetroTranscripción 
SCD1 estearoil-CoA desaturasa 1 (del inglés, Stearoyl-CoA Desaturase 1) 
SDS dodecil sulfato de sodio 
SFB Suero Fetal Bovino 
sgRNA ARN guía único quimérico (del inglés, single guide RiboNucleic Acid) 
SREBP proteína de unión al elemento regulador de esteroles (del inglés, Sterol Regulatory 
Element-Binding Protein) 
TBARS sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (del inglés, ThioBarbituric Acid Reactive 
Substances) 
TCA ácido tricloroacético (del inglés TriChloroacetic Acid) 
TG TriGlicéridos 
TGF factor de crecimiento transformante (del inglés, Transforming Growth Factor) 
TLC cromatografía en capa fina (del inglés, Thin Layer Chromatography) 
TLR4 receptor de inmunidad innata tipo Toll 4 (del inglés, Toll-Like Receptor) 
TMPD del inglés, N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendiamine dihydrochloride 
TNFR receptor del factor de necrosis tumoral (del inglés, Tumor Necrosis Factor Receptor) 
TNF-  factor de necrosis tumoral-alfa (del inglés, Tumor Necrosis Factor-alfa) 
TRADD proteína asociada con el dominio de la muerte del receptor del TNF (del inglés, TNFR1-
Associated Death Domain protein) 
TRAF factores asociados al receptor TNF (del inglés, TNF Receptor Associated Factors) 
TUNEL del inglés, Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling 
UI Unidades Internacionales 
UPL del inglés, Universal ProbeLibrary 
V Voltios 
VLDL lipoproteínas de muy baja densidad (del inglés, Very Low-Density Lipoprotein) 
WAT tejido adiposo blanco (del inglés, White Adipose Tissue) 
WT Wild Type 
γ-GT γ-Glutamil-Transferasa 
 
 
 
 
https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/thin-layer-chromatography
Lenguaje Especial 
XIV 
 
LENGUAJE ESPECIAL 
Del inglés: 
ATP-linked: acoplado a ATP 
Clearance: depuración 
Crosstalk: cruzamiento-interacción 
Downstream: corriente abajo 
Fold change: veces de cambio 
Forward: cebador de PCR sentido 
Gesicles: vesículas especializadas 
Knock-down: pérdida parcial de función 
Knock-in: ganancia de función 
Knock-out: pérdida de función 
Maximal: frecuencia respiratoria máxima 
Melting: fusión 
Mouse: ratón 
Off-target: fuera del objetivo/diana 
Overnight: durante toda la noche 
Pellet: precipitado 
Plus: más 
Pool: grupo de entidades que se asocian con un fin común 
Primer: cebador de PCR 
Proton leak: fuga respiratoria de protones 
Protospacer: espaciador CRISPR 
Rabbit: conejo 
Reserve Capacity: capacidad de reserva 
Reverse: cebador de PCR anti-sentido 
Score: grado 
Screening: cribado 
Software: programa informático 
Starving: ayuno 
Swelling: hinchazón 
Target: diana (ej.: target gen = gen diana) 
Targeting: elegir como diana 
Upstream: corriente arriba 
Western blot: inmunoelectrotransferencia 
Wild type: tipo salvaje 
 
 
Del latín: 
ad libitum: a gusto 
de novo: de nuevo 
et al.: y colaboradores 
in situ: en la situación 
in vitro: aplicado al trabajo con células en cultivo 
in vivo: aplicado al trabajo con animales enteros 
per se: por sí mismo 
Resumen 
XV 
 
RESUMEN 
La enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) es una patología que abarca 
desde la mera acumulación de grasa en el hígado o esteatosis simple hasta un cuadro de 
mayor importancia clínica y pronóstica denominado esteatohepatitis no alcohólica 
(NASH), caracterizado por la presencia de infiltrado inflamatorio, daño hepático y muerte 
celular. La NAFLD está estrechamente relacionada con la obesidad, la resistencia a la 
insulina y el síndrome metabólico. Estas patologías presentan un estado inflamatorio 
crónico moderado, caracterizado por un aumento de citoquinas pro-inflamatorias, entre 
ellas, TNF- e IL-1. El papel del TNF- en el contexto de la obesidad y la resistencia a 
la insulina ha sido ampliamente estudiado, pero poco se sabe sobre el rol de la 
señalización dependiente de su receptor (TNFR1) en el hígado. En este trabajo, se evaluó 
la importancia biológica del TNFR1 en el desarrollo de la resistencia a la insulina y en la 
progresión de la esteatohepatitis, usando un modelo murino de "pérdida de función" (KO) 
y mediante la generación de una línea celular hepática deficiente en TNFR1. 
En esta Tesis, se observó que la alimentación con una dieta rica en grasa (HFD) induce 
en ratones un modelo de NAFLD, asociado al desarrollo de obesidad y resistencia a la 
insulina. La deficiencia en TNFR1 promueve la acumulación hepática de grasa e 
incrementa la infiltración hepática, promoviendo un estado pro-inflamatorio que es 
acompañado por un aumento en los niveles de IL-1. Estos ratones (HFD-KO) mostraron 
una menor activación de la vía de señalización de la insulina y un aumento en la apoptosis 
hepática, efectos que serían dependientes de IL-1; y, además, una alteración en el 
metabolismo lipídico y en la secreción hepática de VLDL. Por otro lado, se utilizó la línea 
celular hepática murina NCL-V3 para la generación de una línea KO para TNFR1 por 
medio de la técnica CRISPR/Cas9. Allí se observó que la deficiencia en TNFR1 altera el 
metabolismo energético y la respiración celular ante un estímulo lipotóxico con palmitato. 
El presente trabajo de Tesis revela un papel crítico para TNFR1 en el desarrollo de una 
enfermedad metabólica hepática. Estos hallazgos muestran por primera vez que la 
interrupción de la señalización de TNFR1 conduce a resistencia hepática a la insulinadebido a una mayor producción de IL-1β, que, a su vez, induce la acumulación de lípidos 
hepáticos y la activación de la maquinaria apoptótica, lo que lleva a la inflamación y el 
desarrollo de un estadio más severo de NAFLD, caracterizado por el aumento de 
marcadores de fibrogénesis. Además, la deficiencia en la vía de señalización de TNFR1, 
Resumen 
XVI 
 
en condiciones de alimentación con una HFD, produce alteraciones en el metabolismo de 
ácidos grasos, estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, y modificaciones en los procesos 
de reciclado celular y biogénesis mitocondrial. Estas evidencias señalan un nuevo papel 
funcional para TNFR1 en la patogénesis de NAFLD y en la progresión de esteatosis 
simple a una etapa más severa de NAFLD con características de NASH. 
 
 
Abstract 
XVII 
 
ABSTRACT 
Non Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) is a pathology that comprises from the 
mere accumulation of fat in the liver or simple steatosis to a picture of greater clinical and 
prognostic significance called Non Alcoholic Steatohepatitis (NASH), which is 
characterized by the presence of inflammatory infiltrate, accompanied by liver damage 
and cell death. NAFLD is closely related to obesity, insulin resistance and metabolic 
syndrome. These pathologies are accompanied by a moderate chronic inflammatory state, 
which is characterized by an increase in pro-inflammatory cytokines, including TNF- 
and IL-1. The role of TNF- in the context of obesity and insulin resistance has been 
thoroughly explored in recent years, but little is known about the implication of the 
signaling pathways of its receptor (TNFR1) in the liver. In this work, the biological 
importance of the deletion of TNFR1 in the development of insulin resistance and in the 
progression of steatohepatitis was evaluated, using a murine model of TNFR1 knock-out 
(KO) and, also, by the generation of a murine hepatic cell line TNFR1-KO. 
Throughout this Thesis, it was observed that a high-fat diet (HFD) feeding in mice 
induced a model of NAFLD, associated with the development of obesity and insulin 
resistance. The deficiency in TNFR1 promoted the hepatic accumulation of fat, increasing 
the hepatic infiltration of F4/80+ cells promoting a pro-inflammatory state accompanied 
by an increase in IL-1 levels. HFD-KO mice showed an impaired liver insulin signaling 
and an increase in hepatic apoptosis, both alterations being dependent on IL-1; and also 
showed modifications in lipid metabolism and in hepatic VLDL secretion. The murine 
liver cell line NCL-V3 was used for the generation of a knock-out line for TNFR1 using 
the CRISPR/Cas9 technology. The new cell line generated showed that the deficiency in 
TNFR1 alters energy metabolism, and cellular respiration that is affected by a lipotoxic 
stimulus as palmitic acid. 
The present work reveals a critical role for TNFR1 in the development of a hepatic 
metabolic disease. These findings showed for the first time that the interruption of TNFR1 
signaling pathway lead to hepatic insulin resistance mainly due to an increased production 
of IL-1β, which, in turn, induces the accumulation of hepatic lipids and the activation of 
the apoptotic machinery, leading to inflammation and the development of a more severe 
stage of NAFLD, assessed by an increase in fibrogenic markers. In addition, the 
impairment in the signaling pathway of TNFR1, under feeding conditions as a HFD, 
Abstract 
XVIII 
 
produced alterations in the metabolism of fatty acids, oxidative stress leading to 
mitochondrial dysfunction, and modifications in the cellular recycling processes and 
mitochondrial biogenesis. These evidences point out a key role of TNFR1 in the 
pathogenesis of NAFLD and in the progression from simple steatosis towards a more 
severe phenotype with many NASH features. 
 
 
 
 
Introducción 
- 1 - 
 
1 INTRODUCCIÓN 
1.1 Enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD, de sus 
siglas en inglés: Non-Alcoholic Fatty Liver Disease) 
1.1.1 Prevalencia y mecanismos fisiopatológicos de NAFLD 
La obesidad representa un importante desafío de salud a nivel mundial, sobre todo 
porque es considerado como un factor de riesgo para una amplia gama de enfermedades 
y por impulsar el desarrollo de comorbilidades relacionadas, como la resistencia a la 
insulina, la diabetes mellitus tipo 2 (DM2), enfermedades cardiovasculares y hepáticas 
(1). Entre las relacionadas al hígado, van desde la simple acumulación de grasa (esteatosis 
simple) hasta la esteatohepatitis no alcohólica (NASH, de sus siglas en inglés: Non-
Alcoholic Steato Hepatitis), fibrosis y cirrosis, colectivamente englobadas en el término 
de enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD, de sus siglas en inglés: Non-
Alcoholic Fatty Liver Disease) (1). 
NAFLD se define como un síndrome clínico-patológico, cuya característica principal 
es la acumulación de grasa en el tejido hepático, superior al 5% del peso del órgano, que 
no puede explicarse por el consumo excesivo de alcohol (2). Cubre un amplio espectro 
de daño hepático, en el que la esteatosis con inflamación progresa a NASH, fibrosis, 
cirrosis y puede llegar a hepatocarcinoma celular (HCC) (1). 
Aunque NAFLD está estrechamente relacionada con la obesidad, la resistencia a la 
insulina y el síndrome metabólico, la patogenia de NAFLD no ha sido aún dilucidada por 
completo (2, 3). Esta patología permaneció sin ser identificada hasta la década de 1980, 
pero hoy en día se la reconoce como la enfermedad hepática crónica más común en la 
mayor parte del mundo y la primera en los países occidentales (4). Las tasas de 
prevalencia oscilan entre el 6 y el 35% de la población en diferentes países, con una 
mediana del 20% (5, 6); esta alta variabilidad se atribuye a factores raciales y étnicos, así 
como a las diferencias en los métodos de diagnóstico, las costumbres alimenticias y el 
estilo de vida. La prevalencia de la enfermedad ha aumentado dramáticamente en todo el 
mundo; de forma que el porcentaje que representa NAFLD entre las enfermedades 
hepáticas crónicas aumentó de 47% a 75% en los últimos 20 años (6, 7). Actualmente se 
estima que casi el 70% de las personas obesas y diabéticas presentan esteatosis hepática 
Introducción 
- 2 - 
 
(1, 2). Como consecuencia de esta alta prevalencia, se espera que NAFLD se convierta 
en la principal causa de enfermedades hepáticas, trasplante de hígado y HCC en la 
próxima década (8). 
NAFLD tiene un amplio espectro histológico, desde la acumulación pura de 
triglicéridos (TG) en gotas lipídicas dentro de los hepatocitos, asociado con una 
inflamación insignificante (esteatosis macrovesicular simple) hasta la esteatohepatitis 
(NASH) caracterizada por un aumento en la inflamación y daño celular y posteriormente 
a la fibrosis y cirrosis (9). Afortunadamente, la esteatosis pura (es decir, sin la presencia 
de otras lesiones hepáticas) es una condición benigna, al menos a corto plazo, y en la 
mayoría de los sujetos, no tendrá efectos dañinos en la función hepática. Sin embargo, a 
largo plazo, la esteatosis puede progresar a NASH en el 10 a 20% de los pacientes (2, 10). 
La progresión de NAFLD parece implicar la aparición de lesiones "paralelas o 
múltiples impactos", como la disfunción mitocondrial inducida por estrés oxidativo (EO), 
el estrés del retículo endoplásmico, la inducción de la liberación de citoquinas pro-
inflamatorias y la sobrecarga de hierro, entre muchos otros. Estas diferentes cascadas de 
señalización, en conjunto, conducen al aumento en la inflamación, la muerte celular y la 
fibrogénesis, características de NASH (6). 
1.1.2 Obesidad, resistencia a la insulina y NAFLD 
La obesidad es una enfermedad crónica de origen multifactorial, caracterizada por un 
desbalance energético que resulta en la acumulación excesiva de grasa o hipertrofia del 
tejido adiposo en general (6). Como se indicó anteriormente, la formamás frecuente de 
NASH se presenta en pacientes obesos y en particular en aquellos con resistencia a la 
insulina y diversas combinaciones de hipertrigliceridemia y/o diabetes. Esta forma se 
observa a menudo en pacientes que padecen el síndrome metabólico, situación atribuible 
a la resistencia a la insulina y que combina varios trastornos metabólicos que se sabe que 
aumentan el riesgo de sufrir diabetes tipo 2 y enfermedades cardiovasculares (11). Una 
de las manifestaciones del síndrome metabólico es el desarrollo de la acumulación de 
lípidos hepáticos (NAFLD) junto con la resistencia a la insulina (12). 
El cuadro de obesidad y sus patologías asociadas se caracterizan por alteraciones en la 
circunferencia de la cintura, los niveles circulantes de TG, el colesterol de lipoproteínas 
de alta densidad (HDL, de sus siglas en inglés: High-Density Lipoprotein), 
Apolipoproteína B (ApoB), LDL (lipoproteína de baja densidad, de sus siglas en inglés: 
Introducción 
- 3 - 
 
Low-Density Lipoprotein) pequeñas y densas, resistencia sistémica a la insulina, la 
glicemia en ayunas, la presión arterial, un estado pro-trombótico y un perfil pro-
inflamatorio (11, 13). 
Un aspecto aún no explorado en la relación de la obesidad y el síndrome metabólico, 
se refiere al papel que tiene la resistencia a la insulina. La mayoría de las personas con 
múltiples factores de riesgo metabólico son resistentes a la acción de la insulina (1). Se 
han propuesto varios esquemas patogénicos para explicar la conexión entre la resistencia 
a la insulina y los factores de riesgo metabólicos. La resistencia a la acción de la insulina 
se define como la falta o disminución en la señalización que se desencadena en respuesta 
a esta hormona, por parte de sus órganos diana. No hay duda de que la resistencia a la 
insulina es un factor de riesgo para la intolerancia a la glucosa y la diabetes tipo 2. Por 
otro lado, se sabe que el aumento en la incidencia de sobrepeso/obesidad es el principal 
responsable del aumento de la prevalencia del síndrome metabólico y resistencia a la 
inuslina en todo el mundo (1, 2). 
Como consecuencia del aumento de obesidad a nivel mundial, se ha profundizado en 
el estudio del tejido adiposo, clasificando al mismo a partir de sus diferentes funciones. 
El tejido adiposo blanco (WAT, de sus siglas en inglés: White Adipose Tissue) y el tejido 
adiposo marrón (BAT, de sus siglas en inglés: Brown Adipose Tissue) son los tipos 
predominantes en los mamíferos (14). Si bien el WAT fue considerado históricamente 
como un órgano homogéneo, ahora se reconoce que alteraciones en el WAT abdominal o 
epididimal (eWAT, de sus siglas en inglés: epididymal White Adipose Tissue) tienen un 
impacto más negativo en la salud que sobre el WAT subcutáneo o inguinal (iWAT, de sus 
siglas en inglés: inguinal White Adipose Tissue) (14). De hecho, se han reportado 
diferencias fundamentales entre los depósitos de WAT, incluida su influencia en el 
metabolismo, la función endocrina, las características de los pre-adipocitos, la respuesta 
a una dieta con alto contenido de grasa, la expresión diferencial de genes, etc. (15). La 
acumulación de grasa en la parte superior del cuerpo (es decir, tejido adiposo visceral 
pero también subcutáneo abdominal) conlleva un mayor riesgo de desarrollar diabetes 
mellitus tipo 2 y enfermedades cardiovasculares, mientras que, en la parte inferior del 
cuerpo, las grasas gluteal subcutánea y femoral subcutánea, pueden ser metabólicamente 
protectoras. La expansión del tejido adiposo es necesaria para acomodar el consumo 
excesivo de energía y se caracteriza por el aumento en el tamaño de los adipocitos 
existentes (hipertrofia) y por el aumento en su número (hiperplasia) (14). La evidencia 
sugiere que una hiperplasia restringida, puede conducir a la deposición de lípidos 
Introducción 
- 4 - 
 
ectópicos en el hígado, el músculo esquelético, el corazón e incluso en las células β 
pancreáticas, un fenómeno que se ha descrito como deposición de grasa ectópica (13). El 
tejido adiposo tiene funciones secretoras al liberar adipoquinas, entre ellas la 
adiponectina, la leptina y la resistina (14). Se ha reportado que la adiponectina tiene 
propiedades antiinflamatorias y antiaterogénicas, mientras que la leptina puede 
desempeñar un papel sistémico además de ser un supresor del apetito (16), por otra parte, 
la resistina es una hormona derivada del tejido adiposo que aparentemente se opone a la 
acción de la insulina (13). La obesidad altera los niveles de varias hormonas de acción 
metabólica, como la resistina, el glucagón y la insulina, entre otras, lo que puede influir 
en la expresión de diferentes genes hepáticos (12). 
1.1.3 Bases metabólicas de la patogénesis de NAFLD 
El hígado es un órgano clave, que regula una gran variedad de procesos vitales para 
mantener la homeostasis metabólica. Estos incluyen, entre otros, el control de la 
producción de glucosa y el metabolismo de lípidos, cuya desregulación es característica 
del síndrome metabólico. El hígado también desempeña funciones fundamentales como 
parte del sistema inmune, dado que secreta tanto proteínas de fase aguda, como los 
componentes del complemento, además de diferentes citoquinas y quimioquinas (17). 
Normalmente, la insulina bloquea la lipólisis del tejido adiposo debido a la inhibición 
de la lipasa sensible a hormona (HSL, de sus siglas en inglés: Hormone-Sensitive Lipase) 
(18). HSL hidroliza el triacilglicerol en dos moléculas de ácidos grasos y 
monoacilglicerol, que luego se hidroliza por otra lipasa a glicerol y un ácido graso (18). 
En condiciones normales, los adipocitos sensibles a la insulina almacenan lípidos después 
de las comidas y luego liberan ácidos grasos durante el ayuno. Por el contrario, los 
adipocitos resistentes a la insulina, siguen liberando grandes cantidades de glicerol y 
ácidos grasos en la circulación, aún después de las comidas (19). Esto, a su vez, conduce 
a una movilización masiva de ácidos grasos libres (AGL) del tejido adiposo a otros 
tejidos, lo que provoca la acumulación ectópica intracelular de AGL (19). 
Los AGL hepáticos pueden tener diferentes fuentes, como los liberados por el tejido 
adiposo que pueden ser absorbidos por el hígado. También, los AGL hepáticos se pueden 
generar en el hígado a partir de la hidrólisis de los quilomicrones procedentes del 
intestino. Finalmente, se pueden sintetizar directamente dentro de los hepatocitos a través 
de la lipogénesis de novo (20). Dependiendo del estado nutricional/hormonal, los AGL 
Introducción 
- 5 - 
 
hepáticos ingresan a la mitocondria como sustratos de la -oxidación, o se esterifican en 
triglicéridos. Los triglicéridos hepáticos, a su vez, se acumulan dentro del citoplasma de 
los hepatocitos como gotas de grasa, o se secretan como lipoproteínas de muy baja 
densidad (VLDL, de sus siglas en inglés: Very Low-Density Lipoprotein) (20). Las 
partículas plasmáticas de VLDL están formadas por triglicéridos (y ésteres de colesterol), 
fosfolípidos y la proteína ApoB (20). En mamíferos, el ARNm que codifica para ApoB 
da lugar a dos proteínas distintas, ApoB100 y ApoB48. Esta edición de ARNm 
corresponde a una modificación postranscripcional, lo que resulta en la traducción del 
ARNm como una proteína truncada, ApoB48. A nivel de función, en humanos, la 
ApoB100 solo se expresa en el hígado y forma parte de VLDL y LDL. La ApoB48 se 
genera únicamente en el intestino delgado y forma parte de los quilomicrones (21). 
El aumento de grasa en el hígado también promueve el desarrollo de dislipidemia 
aterogénica. El catabolismo de los ésteres de colesterol derivados de LDL y los TG, 
implica el tráfico de LDL hacia los lisosomas y una mayor hidrólisis lisosómica hacia 
colesterol libre y AGL mediante la lipasa ácida lisosomal (lipofagia) (22). Curiosamente, 
los pacientes con NAFLD tienen menor actividad de la lipasa ácida lisosomal(23). En 
este sentido, también se sabe que la insulina es capaz de inhibir la autofagia en general (y 
la lipofagia en particular) (6). 
La acumulación ectópica de AGL en el músculo esquelético ha sido considerada como 
una causa fundamental de resistencia a la insulina en NAFLD, mientras que la resistencia 
a la insulina hepática podría ser un evento consecuente (24). Cuando el deterioro inducido 
por la resistencia a la insulina predomina en los tejidos extrahepáticos, el hígado recibe 
una sobrecarga de glucosa (no internalizada por los tejidos periféricos) e insulina (debido 
a la hiperinsulinemia compensatoria) (25). Bajo tal condición, tanto la insulina [a través 
de la activación del factor de transcripción, SREBP-1c (proteína de unión al elemento 
regulador de esteroles-1c, de sus siglas en inglés: Sterol Regulatory Element-Binding 
Protein)] como la glucosa [a través de la activación del factor de transcripción ChREBP 
(proteína de unión del elemento de respuesta a carbohidratos, de sus siglas en inglés: 
Carbohydrate-Responsive Element-Binding Protein)] inducen en el hígado la síntesis de 
AGL (26). El factor SREBP-1c activa la captación de AGL, la síntesis de AGL y la síntesis 
de TG, entre otras funciones; mientras que ChREBP estimula la transcripción de muchos 
genes lipogénicos y aquellos involucrados en la gluconeogénesis (27, 28). Además, la 
insulina estimula el receptor  activado por proliferadores de peroxisoma (PPAR de sus 
siglas en inglés: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor). De esta manera, la 
Introducción 
- 6 - 
 
activación de SREBP-1c y PPAR conllevan a un aumento en la expresión de enzimas 
involucradas en la síntesis de ácidos grasos [citrato liasa, acetil-CoA carboxilasa (ACC) 
y ácido graso sintasa (FAS, de sus siglas en inglés: Fatty Acid Synthase)] (29, 30). 
Además, estos factores de transcripción regulan la expresión de la glicerol-3-fosfato 
aciltransferasa (GPAT, de sus siglas en inglés: Glycerol-3-Phosphate AcylTransferase) y 
la estearoil-CoA desaturasa 1 (SCD1, de sus siglas en inglés: Stearoyl-CoA Desaturase) 
que promueven la formación y deposición de triacilglicerol (29). Estudios en ratones 
ob/ob (genéticamente obesos) han demostrado un aumento de 4 veces en los niveles de 
transcripto de SREBP-1c y un aumento de 6 veces en la síntesis de ácidos grasos de novo 
en el hígado, lo que sugiere que el aumento en la lipogénesis es un evento clave que 
conduce a esteatosis masiva (29). 
El aumento en la captación de AGL plasmáticos y en la síntesis de AGL hepático causa 
una expansión de la reserva de TG hepática responsable de la esteatosis. Debido a que la 
grasa no puede acumularse indefinidamente dentro de los hepatocitos, aparentemente se 
alcanza un nuevo estado de equilibrio. De hecho, varias vías de salida compensan las vías 
de entrada aumentadas. Las vías compensatorias podrían incluir la activación del receptor 
 proliferador de peroxisoma (PPAR) por el aumento de AGL y la activación de la -
oxidación mitocondrial de AGL debido a una desensibilización por parte de la carnitina 
palmitoiltransferasa 1 (CPT1, de sus siglas en inglés: Carnitine PalmitoylTransferase 1), 
una enzima de la membrana mitocondrial externa, al efecto inhibitorio de su inhibidor 
endógeno (malonil-CoA) (31). La entrada de AGL de cadena larga en las mitocondrias 
depende de CPT1 (32). Los altos niveles de malonil-CoA también pueden inhibir la CPT1 
y disminuir la oxidación de ácidos grasos (32). Por lo tanto, los AGL no se degradan, sino 
que se dirigen hacia la formación de triglicéridos, que se secretan como VLDL (32). 
Sin embargo, al agravarse aún más la acumulación hepática de productos lipídicos, en 
NAFLD avanzado hay un deterioro de la β-oxidación mitocondrial; que también puede 
aumentarse en etapas posteriores de la NASH, como un mecanismo compensatorio (33). 
Otros mecanismos celulares alternativos de oxidación de AGL, incluyendo el mecanismo 
microsomal (-oxidación) y el mecanismo peroxisomal (β-oxidación), también pueden 
ser regulados positivamente para disminuir la acumulación de AGL (33). 
En definitiva, la acumulación excesiva de AGL hepáticos en NAFLD resulta de un 
desequilibrio entre la mayor disponibilidad de AGL debido a la síntesis y captación de 
AGL hepáticos y, por otro lado, en la reducción de la eliminación de AGL a través de la 
Introducción 
- 7 - 
 
β-oxidación mitocondrial, en la menor exportación de VLDL y en una lipofagia 
disminuida (34). La resistencia a la insulina predispone, tanto a la lipólisis de la grasa 
periférica movilizando los AGL al hígado, como a la lipogénesis hepática exacerbada, y 
es el factor subyacente más importante y frecuente involucrado en la acumulación del 
AGL hepático (35). 
 
 
Figura 1.1. (A) Progresión clínica de NAFLD. NAFLD comprende un amplio espectro de daño hepático, que va 
desde la esteatosis macrovesicular simple hasta la esteatohepatitis, con inflamación combinada, fibrosis y daño hepático 
(esteatohepatitis), que progresa a cirrosis. El impacto inicial es la resistencia a la insulina, mientras que otros factores 
pueden participar en la progresión a etapas más avanzadas de la enfermedad, incluido el EO, mediadores inflamatorios 
de origen hepático (por ej., citoquinas inflamatorias derivadas de células de Kupffer) y de fuentes extrahepáticas (por 
ej., adipoquinas y lipopolisacáridos de la microbiota intestinal), insultos apoptóticos, entre otros. (B) Bases 
metabólicas de la patogenia de NAFLD. La resistencia a la insulina asociada con el síndrome metabólico conduce a 
un desequilibrio entre la ganancia (flechas naranjas) y la pérdida (flechas verdes) de grasa en el hígado. La resistencia 
a la insulina en el tejido de los adipocitos conduce a una movilización masiva de AGL desde los adipocitos 
sobrecargados de grasa hacia el hígado, debido a la supresión del efecto inhibitorio de HSL. La resistencia a la insulina 
periférica también conduce a una sobrecarga de glucosa (no internalizada por los tejidos periféricos) e insulina (debido 
a la hiperinsulinemia compensatoria). La resistencia a la insulina hepática permite una sobreproducción de AGL 
hepáticos mediante la activación de SREBP-1c y ChREBP. Los AGL se almacenan como TG en gotas lipídicas, que se 
exportan a través de partículas VLDL y se oxidan mediante la β-oxidación mitocondrial, como mecanismos 
compensadores para el aumento de la captación y síntesis de AGL. La lipofagia ayuda a degradar los TG de las gotas 
de lipídicas y a entregar AGL para estas rutas de exportación. Sin embargo, la producción de VLDL y la lipofagia se 
deterioran en NAFLD, y una mayor oxidación de AGL mitocondrial conduce a estrés oxidativo debido a la fuga 
exacerbada de electrones de la cadena de transporte de electrones. Figura adaptada de (6). 
 
Introducción 
- 8 - 
 
1.1.3.1 Vías de señalización de la insulina y su asociación con NAFLD 
La función más importante de la insulina es contrarrestar la acción de varias hormonas 
que causan hiperglicemia, manteniendo los niveles fisiológicos de glucosa sanguínea. 
Además de su papel en la regulación del metabolismo de la glucosa, la insulina estimula 
la lipogénesis, disminuye la lipólisis, incrementa el transporte de aminoácidos a la célula, 
modula la trascripción de numerosos ácidos ribonucleicos (ARN) mensajeros, estimula 
el crecimiento, la síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) y la replicación celular, 
efectos que son comunes a los de los Factores de Crecimiento similares a la Insulina (IGF, 
de sus siglas en inglés: Insulin-like Growth Factor) tipo 1 (IGF1) y tipo 2 (IGF2) (36). 
IGF1 y IGF2 tienen un alto grado de similitud en la secuencia con la insulina, además el 
receptor de IGF1 posee gran homología con el receptor de insulina (IR, de sus siglas en 
inglés: Insulin Receptor) y las vías de señalización intracelulares que son activadas por 
estas hormonas son muy parecidas (37).Las vías de señalización de la insulina se activan mediante la unión de la hormona al 
IR transmembrana, un receptor tirosina quinasa compuesto por cadenas α y β y que puede 
ser activado también por IGF1 y IGF2 (36). La unión de estos ligandos endógenos a la 
cadena  del receptor causa cambios estructurales en la cadena β al inducir la auto-
fosforilación en residuos de tirosina, seguida de eventos posteriores tales como el 
reclutamiento de las proteínas adaptadoras de los sustratos del receptor de insulina (IRS, 
de sus siglas en inglés: Insulin Receptor Substrate) y la proteína SHC (de sus siglas en 
inglés: Src Homology/Collagen) (37, 38). Estas uniones incluyen la activación de la 
fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K, de sus siglas en inglés: PhosphatidylInositol 3-Kinase), 
la cual involucra una unión con sustratos del receptor de la insulina (IRS1, IRS2, IRS3 y 
IRS4) activados por el dominio tirosina quinasa del receptor (39). PI3K fosforila 
fosfolípidos de membrana, siendo uno de los principales productos el fosfatidilinositol-
3,4,5-trifosfato (PIP3, de sus siglas en inglés: PhosphatidylInositol 3-Phosphate). PIP3 
se une a los dominios PH (de sus siglas en inglés: Pleckstrina Homology) de la quinasa 
dependiente de PIP3 (PDK, de sus siglas en inglés: Phosphoinositide-Dependent Kinase) 
permitiendo su activación. Por su lado, PDK fosforila y activa la proteína quinasa B 
(PKB, de sus siglas en inglés: Protein Kinase B, también conocida como AKT). 
AKT/PKB es una proteína quinasa específica de Ser/Thr que regula múltiples procesos 
biológicos incluyendo el metabolismo de glucosa, apoptosis, expresión de genes y la 
proliferación celular (37). La estimulación de la cascada de señalización de AKT/PKB a 
Introducción 
- 9 - 
 
través de IGF/IRS/PI3K activa, corriente abajo, una serie de objetivos anabólicos 
incluyendo a mTOR (de sus siglas en inglés: mammalian Target Of Rapamycin) y ERK1/2 
(de sus siglas en inglés: Extracellular signal–Regulated Kinase), además de inhibir vías 
catabólicas que incluyen la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3β, de sus siglas en inglés: 
Glycogen Synthase Kinase 3β) y los factores de transcripción FOXO (de sus siglas en 
inglés: FOrkhead boX class O) y sus genes atróficos atrogina-1 y MuRF1 (de sus siglas 
en inglés: Muscle Ring Finger 1) (38, 40). En las células diana de la insulina, AKT facilita 
la entrada de glucosa mediante la translocación del glucotransportador 4 (GLUT4), y 
promueve la síntesis de glucógeno (41). GLUT4 es una isoforma del transportador de 
glucosa que, a diferencia de otros tipos, depende completamente de la insulina (37, 42). 
Este transportador se expresa principalmente en tejido adiposo, cardiomiocitos y células 
del músculo esquelético, y reside en vesículas citoplasmáticas en estado no activo pero, 
en respuesta a la hormona insulina, se transloca a la membrana celular y facilita la entrada 
de glucosa (37). 
La fosforilación de los residuos de tirosina (Tyr) del IRS1 tras la activación del 
receptor de insulina constituye un paso crítico en la transmisión de la señal de insulina a 
los efectores posteriores. Se ha demostrado que la obesidad reduce la fosforilación de Tyr, 
estimulada por la insulina, del IRS1, así como de otros sustratos proximales del receptor 
de insulina, y se cree que dicha reducción está en el centro del desarrollo de la resistencia 
a la insulina (43). Se ha informado una disminución de la fosforilación del receptor de 
insulina en respuesta a la insulina en el músculo esquelético de sujetos obesos y adipocitos 
de sujetos con DM2 (44, 45). La fosforilación dependiente de insulina de AKT también 
se reduce en los adipocitos de pacientes con DM2 (46). De hecho, cualquier factor que 
reduzca la fosforilación en Tyr de IRS1 o la induzca en la Ser 307 perjudica la transducción 
de la señal y conduce a la resistencia a la insulina (47). Los aumentos en las 
concentraciones de ácidos grasos en plasma inducen inicialmente la resistencia a la 
insulina al inhibir el transporte de glucosa o la actividad de fosforilación, generando la 
reducción de la síntesis de glucógeno muscular y la oxidación de la glucosa (48). 
La acumulación excesiva de grasa en adipocitos y en los músculos causa resistencia a 
la insulina en estos órganos y contribuye a la acumulación de grasa en el hígado (24). El 
exceso de grasa en el hígado también provoca resistencia a la insulina en este órgano. De 
hecho, la acumulación de grasa, pero también otros factores como el aumento de las 
especies reactivas del oxígeno (ROS, de sus siglas en inglés: Reactive Oxidative Species), 
el factor de necrosis tumoral  (TNF-de sus siglas en inglés:Tumor Necrosis Factor) 
Introducción 
- 10 - 
 
o el estrés del retículo endoplásmico pueden activar la quinasa c-Jun N-terminal (JNK, 
de sus siglas en inglés: c-Jun N-terminal Kinase) en el hígado, lo que lleva a la 
inactivación del IRS (49, 50). Sin embargo, la resistencia a la insulina, en el hígado, puede 
afectar solo a algunas, y no a todas las vías metabólicas sensibles a la insulina (12). Por 
lo tanto, y paradójicamente, algunas vías metabólicas (por ejemplo, la síntesis de ácidos 
grasos) podrían estar activadas en exceso como consecuencia de los altos niveles de 
insulina, mientras que otras vías (por ejemplo, la oxidación de ácidos grasos o 
gluconeogénesis) podrían estar activadas en exceso como consecuencia de la resistencia 
a la insulina hepática (12). La translocación insuficiente de los transportadores de GLUT4 
a la membrana plasmática limita la captación de glucosa por los adipocitos y miocitos 
(37). Esta absorción insuficiente tiende a aumentar la glucosa en la sangre, lo que provoca 
un aumento compensatorio de la secreción de insulina por las células  pancreáticas (37). 
Sin embargo, esta compensación puede ser insuficiente, o fallar de manera secundaria, y 
se desarrolla una diabetes manifiesta. Por lo tanto, la resistencia a la insulina en los 
adipocitos y músculos tiende a aumentar los niveles plasmáticos de glucosa y/o insulina. 
De hecho, aparte de la captación sostenida de glucosa, que en el hígado es independiente 
de la insulina, en condiciones de resistencia a la insulina hepática, existe una síntesis de 
glucosa hepática exacerbada (gluconeogénesis), un ingreso de glucosa inhibido mediante 
la síntesis de glucógeno (glucogenogénesis) y una degradación del glucógeno estimulada 
(glucogenólisis) (Véase Figura 1.3 en sección 1.3.1) (51). 
Otros mecanismos moleculares involucrados en la resistencia a la insulina 
comprenden: el aumento de la expresión de la proteína tirosina fosfatasa 1B, el aumento 
de mediadores inflamatorios y adipoquinas, el estrés oxidativo, la degradación acelerada 
de la insulina, la disfunción mitocondrial, la capacidad reducida de los receptores para 
unir insulina, las mutaciones en GLUT4 y el estrés del retículo endoplásmico (52). 
1.1.4 Modelos animales de obesidad e insulino resistencia 
En los últimos años se han generado y usado numerosos modelos de animales 
transgénicos inducibles [knock-out (KO, o pérdida de función) inducidos o knock-in (o 
ganancia de función)], debido a que estos modelos suelen tener ventajas significativas en 
comparación con los animales transgénicos tradicionales (53). 
Por lo tanto, los modelos animales de obesidad e insulino resistencia se pueden dividir 
en diferentes categorías; aquellos que se basan en mutaciones o manipulaciones de uno o 
Introducción 
- 11 - 
 
unos pocos genes individuales y aquellos otros que utilizan animales genéticamente 
intactos expuestos a entornos obesogénicos, como los que se obtienen con el uso de dietas 
ricas en grasa (53). 
Los modelos genéticos más utilizados son aquellos relacionados con las mutaciones 
monogénicas que involucran la vía de la leptina (54). Las mutaciones espontáneas que 
conducen a una marcada obesidad se habían descrito mucho antes de que se hubierandescubierto las causas subyacentes (por ejemplo, defectos en el gen de la leptina o en el 
gen de su receptor). Los descubrimientos en este campo llevaron a la generación 
subsiguiente de un gran número de mutantes diseñados. Por el otro lado, los modelos de 
obesidad inducidos por la dieta (DIO, del inglés: Diet-Induced Obesity) se usan a menudo 
para estudiar las causas poligénicas de la obesidad y patologías asociadas como NAFLD. 
Se cree que los animales DIO imitan mejor el estado de la obesidad común a los seres 
humanos que la mayoría de los modelos modificados genéticamente y que pueden ser la 
mejor opción para probar posibles tratamientos terapéuticos. Los modelos transgénicos y 
los modelos con mutaciones espontáneas se pueden usar para explorar el papel de targets 
moleculares específicos en vías fisiológicas relacionadas a la ingesta de alimentos y su 
papel potencial en la obesidad. También cabe destacar los modelos de obesidad inducidos 
quirúrgicamente o químicamente, sin embargo, estos últimos han perdido gran parte de 
su importancia desde la introducción de los animales modificados genéticamente (53). 
Los modelos animales de obesidad más utilizados son probablemente el ratón ob/ob 
(deficiente en leptina), el ratón db/db (deficiente en el receptor de leptina) y sus 
contrapartes de rata como la rata Zucker y los modelos de obesidad inducida por la dieta 
(53). 
Aunque la contribución de las dietas con un alto contenido de grasa a la adiposidad 
humana es discutible (55), es evidente que la exposición de los animales a la dieta rica en 
grasa (HFD, del inglés: High Fat Diet) resulta en el desarrollo de obesidad. El aporte 
calórico de las dietas ricas en grasa y la consiguiente mayor ingesta de energía total 
reducen de manera rápida y específica las acciones centrales de la insulina y la leptina, 
probablemente debido a un efecto post-receptor (56–60). La composición de la grasa 
parece tener un papel importante en los efectos producidos por una HFD, ya que lípidos 
saturados (por ejemplo, el ácido palmítico) son más perjudiciales que los no saturados 
(53). 
Introducción 
- 12 - 
 
1.2 Mecanismos involucrados en la progresión a NASH 
Además de la presencia de esteatosis (principalmente esteatosis macrovacuolar con 
grandes vacuolas lipídicas en el citosol de los hepatocitos), NASH se caracteriza por 
necroinflamación y algo de fibrosis. Asimismo, es posible detectar hepatocitos 
apoptóticos (61). Estas lesiones hepáticas pueden ser responsables de un aumento leve o 
moderado en los niveles plasmáticos de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato 
aminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina y γ-glutamil-transferasa (γ-GT) (2). 
Se han formulado varias hipótesis para explicar la patogénesis del NASH; una de ellas 
es la teoría de “dos impactos” (62). De acuerdo con esta teoría, el "primer impacto" se 
desencadena por la acumulación de lípidos en los hepatocitos (esteatosis macrovesicular 
hepática), un rasgo en el cual la ingesta de grasa exacerbada y la resistencia a la insulina 
jugarían un papel clave. Esta condición aumentaría la vulnerabilidad del hígado a otros 
factores dañinos, que en conjunto se denominan 'segundo impacto', como el EO, los 
polimorfismos genéticos que aumentan la susceptibilidad a la enfermedad, la activación 
de las vías inflamatorias por la liberación de citoquinas pro-inflamatorias por parte de las 
células de Kupffer (CKs) o las adipoquinas liberadas por los adipocitos, la apoptosis de 
hepatocitos desregulados y la activación de células hepáticas esteladas (HSCs, de sus 
siglas en inglés: Hepatic Stellate Cells), entre otros. Este “segundo impacto”, al actuar 
por separado, impulsaría el progreso de la esteatosis macrovesicular a NASH. Esta 
progresión incluye una lesión hepática gradual asociada con la apoptosis hepática, la 
inflamación del hígado y la fibrogénesis. En este escenario, la fibrosis progresa desde el 
espacio periportal extendiéndose, y finalmente, produciendo cirrosis con insuficiencia 
hepática y luego, HCC (63). 
También se ha formulado la teoría de 'impactos diferentes', que propone que el NASH 
y el hígado graso son dos afecciones gemelas independientes, causadas por la resistencia 
a la insulina; siendo la esteatosis en NASH un epifenómeno benigno en lugar de un factor 
causal de inflamación y fibrosis, las dos principales características de NASH (64). De 
acuerdo con esta nueva hipótesis, el tiempo diferencial y las combinaciones de eventos 
moleculares patogénicos, en lugar de la simple acumulación de insultos hepatotóxicos, 
darían como resultado la activación diferencial de estas vías distintas que conducen a una 
esteatosis simple y/o NASH, consideradas como dos entidades patológicas separadas 
(64). De acuerdo con este punto de vista, los pacientes con NASH se pueden presentar 
sin esteatosis o con mucha esteatosis (65, 66). Además, el estrés del hepatocito debido a 
Introducción 
- 13 - 
 
la inflamación en NASH puede causar la acumulación de lípidos, por lo que, en ciertos 
casos, la inflamación incluso precede a la esteatosis en lugar de ser una consecuencia de 
ella (64). 
Este cambio de paradigma concuerda bien con la actual evidencia de que los AGL, en 
lugar de los TG acumulados en las gotas lipídicas, son los principales factores 
responsables del daño hepático inflamatorio en NASH. El metabolismo hepático de los 
AGL conduce a la formación y acumulación de metabolitos tóxicos (por ejemplo, 
diacilglicerol y ceramidas) y además, son los principales responsables de la generación 
de EO, inflamación y lesiones en el parénquima hepático (67). La esteatosis puede 
considerarse una respuesta adaptativa temprana al estrés de los hepatocitos debido al 
aumento del consumo calórico, mediante el cual los AGL potencialmente lipotóxicos se 
acumulan en moléculas de TG intracelulares relativamente inertes (65). 
1.2.1 Activación de células esteladas y fibrogénesis 
La inflamación del hígado está fuertemente asociada con la lesión crónica y con la 
fibrosis hepática resultante, un proceso reversible de cicatrización de herida que consiste 
en la rápida síntesis y deposición de componentes de la matriz extracelular, 
principalmente fibras de colágeno, para mantener la integridad del tejido durante la 
reparación (68). En este sentido, la acumulación hepática de colágeno, estimada a través 
del análisis histológico, es considerado como un marcador específico del proceso 
fibrótico en el hígado (69). 
Se ha demostrado que la fagocitosis de cuerpos apoptóticos desempeña un papel 
importante en la activación de HSCs, principal fuente de matriz extra celular y 
fibrogénesis, y también en la activación de CKs (68). 
De manera similar a lo que sucede con la respuesta inflamatoria, la señalización 
mediada por el receptor de inmunidad innata tipo Toll 4 (TLR4, de sus siglas en inglés: 
Toll-Like Receptor) inducida por lipopolisacárido (LPS) es un importante regulador de la 
fibrosis. TLR4 se expresa en HSCs (70), donde desencadena una respuesta inflamatoria, 
con activación del factor de transcripción nuclear κB (NFκB, de sus siglas en inglés: 
Nuclear Factor κB) y expresión de genes dependientes de NFκB (70). Aunque esta señal 
inflamatoria no promueve directamente la activación de las HSCs, mejora la respuesta 
pro-fibrogénica de las HSCs al factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1, de sus 
siglas en inglés: Transforming Growth Factor β1) (70). 
Introducción 
- 14 - 
 
1.2.2 Estrés oxidativo y disfunción mitocondrial. Relación con la 
resistencia a la insulina e inflamación 
Los radicales libres se producen continuamente en el curso del metabolismo normal y 
desempeñan funciones prominentes en la señalización celular. Sin embargo, cuando se 
produce una sobrecarga de su producción, se desarrolla EO (52). Dado que el daño 
oxidativo a las moléculas de lípidos, proteínas y ADN puede desencadenar vías de 
señalizacióninflamatorias y fibrogénicas, el EO puede desempeñar un papel crucial en el 
desarrollo y progresión de NASH (71). 
Como los orgánulos esenciales presentes en la mayoría de las células eucariotas, las 
mitocondrias cumplen un papel crucial en el metabolismo energético celular, la 
regulación de la muerte celular programada y la regulación redox (72). Las mitocondrias 
son orgánulos muy complejos que albergan su propio ADN (73). Como principal fuente 
energética de las células, las mitocondrias pueden utilizar glucosa, ácidos grasos, 
aminoácidos y otros sustratos celulares para producir adenosina trifosfato (ATP, de sus 
siglas en inglés: Adenosine TriPhosphate) a través de una serie de procesos bioquímicos 
conocidos como la fosforilación oxidativa (OXPHOS, de sus siglas en inglés: OXidative 
PHOSphorylation), el ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs), y la -oxidación (73). 
La fosforilación oxidativa es un proceso metabólico que utiliza energía liberada por la 
oxidación de nutrientes para producir ATP. Se calcula que hasta el 90 % de la energía 
celular en forma de ATP es producida de esta forma. Consta de dos etapas: en la primera, 
la energía libre generada mediante reacciones químicas redox en varios complejos 
multiproteicos (conocidos en su conjunto como cadena respiratoria mitocondrial o cadena 
transportadora de electrones) se emplea para producir, por diversos procedimientos como 
bombeo, ciclos quinona/quinol o bucles redox, un gradiente electroquímico de protones 
a través de una membrana asociada, en un proceso llamado quimiosmosis. La cadena 
respiratoria está embebida en la membrana interna mitocondrial, y la constituyen cuatro 
complejos multienzimáticos (I, II, III y IV) y dos transportadores de electrones móviles 
(coenzima Q o ubiquinona y citocromo c) (31). El metabolismo de acetil-CoA por el ciclo 
de Krebs produce dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH, de sus siglas en inglés: 
Nicotinamide Adenine Dinucleotide), y flavín adenín dinucleótido (FADH2, de sus siglas 
en inglés: Flavin Adenine Dinucleotide), y estas moléculas, a su vez, son oxidadadas al 
transferir sus electrones a la cadena respiratoria mitocondrial (6). El donador de electrones 
https://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo
https://es.wikipedia.org/wiki/Redox
https://es.wikipedia.org/wiki/Nutriente
https://es.wikipedia.org/wiki/Energ%C3%ADa_libre_de_Gibbs
https://es.wikipedia.org/wiki/Reducci%C3%B3n-oxidaci%C3%B3n
https://es.wikipedia.org/wiki/Complejo_proteico
https://es.wikipedia.org/wiki/Complejo_proteico
https://es.wikipedia.org/wiki/Cadena_de_transporte_de_electrones
https://es.wikipedia.org/wiki/Cadena_de_transporte_de_electrones
https://es.wikipedia.org/wiki/Gradiente_electroqu%C3%ADmico
https://es.wikipedia.org/wiki/Prot%C3%B3n
https://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_celular
https://es.wikipedia.org/wiki/Quimiosmosis
Introducción 
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primario, NADH, contribuye con electrones al complejo I de la cadena. El otro donador 
de electrones, FADH2, dona electrones al complejo II. Los electrones de estos dos 
complejos van hacia la coenzima Q y luego se transfieren al complejo III, el citocromo c 
(Cyt c, del inglés Cytocrome c). A continuación, los electrones pasan al complejo IV y 
por último al oxígeno molecular, que es el aceptor final de electrones produciendo una 
molécula de agua. Los electrones luego migran a lo largo de la cadena respiratoria, y este 
flujo de electrones se acopla con la extrusión de protones desde la matriz mitocondrial al 
espacio intermembrana mitocondrial. En una segunda etapa, el gradiente de protones 
generado se disipa por la ATP sintasa (también conocido como complejo V) que utiliza el 
flujo de protones (fuerza protón-motriz) para convertir ADP en ATP. Existen también 
proteínas desacoplantes que permiten controlar el flujo de protones y generar calor 
desacoplando ambas fases de la fosforilación oxidativa (31). 
 
 
 
Figura 1.2. Esquema de la cadena respiratoria mitocondrial. Se muestran los 5 complejos del sistema de 
fosforilación oxidativa mitocondrial (I, II, III, IV: cadena de transporte de electrones y V: ATPasa), ubicados sobre la 
membrana interna mitocondrial. Q, es ubiquinona (Coenzima Q10 o CoQ10), que transporta los electrones que ingresan 
a la cadena por la oxidación de NADH en el Complejo I. El Complejo I, también es conocido como NADH: CoQ 
oxidoreductasa (también NADH-ubiquinona oxidoreductasa o NADH deshidrogenasa), el Complejo II como succinato: 
CoQ oxidoreductasa (también succinato: ubiquinona oxidorreductasa o succinato deshidrogenasa), el Complejo III 
como ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa (también CoQ-citocromo reductasa), y el Complejo IV como citocromo 
c oxidasa. El oxígeno es el último aceptor de electrones, siendo el agua el producto final. La ATP sintasa es complejo 
proteico compuesto de múltiples subunidades que se une al ADP y al fosfato inorgánico en su sitio catalítico, y que 
https://es.wikipedia.org/wiki/Fuerza_prot%C3%B3n-motriz
https://es.wikipedia.org/wiki/ATP_sintasa#Prote.C3.ADnas_desacopladodras_.28UCP.29
Introducción 
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requiere un gradiente de protones para su actividad. La ATP sintasa está compuesta de 3 fragmentos: F0, que se localiza 
en la membrana; F1, que protruye desde la membrana mitocondrial interna hacia la matriz mitocondrial; y la proteína 
que le confiere sensibilidad a la oligomicina (OCSP), que conecta los fragmentos F0 y F1. Esta figura fue adaptada del 
libro Concepts of Biology (1st Canadian Edition)- Authors: Charles Molnar & Jane Gair. 
 
Asimismo, el ATP puede ser generado por varios procesos celulares distintos. Las tres 
vías principales en los eucariotas incluyen la glucólisis (vía 1), el ciclo del ácido cítrico/la 
fosforilación oxidativa (vía 2) y la -oxidación (vía 3). En ambientes aeróbicos, los 
procesos generales de oxidación de glucosa a dióxido de carbono, que incluyen las vías 1 
y 2, se conocen como respiración celular y producen aproximadamente 38 equivalentes 
de ATP por cada glucosa (74). A diferencia de la glucosa, los ácidos grasos generan ATP 
a través de la -oxidación (vía 3), y el número de moléculas de ATP producidas depende 
de la cantidad de carbonos que contengan. Por lo tanto, la vía 3 puede generar 
considerablemente más moléculas de ATP en comparación con las otras dos vías (vías 1 
y 2). 
El transporte de electrones a través de la cadena respiratoria mitocondrial es un 
requisito esencial para la fosforilación oxidativa, y este proceso está asociado con la 
generación de ROS (74). En este sentido, en los complejos I y III, los electrones pueden 
escapar prematuramente e interactuar con las moléculas de oxígeno, lo que da como 
resultado la producción de ROS (75). El 2% del oxígeno consumido por los hepatocitos 
se transforma en ROS por mitocondrias en condiciones basales (75). El EO exacerbado 
en el ambiente de las mitocondrias por el exceso de AGL como sustratos puede dañar aún 
más la función del orgánulo; esto establece un círculo vicioso, ya que la generación de 
ROS por la cadena respiratoria dañada aumenta, lo que daña aún más la integridad de la 
cadena respiratoria (75, 76). 
Las mitocondrias alteradas funcional y estructuralmente son la principal fuente de EO 
en NASH, independientemente de si la β-oxidación de AGL aumenta o disminuye (76). 
En pacientes con NASH, las mitocondrias hepáticas presentan anomalías 
ultraestructurales, con inclusiones paracristalinas en megamitocondrias (6, 77). Aunque 
no se sabe cuáles son los cambios bioquímicos que desencadenan estas lesiones 
morfológicas, estas observaciones sugieren daño mitocondrial (31). 
El EO asociado a NASH, también podría deberse a factores concomitantes a la 
resistencia la insulina, como la autooxidación de la glucosa y la glicación e inhibición de 
algunas enzimas antioxidantes (78). Con respecto a la glucosa, se sugiere firmemente que 
la hiperglucemia podría ser una de las causas principales