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Evaluación del Factor de Necrosis Tu-
moral (TNF-alfa) en pacientes perua-
nos con procesos periodontales
Manuel Enrique Taboada Vega1, José En-
rique Olivera García2, Óscar Valderrama 
Herrera3, Luis Cisneros Zárate3, Vilma 
Chuquihuaccha Granda1, Soledad Reyes 
Soto1, Pedro Ballona Chambergo3
Artículo originAl
Resumen
El factor de necrosis tumoral (TNF) es un importante mediador de las reacciones 
inflamatorias y parece jugar un rol central en la patogénesis de varias enfermedades 
inflamatorias crónicas incluyendo la periodontitis. Se ha demostrado que existen diferentes 
tasas de síntesis de TNF alfa in vitro e in vivo entre los individuos, por lo que puede 
asociarse con la presencia de cierto polimorfismo genético. El presente estudio tiene la 
finalidad de estudiar el grado de polimorfismo del gen TNF-alfa (-308G/A) en una muestra 
de pacientes peruanos adultos y analizar la relación con los procesos periodontales severos. 
Para el estudio se colectaron 81 muestras de sangre con anticoagulante EDTA de personas 
comprendidas entre 25 y 52 años (promedio 47.5 ± 7.4). De los cuales 11 son de personas 
con procesos periodontales severos (promedio 35.2 ± 2.3). Se encontró una frecuencia 
mayor del genotipo GG (alelo G para el gen TNF-alfa-308) del 82.86% en personas sanas 
y 63.63% en personas con procesos periodontales. Mientras que el genotipo AA (alelo A 
para el gen TNF-alfa-308) que se relaciona a un mayor incremento de síntesis de TNF-alfa, 
fue de 18.8%, siendo un valor no muy significativo según la prueba chi-cuadrado. Los 
resultados están de acuerdo a algunos trabajos que encuentran asociación directa entre 
el polimorfismo del gen TNF-alfa con los procesos periodontales, pero no con otros que 
si lo asocian. Dado que la periodontitis es considerada una enfermedad multifactorial se 
discute el polimorfismo de TNF-alfa -308 (G/A) en pacientes peruanos. 
Abstract
The tumor necrosis factor (TNF) is an important mediator of the inflammatory reactions; 
it seems to play a central roll in the pathogenesis of several chronic inflammatory diseases 
including the periodontitis. It has been demonstrated that different rates exist from TNF 
alpha in vitro and in vivo between the individuals, so it can be associated with the presence 
of certain genetic polymorphism. The purpose of this investigation is to study the degree 
of polymorphism of the gene TNF-alpha (-308G/A) in samples of adult Peruvian patients 
and analyze the relationship with periodontal processes. For the study 81 blood samples 
with anticoagulant EDTA of people between 25 and 52 years were collected (47,5 average 
± 7,4). 11 of them were people who had severe periodontal processes (average 35,2 ± 2,3). 
There was a greater frequency of genotype GG (G alele for the gene TNF-alpha-308) of 
the 82,86% in healthy people and 63,63% in people with periodontal processes. While 
the genotype AA (A alele for the gene TNF-alpha-308) that is related to a greater increase 
of TNF-alpha synthesis, was of 18,8%, this value was not very significant according to 
the chi-square test. The results are according to some works that find direct association 
between the polymorphism of the gene TNF-alpha with the periodontal processes, but 
not with others that do associate it. Since the periodontitis is considered a multifactorial 
disease the polymorphism of TNF-alpha -308 (G/A) in Peruvian patients is discussed.
Odontología SanmarquinaOdontol. Sanmarquina 2007; 10(1): 28-30
ISSN: 1560-9111
Palabras clave: Periodontitis, TNF-alfa, 
polimorfismo, RFLP-PCR
Key words: Periodontitis, TNF-alpha, 
polymorphism, RFLP-PCR
Evaluation of Tumor Necrosis Factor (TNF-alpha) in Peruvian patients 
with periodontal processes
Introducción
Los genes pueden existir en diferentes 
estados o formas. Los genetistas se 
refieren a las diferentes formas de un 
gen como variantes alélicas o alelos. 
Las variantes alélicas de un gen di-
fieren en su secuencia nucleotídica. 
Cuando un alelo específico ocurre en al 
menos 1% de la población, se dice que 
es un gen polimórfico. El genoma esta 
compuesto de una cadena linear de 
nucleótidos presentes en una molécula 
de doble cadena. La secuencia linear 
de nucleótidos de una de las cadenas 
codifica para aminoácidos en forma de 
tripletes de codones. Muchas variantes 
alélicas involucran cambios de uno de 
los cuatro nucleótidos (A, T, G, C) por 
otro. Estos cambios alteran el triplete 
de codones que codifican para un 
aminoácido. Debido a la redundancia 
del triplete de codones algunos de 
estos codones cambian la secuencia 
de codificación para el mismo aminoá-
cido. Pero algunas variantes alélicas 
alteran la composición de aminoácidos 
del producto génico. El cambio de 
nucleótido es muy raro y no está pre-
sente en muchos individuos, pero si 
existe se denomina mutación. En con-
traste a la mutación, el polimorfismo 
genético es usualmente considerado 
como variantes normales del gen en 
la población. Cuando un cambio de 
nucleótido ocurre en un codón, puede 
1 Departamento Académico de Ciencias 
Básicas 
2 Facultad de Medicina Humana, UNMSM 
3 Departamento Académico Medico 
Quirúrgico 
 1,3 Facultad Odontología UNMSM
Correspondencia: 
Dr. Manuel Enrique Taboada Vega
Facultad Odontología, UNMSM
Av. Germán Amézaga s/n, Lima, 1 Perú. 
e-mail: mtaboadav@unmsm.edu.pe
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o no cambiar el aminoácido codificado 
por aquel codón. Cuando un nucleóti-
do cambia en un codón y no altera el 
aminoácido se dice que es “silencioso” 
y usualmente no tiene consecuencias 
biológicas. Consecuentemente los 
productos de proteínas específicas de 
diferentes alelos pueden funcionar 
diferentemente. Estas diferencias en el 
funcionamiento biológico de diferen-
tes proteínas puede ser incrementada 
por ciertas exposiciones ambientales 
(p.ej. dieta, tabaco, flora microbiana). 
Si la proteína afectada funciona en 
un proceso biológico, p.ej. respuesta 
inflamatoria en periodontitis por 
exposición de agentes microbianos 
específicos, ciertos polimorfismos de 
las personas pueden incrementar o 
disminuir su riesgo para el desarrollo 
de una enfermedad. Si una variante 
particular génica contribuye al feno-
tipo de una enfermedad dependerá 
de la magnitud de la alteración génica 
del producto. Millones de variantes 
genéticas han sido identificados en 
los humanos (NCBI: http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/). La mayoría son 
cambios de un solo nucleótido (SNP’s) 
que ocurren en los genes y que parecen 
cambiar la función de la proteína, pero 
la mayoría de ellos no parecen afectar 
el producto génico.
La periodontitis es una enfermedad 
que inicialmente es causada por 
bacterias orales. Primariamente la 
enfermedad afecta el tejido conectivo 
que soportan los dientes y es la mayor 
causa de pérdida de dientes en los 
adultos. Se ha reportado que la forma 
más común de periodontitis afecta en-
tre el 30-40% de la población mundial 
adulta y aproximadamente el 10% de 
los sujetos desarrolla una enferme-
dad severa.10 Un factor importante 
para el desarrollo de la periodontitis 
es el factor genético que se estima 
contribuye en un 50%.9 La etiopato-
génesis de la periodontitis parece ser 
multifactorial e involucra una serie 
de eventos de respuesta por parte del 
hospedero, entre los cuales existe una 
reacción inflamatoria e inmunológica 
específica. Un elemento a evaluar es 
la citokina proinflamatoria TNF-alfa, 
producida por monocitos/macrófagos 
en forma temprana en la respuesta 
inflamatoria. Esta citokina estimula la 
resorción del hueso en forma directa7 
y promueve la liberación de enzimas 
tipo metaloproteinasas, que destruyen 
la matriz extracelular de la gingiva, 
ligamiento periodontal y el hueso 
alveolar.6 Se ha encontrado que en 
adultos japoneses(11) el gen TNF-alfa 
presenta una mutación de cambio de 
guanina por adenina en la posición 
308, correlacionándolo a un incremen-
to transcripcional de hasta ocho veces 
sobre la tasa normal de producción del 
gen normal14 quepodría favorecer el 
desarrollo de periodontitis.
El objetivo de este estudio es analizar 
un sector del gen TNF-alfa (TNF-
a-308) con muestras de ADN de 
pacientes peruanos que presentan 
periodontitis severa y de ésta manera 
determinar si se puede establecer una 
relación directa de esta enfermedad 
con el marcador en estudio.
Material y Método
Muestra: de los pacientes que acuden 
a la clínica central de la Facultad de 
Odontología UNMSM, se seleccio-
naron 81 pacientes, de los cuales 11 
presentaban problemas periodontales 
avanzados, periodontitis avanzada, 
constituyendo el grupo de estudio y 
70 considerados sanos, periodontal y 
sistémicamente. 
Criterios de inclusión: no presentar 
enfermedad sistémica. No estar reci-
biendo ningún tipo de medicación.
Todos los sujetos dieron el consenti-
miento informado para participar en 
el estudio.
Extracción de ADN : fue extraído a 
partir de sangre periférica tratada con 
EDTA. Los linfocitos fueron lavados 
en buffer tris-EDTA (20:5).
RFLP-PCR: Para la determinación 
de los genotipos de polimorfismos 
-308G/A se aplico la técnica de RFLP-
PCR desarrollada por Wilson, AG. et 
al. (1993)(13) modificado por Folwacz-
ny, MG. et al (2004) (1) y estandarizado 
para nuestras condiciones de labora-
torio. Se uso los siguientes partidores: 
5’- AGGCAATAGGTTTTGAGGGC-
CAT-3’ (directo) y 5’-ACACTCCC-
CATCCTCCCGGCT-3’ (reverso). Los 
nucleótidos subrayados difieren de la 
secuencia original, con el fin de crear, 
dos sitios de restricción reconocibles 
posteriormente por las enzimas NcoI. 
Los ensayos de PCR fueron realiza-
dos en un termociclador MJResearch 
PT100, usando 100 ng de ADN genó-
mico en un volumen final de 50 ul. 
La reaccion PCR contenia buffer 10X 
(Promega) y 5U de Taq polimerasa, así 
como una concentración final de 0.2 
pM de cada partidor, 0.2 mM de cada 
dNTP y 3 mM de MgCl2. La reacción 
PCR se inició con un paso de desna-
turalización (95°C/15 min) seguido de 
35 ciclos (desnaturalización a 94C/30 
s, hibridación a 52°C/30 s y extensión 
a 72°C/30 s). Un volumen de 10 µl del 
producto de PCR se incubó a 37°C du-
rante 12 h con enzimas de restricción 
y se resolvió mediante electroforesis 
en geles de agarosa 2.5% para la vi-
sualización de fragmentos. Específi-
camente, el polimorfismo -308G/A se 
determinó mediante la incubación con 
1.2U de la enzima NcoI (Fermentas). 
En este polimorfismo, el genotipo ho-
mocigoto para el alelo salvaje G generó 
fragmentos de 20 y 80 pares de bases, 
mientras que el genotipo homocigoto 
para el alelo A generó un fragmento 
no digerido de 107 pares de bases. La 
mayoría de los reactivos de PCR fue 
de la marca Promega.
Análisis Estadístico: Se calcularon las 
frecuencias alélicas y genotípicas por 
conteo directo y se evaluó la concor-
dancia de la distribución genotípica 
con el equilibrio Hardy-Weinberg 
por la prueba chi-cuadrado de Pear-
son. Las diferencias entre los grupos 
de estudio fueron evaluadas con la 
prueba Fisher.
Resultados
La Tabla 1 resume el número de per-
sonas analizadas por RFLP-PCR, así 
como los genotipos obtenidos para 
cada grupo con procesos periodonta-
les y grupo control.
Se indica las frecuencias alélicas y ge-
notípicas del polimorfismo estudiado. 
El polimorfismo G-308A no presenta 
frecuencias genotípicas concordan-
tes con la Ley de Hardy-Weinberg 
según la prueba de chi-cuadrado de 
Pearson.
En la Tabla 1 se observa que el ge-
notipo encontrado en la población 
en estudio, mayoritariamente es GG, 
siendo los genotipos GG y GA homo-
cigotos y heterocigotos normales para 
la población. El Genotipo AA, en el 
cual, la variante alélica presenta una 
mutación en la posición –308, y por 
ello, la enzima NcoI no lo digiere, esta 
relacionado a pacientes con excesivo 
incremento de síntesis de TNF-alfa. 
Pero, según los resultados estadísticos, 
existe poca relación significativa entre 
los grupos enfermos y control. Se ob-
serva que el genotipo GG normal tiene 
un 63.63% con respecto al genotipo AA 
(18.18%). En cuanto a las frecuentas 
alélicas, el alelo G “normal” tiene un 
27.72% presente entre las personas que 
desarrollan procesos periodontales, 
con respecto al gen A (27.27%). Por 
otro lado es interesante que el alelo A 
sea muy bajo entre las personas sanas 
(Tabla 2).
Tabla 1. Distribución de los diferentes genotipos del gen –308 TNF-alfa 
(G/A) obtenidos de personas adultas sana y con procesos periodontales
GG
GA
AA
58 (82.86)
12 (17.14)
0
Genotipos
7 (63.63)
2 (18.18)
2 (18.18)
Con procesos
Periodontales (%)
Control (%)
Las diferencias entre los genotipos no fue significante para las proporciones 
Hardy-Weinberg mediante la prueba chi cuadrado de Pearson. p<0.228)
Manuel E. Taboada V. y col.
30 Odontol. Sanmarquina 2007; 10(1): 28-30
Evaluación del Factor de Necrosis Tumoral (TNF-alfa) en pacientes peruanos con procesos periodontales
Tabla 2. Frecuencia de los alelos del gen –308 TNF-alfa 
(G/A) obtenidos de personas con procesos periodontales 
Frecuencias alélicas
G
A
128 (91.42)
12 (8.57)
Genotipos
16 (72.72)
6 (27.27)
Con procesos
Periodontales (%)
Control (%)
Las diferencias entre los grupos no fue significante mediante la 
prueba exacta de Fisher (p<0.193).
Discusión
Se han descrito diferentes polimor-
fismos en la región promotora del 
gen TNF-alfa humano algunos de los 
cuales se han hallado correlación con 
diferentes enfermedades multifacto-
riales como la periodontitis1,12. En el 
gen TNF-alfa se ha observado que 
existe un cambio de guanina (alelo G) 
por adenina (alelo A) en la posición 
–308 lo cual conduce a un incremento 
de trascripción de TNF-alfa hasta tres 
veces bajo estimulación con lipopoli-
sacarido bacteriano.8 En consecuencia, 
individuos que son homocigotos para 
el alelo A TNF-alfa-308 (adenina en 
posición –308) tienen altos niveles 
de TNF-alfa circulantes que los ho-
mocigotos para el alelo G del gen 
TNF-alfa.2 También se ha determinado 
que neutrófilos orales de pacientes de 
alelo A con periodontitis producen 
significantes cantidades de TNF-alfa 
cuando se comparan con individuos 
normales (de alelos G).5 Por ello, se 
propuso que este genotipo AA puede 
ser un marcador de pronóstico para la 
periodontitis.
En el presente estudio, no se ha podido 
establecer una diferencia significativa 
1 2 3 4
107 pb
80/20 
pb
Figura 2. Electroforesis en agarosa al 2.5% que muestra el 
polimorfismo del gen TNF-alfa (-308) 1.Marcador de ADN de 
10 pb. 2. individuo homocigoto GG (80/20 pb), 3. Individuo 
heterocigoto GA (107/80/20 pb), 4. Individuo homocigoto AA para 
TNF-alfa -308 (107 pb).
con respecto a la distribución de alelos 
o genotipos entre pacientes con proce-
sos periodontales y el grupo control.
Otros estudios revelan una alta fre-
cuencia del alelo A TNF-alfa-308 
tanto para pacientes con periodontitis 
como para controles.5 Mientras que 
otros han establecido mas relación de 
alelos G con peridontitis. Aun faltan 
desarrollar mas estudios, por cuanto 
la periodontitis crónica, si bien tiene 
un fondo epigenético inherente al 
paciente, también están involucrados 
factores multifactoriales muy compleja 
aun no dilucidada. 
Por otro lado la selección de indivi-
duos para el estudio, y la poca muestra 
de pacientes con procesos periodonta-
les podría también haber influido en 
el resultado. Por ello, la continuación 
de los estudios deberá enfocarse más 
específicamente en seleccionar pa-
ciente con periodontitis crónica como 
recomienda Flemming (1999).3
Al término del estudio se llegó a las 
siguientes conclusiones:
a. Existe un alto polimorfismo 
importante del gen TNF-alfa –308 
en los pacientes con periodontitis 
frente al grupo control entre 
hombres y mujeres.
b. La asociación de este polimorfismo 
al número de casos con periodontitis 
es poco significativo, no obstante, el 
número de casos es poco lo cual 
estaría influyendo en el resultado.
c. Nuestros resultados va de acuerdo 
con los obtenidos en poblaciones 
japonesas y brasileñas y en 
desacuerdocon lo obtenido para 
poblaciones europeas.
Referencias bibliográficas
1. Beutler, B. and Cerami, A. The biology 
of TNF a primary mediator of the 
host response. Annual Review of 
Immunology 1989;7:625-655.
2. Bouma, G., Crusius, J. B. A., Pool, M. 
O., Kolkman, J. J., Von Blomberg, B. 
M. E., Kostense, P. J., Giphart, M. J., 
Schreuder, G. M. T., Meuwissen, S. G. 
M. & Pen˜a, A. S. Secretion of tumor 
necrosis factor a and lymphotoxin a in 
relation to polymorphisms in the TNF 
genes and HLA-DR alleles. Relevance 
for inflammatory bowel disease. 
Scandinavian Journal of Immunology 
1996;43:456–463.
3. Flemming, TF . Periodontitis. Annals of 
Periodontology 1999;4:32-37.
4. Folwaczny, M. Glas, J., Torok, H, 
Mende M., and Ch. Folwaczny. Lack 
of association between the TNFa G-
308 A promoter polymorphism and 
periodontal disease. Clin Periodontol 
2004;31:449–453.
5. Galbraith, G. M., Hendley, T. M., 
Sanders, J. J., Palesch, Y. & Pandey, J. 
P. Polymorphic cytokine genotypes 
as markers of disease severity in 
adult periodontitis. Journal of Clinical 
Periodontology 1999;26:705–709.
6. Kilian, M, Frandsen EVG, Haubek, D and 
K. Poulsen. The etiology of periodontal 
disease revisited by population genetic 
analysis. Periodontology 2006;42:158-
179.
7. Kobayashi, K. Takahashi, N, Jimi, 
E. Udagawa, N. Takami M., Kotake 
S. , Nakagawa, N. Kinosaki , M. 
Yamaguchi, K. Shima, N. Yasuda H., 
Morinaga, T., Higashio K, Martin TJ, 
and Suda T. Tumor necrosis factor alpha 
stimulates osteoclast differentiation by 
a mechanism independent of the ODF/
RANKL-RANK interaction. Journal of 
Experimental Medicine. 2000;191:275-
286.
8. Kroeger, K. M., Steer, J. H., Joyce, D. 
A. & Abraham, L. J. Effects of stimulus 
and cell type on the expression of the 
-308 tumour necrosis factor promoter 
polymorphism. Cytokine 2000;12:110–
119.
9. Michalowicz, BS, Diehl, SR, Gunsolley, 
JCC., Sparks, BS. Brooks, CN, Koertge, 
T.E. Califano, JV, Burneister, JA 
and Schenkein, HA. Evidence of a 
substantial genetic basis for risk of adult 
periodontitis. Journal of Periodontology 
2000;71:1669-1707.
10. Papapanou , PN and L indle J . 
Epidemiology of periodontal disease. In; 
Lindhe. J. Karring T. & Lang NP. (eds). 
Clinical Peridontology and Implant 
Dentistry, 4th edition. UK; Blackwell 
Munksgard. 2003.
11. Soga, Y, Nishimura, F, Ohyama, 
H., Maeda, H., Takashiba Sh, and 
Murayama, Y. Tumor necrosis factor-
alpha gene (TNF-a) –1031/-863,-857 
single-nucleotide polymorphisms 
(SNPs) are associated with severe adult 
periodontitis in Japanese. Journal of 
Clinical Periodontology 2003;30:524-
531.
12. Verweij, CL. Tumor necrosis factor gene 
polymorphisms as severity markers 
in rheumatoid artritis. Annals of 
Periodontology 1999;4:39-52.
13. Wilson AG, De Vries, N, F. Pociot, F, 
Di Giovine, FS, Van der Putte, LBA and 
G. W. Duff. An Allelic Polymorphism 
within the Human Tumor Necrosis 
Factor α Promoter Region Is Strongly 
Associated with HLA A1, B8, and DR3 
Alleles J. Exp. Med. 1993;177:557-560.
14. Wilson, AG and Di Giovine FS. Genetics 
of TNF-alpha in autoinmune infectious 
and neoplasic disease. Journal of 
Inflamation 1995;45:1-12.
Recibido : 07-05-2007
Aceptado para publicación: 25-05-2007