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DIAGNÓSTICO DE CLONALIDAD DE LOS SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS DE CÉLULAS T Y NK DIAGNOSIS OF CLONALITY OF CHRONIC LYMPHOPROLIFERATIVE DISORDERS OF T AND NK CELLS Autora: Noemí Muñoz García Directora: Dra. Julia Mª Almeida Parra TESIS DOCTORAL 2021 La presente tesis doctoral incluye dos artículos originales publicados en revistas científicas indexadas en Journal Citation Reports (Web of Science), y un trabajo original sometido a revisión, según se detalla a continuación: 1. Anti‐TRBC1 Antibody‐Based Flow Cytometric Detection of T‐Cell Clonality: Standardization of Sample Preparation and Diagnostic Implementation. Muñoz‐García N1,2, Lima M3,4, Villamor N2,5, Morán‐Plata FJ1,2, Barrena S1,2, Mateos S1,2, Caldas C1,2, Balanzategui A2,6, Alcoceba M2,6, Domínguez A7, Gómez F7, Langerak AW8, van Dongen JJM9, Orfao A1,2*, Almeida J1,2*. Cancers (Basel). 2021 Aug 30;13(17):4379. doi: 10.3390/cancers13174379. PMID: 34503189; PMCID: PMC8430560. Índices de calidad de la revista (Fuente – Journal Citation Report, Web of Science [consulta: 25 de octubre de 2021]): Índice de impacto (2020): 6,639. Posición dentro de la Categoría Oncology (2021): Q1. 2. High‐Sensitive TRBC1‐Based Flow Cytometric Assessment of T‐Cell Clonality in Tαβ‐ Large Granular Lymphocytic Leukemia. Muñoz‐García N1,2, Morán‐Plata FJ1,2, Villamor N2,5, Lima M3,4, Barrena S1,2, Mateos S1,2, Caldas C1,2, van Dongen JJM9, Orfao A1,2*, Almeida J1,2*. Blood Cancer Journal. Manuscrito enviado. Índices de calidad de la revista (Fuente – Journal Citation Report, Web of Science [consulta: 25 de octubre de 2021]): Índice de impacto (2020): 11,037. Posición dentro de la Categoría Hematology (2021): Q1. 3. STAT3 and STAT5B Mutations in T/NK‐Cell Chronic Lymphoproliferative Disorders of Large Granular Lymphocytes (LGL): Association with Disease Features. Muñoz‐García N1,2, Jara‐Acevedo M1,2, Caldas C1,2, Bárcena P1,2, López A1,2, Puig N2,6, Alcoceba M2,6, Fernández P10, Villamor N2,5, Flores‐Montero JA1,2, Gómez K11, Lemes MA12, Hernández JC13, Álvarez‐ Twose I2,14, Guerra JL15, González M2,6,16, Orfao A1,2*, Almeida J1,2*. Cancers (Basel). 2020 Nov 25;12(12):3508. doi: 10.3390/cancers12123508. PMID: 33255665; PMCID: PMC7760806. Índices de calidad de la revista (Fuente – Journal Citation Report, Web of Science [consulta: 25 de octubre de 2021]): Índice de impacto (2020): 6,639. Posición dentro de la Categoría Oncology (2021): Q1. Número de citas (Scopus [consulta: 25 de octubre de 2021]): 4. 1Translational and Clinical Research Program, Centro de Investigación del Cáncer and IBMCC (CSIC—University of Salamanca), Cytometry Service, NUCLEUS, Department of Medicine, University of Salamanca (USAL) and Institute of Biomedical Research of Salamanca (IBSAL), 37007 Salamanca, Spain; 2Biomedical Research Networking Centre Consortium of Oncology (CIBERONC), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spain; 3Department of Hematology, Laboratory of Cytometry, Hospital de Santo António, Centro Hospitalar do Porto, 4099‐001 Porto, Portugal; 4Unit for Multidisciplinary Research in Biomedicine (UMIB), University of Porto, 4050‐ 313 Porto, Portugal; 5Department of Pathology, Hematopathology Unit, Hospital Clínic, IDIBAPS, 08036 Barcelona, Spain; 6Hematology Service, University Hospital of Salamanca, Translational and Clinical Research Program, Centro de Investigación del Cáncer/IBMCC and IBSAL, 37007 Salamanca, Spain; 7Centro de Salud Miguel Armijo, Sanidad de Castilla y León (SACYL), 37007 Salamanca, Spain; 8Department of Immunology, Laboratory Medical immunology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, 3015 GD Rotterdam, The Netherlands; 9Department of Immunology, Leiden University Medical Center (LUMC), 2333 ZA Leiden, The Netherlands; 10Institut für Labormedizin, Kantonsspital, 5001 Aarau, Switzerland; 11Hematology Service, Juan Ramón Jiménez Hospital, 21005 Huelva, Spain; 12Hematology Service, Dr. Negrín Hospital, 35010 Las Palmas de Gran Canaria, Spain; 13Hematology Service, Punta de Europa Hospital, Algeciras, 11207 Cadiz, Spain; 14Instituto de Estudios de Mastocitosis de Castilla La Mancha (CLMast), Virgen del Valle Hospital, 45071 Toledo, Spain; 15Hematology Service, Virgen de la Luz Hospital, 16002 Cuenca, Spain; 16Department of Nursery and Physiotherapy, University of Salamanca, 37007 Salamanca, Spain. *These authors have contributed equally to this study and should be both considered as last authors. Dª. Julia Mª Almeida Parra, Doctora en Medicina y Cirugía y Catedrática del Departamento de Medicina de la Universidad de Salamanca C E R T I F I C A : Que el trabajo doctoral realizado bajo mi dirección por Dña. Noemí Muñoz García titulado “DIAGNÓSTICO DE CLONALIDAD DE LOS SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS DE CÉLULAS T Y NK”, reúne las condiciones de originalidad requeridas para optar al grado de Doctor en Medicina por la Universidad de Salamanca, en formato de compendio de artículos/publicaciones, con Mención Internacional. Y para que así conste, firmo la presente certificación en Salamanca a 22 de octubre de 2021. Fdo: Prof. Julia Mª Almeida Parra A mis padres. A mi hermana. A mi prometido. A Nala. Agradecimientos Hay tanto que decir de estos seis años, tantos momentos, tantas emociones, tantas personas. Como en muchos otros aspectos de la vida, esta etapa predoctoral ha estado llena de altibajos, grandes momentos que recordaré siempre y otros no tan buenos a los que le estoy agradecida por haber conseguido hacerme más fuerte. Todo ello no habría sido lo mismo sin la ayuda y apoyo de muchas personas que han formado parte de este camino y, a las cuales, les dedico estas palabras. En primer lugar, quiero dar las gracias a mi directora de tesis por la oportunidad que me brindó desde un principio. Ya son 8 años desde aquel primer día que aparecí por el CIC para que me ofrecieras un proyecto de TFG, proyecto que me encantó y atrapó hasta llegar a donde estoy. Julia, gracias por todo tu tiempo, apoyo y dedicación. He aprendido mucho de ti, de tu entusiasmo por la ciencia y tu implicación, estando siempre dispuesta a todo, aun cuando no tienes tiempo de nada. Ha sido un honor y un placer poder compartir esta etapa contigo, la cual, estoy segura de que no habría sido lo mismo sin ti. También me gustaría agradecer al Dr. Orfao la oportunidad de trabajar a su lado y aprender todo lo que he podido de él. Alberto, eres todo un ejemplo de trabajo, esfuerzo y sabiduría. Gracias por tu ayuda y tu tiempo, y por haberme motivado a desafiarme día a día. A todos aquellos que hicieron que llegase tan lejos. A mi profesor de grado, al Dr. Manuel Fuentes, que fue el que hizo que me encariñara de la inmunología. A mi profesora de TFG y TFM, María Jara, por tu paciencia y tiempo que dedicaste a aquella niña que no sabía prácticamente nada de un laboratorio. A Alba Corral, por enseñarme todo lo que sabías de la citometría. A Paula Fernández, por abrirme las puertas de tu laboratorio y de tu casa. Muchas gracias por tu tiempo, tu ayuda y tu paciencia y por enseñarme todo lo que estaba en tu mano, no solo a nivel profesional, sino también a nivel personal y cultural. Fue una experiencia que nunca olvidaré. A Luciana y Safa que, gracias a sus estancias, me hicieron superarme en distintos aspectos. A mis compis del I+D+I por los buenos ratos que pasamos siempre que voy por allí. A Carolina por tener siempre unas palabras para mí, ya sean a nivel profesional o personal. Has sido un gran apoyo durante todos estos años y estoy segura de que sin ti tampoco habría sido lo mismo. A Javier Muñoz por tus consejos y todas esas conversaciones interminables sin objetivo alguno más que desahogarnos(o desahogarme). A mis chicas de rutina que siempre me sacáis una sonrisa, en especial a Miryam y Virginia que me apoyan y ayudan siempre que pueden. A Vitor por estar siempre disponible y dispuesto a lo que hiciera falta. A Lourdes, Nacho, Elena, María y Luz Alba por vuestros consejos, apoyo y optimismo. A Julio, por aguantarme tantas conversaciones y preguntas, incluso cuando ni sabes de lo que te estoy hablando. A Sheila, Paloma, María GG y Fernando por no reñirme cuando os llevo muestras un viernes a última hora, como siempre. A Martín y Andrés, vuestro trabajo y esfuerzo son un ejemplo a seguir. A Susana, Toño y Juana por tenerme al día de cualquier muestra que me pueda interesar. A Carlos y Juan por sacar siempre un hueco si me hacen falta vuestros servicios. A Alba, Oihane, María, Eli, Óscar, Paula, Bea, Alejandro, Sara, Nacho y Laura por vuestro apoyo. Agradecer a todos mis compañeros del CIC. A Javier Morán por la implicación que has tenido desde el principio y la ayuda que me ofreces cada día. A Daniela, Andrea y Paula por vuestros consejos y ayuda siempre que la he necesitado. A Guillermo por tener tanta paciencia para todos los trámites y paquetes que siempre llegan en el peor momento (si llegan). A Sergio por ser tan cercano y amable. A Blanca y Guille por esos ratitos de desconexión. A Quentin, por todas esas horas dedicadas única y exclusivamente para mí y estar siempre dispuesto a tener una llamada para resolverme cualquier cuestión. A Arancha, Alba, Alicia, Sara, Mariluz, Pablo, Carlos, Elaine y Ángela por esos cafés al aire libre siempre que se pueden. A toda la gente del hospital. A las chicas de hematología por dejarme hacer hemogramas aun cuando están hasta arriba. A Noemi Puig, Ana Yeguas, Alejandro Martín y Miguel Alcoceba por todas las muestras que rescatáis para mí, incluso cuando prácticamente no queda nada. También quiero agradecer a mis amigas de siempre, Cristina, Maider y Vega. Vuestro apoyo incondicional y admiración hacen que quiera superarme cada día. Por último, me gustaría agradecer y dedicar este trabajo a toda mi familia. A mis padres Mario y Mari Carmen, por todas las oportunidades y facilidades que me habéis dado todos estos años y que sin ellas no habría sido posible llegar hasta aquí. A mi hermana Leire, por aconsejarme y apoyarme en todas las decisiones que tomo. Y al resto de mi familia por confiar siempre en mí. A Jose, por la paciencia que has tenido todos estos años y, sobre todo, estos últimos meses. Gracias por darme siempre tus mejores consejos y guiarme en el camino cuando yo lo veo todo muy oscuro. Gracias por animarme y apoyarme en todo lo que hago, es una suerte tenerte a mi lado. Y a Nala, mi fiel compañera de escritura de tesis, por todas esas horas tumbada a mis pies y por todos esos mimos y cariños que me das cuando sabes que más los necesito. Índice Glosario de abreviaturas 1 Introducción 9 1. Linfocitos T ............................................................................................................................. 12 1.1. Ontogenia de los linfocitos T .................................................................................. 12 1.1.1. Maduración T independiente de antígeno ............................................................. 12 1.1.1.1. Complejo receptor de célula T (TCR‐CD3) ................................................... 16 1.1.1.1.1. Reordenamiento de los genes TCR. Mecanismos de generación de diversidad del TCR ............................................................................ 18 1.1.1.2. Selección positiva y negativa ....................................................................... 21 1.1.2. Maduración T dependiente de antígeno ................................................................ 21 1.1.2.1. Reconocimiento antigénico...................................................................... 22 1.1.2.2. Activación, proliferación y diferenciación ................................................. 22 1.2. Clasificación de los linfocitos T de acuerdo con sus funciones efectoras ........................... 25 1.2.1. Linfocitos Tαβ CD4 ................................................................................................. 26 1.2.2. Linfocitos Tαβ citotóxicos ...................................................................................... 28 1.2.3. Linfocitos Tγδ ........................................................................................................ 30 1.3. Características inmunofenotípicas de los linfocitos T circulantes en sangre ..................... 30 2. Células NK .............................................................................................................................. 34 2.1. Ontogenia de las células NK ............................................................................................ 34 2.1.1. Desarrollo y diferenciación .................................................................................... 35 2.1.1.1. Receptores de reconocimiento de las células NK ....................................... 36 2.1.1.2. Mecanismos de reconocimiento de las células NK ..................................... 39 2.1.2. Activación y proliferación ...................................................................................... 41 2.2. Funciones efectoras ...................................................................................................... 43 2.3. Clasificación y características inmunofenotípicas de las células NK circulantes en sangre 44 2.3.1. Células NK CD56++ CD16‐/+d ................................................................................................44 2.3.2. Células NK CD56+d CD16+ ...................................................................................................44 2.3.3. Células NK CD56‐ CD16+ .....................................................................................................46 2.3.4. Células NK CD56+d no convencionales (CD56+d CD16‐) ......................................................48 2.3.5. Células NK tipo linfocito de memoria (células NK memory‐like) ............................. 48 3. Diagnóstico de clonalidad de los SLPC‐T/NK .............................................................................. 50 3.1. Métodos de clonalidad T y NK ................................................................................ 52 3.1.1. Análisis del reordenamiento del gen TCR mediante PCR .......................................... 52 3.1.2. Análisis del repertorio TCRVβ ................................................................................. 54 3.1.3. Test HUMARA ........................................................................................................ 57 3.1.4. Alteraciones genéticas o moleculares .................................................................... 58 3.1.5. Patrones fenotípicos aberrantes asociados a clonalidad ......................................... 59 3.2. Limitaciones de los métodos covencionales de diagnóstico de clonalidad T y NK. 61 3.2.1.SLPC de linfocitos grandes granulares: leucemia de linfocitos T grandes granulares y SLPC‐NK ........................................................................................................ 63 3.3. Nuevos métodos de diagnóstico de clonalidad T y NK. .................................................... 65 3.3.1. Anti‐TRBC1 ....................................................................................................................... 65 3.3.2. Mutaciones somáticas en los genes STAT3 y STAT5B ................................ 68 Hipótesis y objetivos 71 Hypothesis and objectives 77 Material, métodos y resultados / Materials, methods and results 83 Artículo 1 / Paper 1: “Detección de clonalidadlinfoide T mediante el uso del anticuerpo anti‐ TRBC1 por citometría de flujo: estandarización del protocolo de preparación de la muestra e implementación diagnóstica” / “Anti‐TRBC1 Antibody‐Based Flow Cytometric Detection of T‐ Cell Clonality: Standardization of Sample Preparation and Diagnostic Implementation” ... 87 Artículo 2 / Paper 2: “Detección de clonalidad T en la leucemia de linfocitos Tαβ grandes granulares por citometría de flujo, mediante análisis de TRBC1 de alta sensibilidad” / “High‐ sensitive TRBC1‐based flow cytometric assessment of T‐cell clonality in Tαβ‐large granular lymphocytic leukemia” ........................................................................................................ 113 Artículo 3 / Paper 3: “Mutaciones en los genes STAT3 y STAT5B en los síndromes linfoproliferativos crónicos de células T/NK de linfocitos grandes granulares (LGG): Asociación con las características clínico‐biológicas de la enfermedad” / “STAT3 and STAT5B Mutations in T/NK‐Cell Chronic Lymphoproliferative Disorders of Large Granular Lymphocytes (LGL): Association with Disease Features” ................................................................................................. 131 Discusión 159 Conclusiones 181 Conclusions 187 Referencias bibliográficas 193 Anexo I 209 Glosario de abreviaturas Glosario de abreviaturas A ADN: ácido desoxirribonucleico Ag: antígeno AICL: lectina de tipo C inducida por activación AITL: linfoma angioinmunoblástico de células T ALCL: linfoma anaplásico de célula grande ALK: quinasa del linfoma anaplásico ANKL: leucemia agresiva de células NK AP1: proteína activadora 1 APC: aloficocianina ATLL: leucemia/linfoma de células T del adulto B BAG: atanogén asociado a Bcl2 BCR: complejo receptor de célula B (abreviado del inglés B‐cell receptor) C C: grupo de genes constantes (abreviado del inglés Constant) de las cadenas del receptor de célula T Ca2+: calcio CAR‐T: células T portadoras de receptores de antígeno quiméricos (abreviado del inglés Chimeric Antigen Receptor T cells) CDR: regiones determinantes de complementariedad (abreviado del inglés Complementary Determining Regions) CMF: citometría de flujo CMT: célula madre hematopoyética totipotente CMV: citomegalovirus CPA: célula presentadora de antígeno CTLA‐4: antígeno 4 del linfocito T citotóxico (abreviado del inglés Cytotoxic T‐lymphocyte Antigen 4) Cy: citoplasmático D d: expresión débil D: grupo de genes de diversidad (abreviado del inglés Diversity) de las cadenas del TCR DAG: diacilglicerol DAP10: proteína 10 activadora de DNAX DN: doble negativo DP: doble positivo E EDP: doble positivo temprano ERK: vía de la quinasa regulada por señal extracelular ET: célula efectora terminal ETemp: célula efectora temprana Glosario de abreviaturas 3 Glosario de abreviaturas ETP: progenitor temprano de linaje T F FGF: factor de crecimiento fibroblástico FITC: isotiocianato de fluoresceína FSC: dirpersión frontal del luz frontal (abreviado del ingés Forward SCatter) Fyn: miembro de las tirosinas quinasas Src G GM‐CSF: factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos GrB2: proteína 2 unida al receptor del factor de crecimiento H het: expresión heterogénea hi: intensidad elevada (abreviado del inglés high) HLA: moléculas presentadoras de antígeno (abreviado del inglés Human Leukocyte Antigen) HLA‐I: HLA de clase I HLA‐II: HLA de clase II HSPG: proteoglicano de heparán sulfato HTCL: linfoma hepatosplénico de células T HUMARA: test del receptor de andrógenos humano (abreviado del inglés HUMan Androgen Receptor Assay) I IC: intervalos de confianza IFN: interferón IFNγ: interferón γ Ig: inmunoglobulina IL: interleucina ILC: células linfoides innatas (abreviado del inglés Innate Lymphoid Cells) IP3: trifosfato de inositol ISP: simple positive inmaduro ITAM: motivo de activación basado en tirosinas J J: grupo de genes de unión (abreviado del inglés Join) de las cadenas del receptor de célula T K KIR: receptores de tipo inmunoglobulina “asesinos” (abreviado del inglés Killer Immunoglobulin‐like Receptor) 4 Glosario de abreviaturas L LAT: enlazador para la activación de células T LB: linfocito B Lck: proteína tirosina quinasa específica de linfocitos LGG: linfocito grande granular LLGG: leucemia de linfocitos grandes granulares LLGG‐ T: leucemia de linfocitos T grandes granulares LLT‐1: transcripción 1 similar a lectina LT: linfocito T M M: materno MALT: tejido linfoide asociado a las mucosas (abreviado del inglés Mucosa‐Associated Lymphoid Tissue) MAPK: MAP quinasas MC: memoria central ME: memoria efectora MEK: proteína quinasa activada por mitógenos MF: micosis fungoide MIC: proteínas relacionadas con la cadena HLA‐I MO: médula ósea MT: memoria transicional Mut: mutaciones N N: naïve NF‐κB: factor nuclear κB NFAT: factor nuclear de LT activados NGS: secuenciación de última generación (abreviado del inglés Next Generation Sequencing) NK: asesina natural (abreviado del inglés Natural Killer) NKi: células NK inmaduras NKm: células NK maduras NKG2D: receptor del miembro D del grupo NK 2 NKG2DL: ligando NKG2D NOS: no especificado Nt: nucleótido O OLP: órgano linfoide primario OLS: órgano linfoide secundario OMS: Organización Mundial de la Salud 5 Glosario de abreviaturas P P: paterno PE: ficoeritrina PerCP: clorofila de peridinina pY: bolsillo de unión a fosfato PAK: quinasa activada por p21 PCR: reacción en cadena de la polimerasa (abreviado del inglés Polymerase Chain Reaction) PI3K: fosfatidilinositol 3‐quinasa PIP2: fosfatidilinositol 4,5‐bifosfato PKC: proteína quinasa C PLC: precursor linfoide común PLC‐γ: fosfolipasas Cγ PLCγ1: fosfolipasas Cγ1 PNK: progenitor NK PVR: receptor de poliovirus R R: receptor RAS: familia de proteínas de unión a GTP RNK: receptor de células NK S SCF: factor de célula stem SH2: dominios homologos Src‐like 2 SI: sistema inmune SLPC: síndrome linfoproliferativo crónico SLPC‐ B: síndrome linfoproliferativo crónico B SLPC‐NK: síndrome linfoproliferativo crónico NK SLPC‐T: síndrome linfoproliferativo crónico T SLPC‐T/NK: síndromes linfoproliferativos crónicos T y NK Sm: expresión en la membrana citoplasmática SP: sangre periférica SPos: simple positivo SS: síndrome de Sézary SSC: dispersión lateral de luz (abreviado del inglés Side SCatter) STAT: transductores de señal y activadores de la transcripción (abreviado del inglés Signal Transducer and Activator of Transcription) T T‐CUS: pequeños clones Tαβ de significado incierto (abreviado del inglés T‐cell clones of uncertain significance) T‐PLL: leucemia prolinfocítica de células T TCR: complejo receptor de célula T (abreviado del inglés T‐Cell Receptor) Tdt: desoxinucleotidil transferasa terminal Glosario de abreviaturas 6 Glosario de abreviaturas TFH: linfocito T colaborador folicular TGF‐β: factor de crecimiento transformante β Th: linfocito T colaborador (abreviado del inglés T helper) TLS: tejido linfoide secundario TNF: factor de necrosis tumoral TNFα: factor de necrosis tumoral α TRA: cadena α del TCR TRB: cadena β del TCR TRBC: zona constante de la cadena β del TCR TRD: cadena δ del TCR Treg: linfocito T regulador TRG: cadena γ del TCR U ULBP: proteína de unión a UL16 V V: grupo de genes variables (abreviado del inglés Variable) de las cadenas del receptor de célula T VAV‐1: factor 1 de la familia de las proteínas Vav VEB: virus de Epstein‐Barr VHC: virus de la hepatitisC VIH: virus de la inmunodeficiencia humana X X: cromosoma X Y YINM: motivo de señalización basado en tirosinas Z ZAP‐70: proteína quinasa asociada a la cadena de 70 kDa 7 Introducción Introducción El sistema inmunológico protege al organismo de sustancias potencialmente nocivas, a través del reconocimiento y posterior respuesta frente a los diversos antígenos (Ag), mediante la puesta en marcha de dos fases secuenciales de la respuesta inmune: fase innata y fase adaptativa.1,2 La inmunidad innata es la primera línea de defensa, que actúa de forma rápida, estereotipada y no específica, mediante la detección (a través de receptores no específicos) y eliminación subsiguiente de una amplia gama de patógenos, llevadas a cabo por células inflamatorias (granulocitos, monocito‐ macrófagos, células dendríticas y mastocitos), células natural killer (NK) y elementos solubles (como citocinas proinflamatorias y proteínas del sistema del complemento).1 Por otro lado, la inmunidad adaptativa se pone en marcha para reforzar la capacidad funcional de la inmunidad innata y responder de forma específica y adaptada a cada tipo particular de Ag, siendo esta la fase de la respuesta de la que depende de forma fundamental la resolución del proceso, y además es capaz de generar memoria inmunológica. La respuesta adaptativa está mediada por linfocitos T (LT) y linfocitos B (LB) específicos de Ag, que son seleccionados durante su formación en el órgano linfoide primario (OLP) mediante un proceso de recombinación somática de una gran variedad de segmentos de genes. Este proceso tiene como finalidad generar el receptor específico de Ag único para cada linfocito T o B (TCR o receptor de célula T y BCR o receptor de célula B, respectivamente), elemento básico para el reconocimiento específico de cada Ag particular.2 Todos los elementos celulares de la sangre, incluyendo la práctica totalidad de las células del sistema inmune (SI), derivan en última instancia de un precursor hematopoyético multipotencial de la médula ósea (MO) en un proceso biológico dinámico, complejo y finamente regulado, que es la hematopoyesis.1,2 11 Introducción 1 ׀. Linfocitos T 1. Linfocitos T Los LT son las células encargadas de reconocer y responder de forma específica y adaptada frente a distintos agentes extraños ensamblados en moléculas presentadoras de antígeno (moléculas HLA, abreviado del inglés Human Leukocyte Antigen) expresadas en las células presentadoras de antígeno (CPA) y células diana, a la vez que toleran las estructuras propias. Tenemos un amplio repertorio de LT (estimado en unos 1011 linfocitos),3–5 cada uno de los cuales está programado genéticamente para reconocer de forma prácticamente exclusiva a un único Ag, mediante sus receptores específicos para Ag, los TCR. Estos dos procesos básicos (adquisición de la inmunocompetencia mediante la generación del TCR y adquisición de la autotolerancia inmunológica) tienen lugar durante la ontogenia linfoide T en el OLP (el timo).6–8 1.1. Ontogenia de los linfocitos T Los precursores de los LT migran desde la MO hasta el timo, cuya única función es iniciar y mantener su diferenciación celular.9,10 Los LT maduros diferenciados (que expresan un TCR no autorreactivo) circulan desde el timo hacia los órganos linfoides secundarios (OLS) a través de la sangre periférica (SP), hasta donde llegan las CPA para presentar los Ag procesados y ensamblados en sus moléculas HLA a los LT, a los que activan para que inicien respuestas inmunes específicas. Finalmente, los LT que ya han tenido contacto con Ag, tras realizar sus funciones efectoras, generan memoria inmunológica, fundamental en el caso de un eventual reencuentro con patógenos conocidos.11 En conjunto, todos estos procesos integran la maduración del LT, que puede dividirse en dos grandes etapas: maduración independiente de Ag, que tiene lugar en el timo, y maduración dependiente de Ag, que ocurre en los OLS y en la SP. 1.1.1. Maduración T independiente de Ag En el timo, los LT en desarrollo (también conocidos como timocitos) se someten a procesos regulados como es el reordenamiento de los genes del TCR, así como a rigurosos procesos de selección, que garantizan por un lado la restricción en el reconocimiento de moléculas del sistema HLA (mediante 12 Introducción 1 ׀. Linfocitos T la selección positiva) y por otro lado la tolerancia inmunológica frente a proteínas propias (mediante la selección negativa). La mayoría de los timocitos darán lugar a LTαβ, que a su vez se diferencian en distintas subpoblaciones celulares en función de la expresión de los correceptores CD4 y CD8, mientras que una minoría de ellos originarán los LTγδ.1,7,12 Por tanto, el OLP donde se generan LT inmunocompetentes y autotolerantes es el timo, pero en este órgano las células precursoras de los LT no tienen capacidad de autorrenovación. Por este motivo, el timo debe nutrirse de progenitores de LT que proceden de la MO, donde se genera un precursor linfoide común (PLC) a partir de una célula madre hematopoyética totipotencial (CMT) (y, por tanto, con capacidad de autorrenovación), que da lugar a los LT, LB y células NK. La interacción de Notch1 y del receptor de la interleucina (IL)‐7 con sus ligandos correspondientes (localizados en los PLC y en las células del estroma de la MO, respectivamente) son procesos que están involucrados de manera esencial en la activación de vías de señalización que favorecen el compromiso hacia la línea linfoide T (e inhibición de compromiso hacia la línea linfoide B), lo cual a su vez lleva a la proliferación de los precursores linfoides T.9,13–17 Estos precursores linfoides T inmaduros (que mayoritariamente son CD7++CD34+CD44+CD117+Tdt+) salen de la MO, desde donde se dirigen al timo por vía sanguínea.14,18– 20 La unidad funcional del timo es el lobulillo tímico, delimitado por trabéculas y constituido por 3 capas bien diferenciadas, representadas por las zonas subcapsular, cortical y medular (de la más externa a la más interna).14 En el interior del lobulillo tímico se encuentran los timocitos y una amplia red de otras células que constituyen el estroma del timo. A lo largo de las etapas de maduración tímica (que secuencialmente ocurre desde la región subcapsular hasta la medular, pasando por la cortical del timo), los timocitos interaccionan con las células estromales y experimentan los procesos madurativos esquematizados en la Figura 1. En su fase más temprana, los precursores de los linfocitos T (protimocitos que, como se ha mencionado, son mayoritariamente CD7++CD34+CD44+CD117+Tdt+) migran por vía sanguínea desde la MO hacia la región subcapsular del timo; se cree que tanto CD7 como CD44 serían moléculas relacionadas con el tropismo de los precursores CD34+ por el timo, y en Introducción 1 ׀. Linfocitos T 13 Introducción 1 ׀. Linfocitos T concreto, CD44 estaría implicada en el tropismo de este precursor por la zona subcapsular del timo,17 donde se inicia el proceso ontogénico gracias a la estrecha interacción que establecen con las células epiteliales de la zona subcapsular del timo. A este nivel, los timocitos subcapsulares (o timocitos de tipo I) aún son dobles negativos (DN), es decir, carecen de expresión en la membrana de los correceptores CD4 y CD8, aunque presentan ya en la membrana otros marcadores pan‐T, como CD2 y CD5 –además de CD7–, cuya expresión es inducida por la activación (mutua) resultante de la interacción timocito‐célula epitelial tímica.14,18,21 Los timocitos DN pueden subdividirse en diferentes tipos celulares (DN1/ETP –progenitor temprano de linaje T–, DN2 y DN3) en función de la expresión de sus receptores demembrana (p. ej., CD1a y CD44)10,15,17,20,22–25 (Figura 1). En este estadio temprano de timocito DN comienza el reordenamiento de los genes del TCR, constituyendo éste el hecho central de la diferenciación tímica.13 En una primera fase del proceso de recombinación de genes, las células DN comienzan a reordenar los segmentos génicos de las cadenas δ, γ y β del TCR, en este orden.6,26,27 Los timocitos DN que generen reordenamientos productivos de las cadenas γ y δ del TCR (una minoría) abandonan el timo de forma precoz como linfocitos Tγδ, que no expresan el correceptor CD4, siendo la expresión de CD8 débil o negativa (CD4‐CD8‐/+d). Por otro lado, las células DN con reordenamientos no productivos de la cadena γ pero que hayan reordenado con éxito su cadena β se ensamblan con las cadenas pre‐TCRα, formando el complejo pre‐TCR; el resto de los timocitos que no han conseguido reordenamientos productivos entran en apoptosis.7,9,19,22,23 El pre‐TCR contiene la cadena β reordenada, asociada a CD3 (que ya se expresa por tanto en la membrana) y a una proteína invariante denominada pre‐TCRα, que suple temporalmente a la cadena α. La expresión correcta del complejo pre‐TCR en la membrana de la célula proporciona las señales necesarias para: i) “informar” al timocito de que se ha reordenado con éxito la cadena β, lo cual detiene nuevos reordenamientos de esta cadena (fenómeno que se conoce como exclusión alélica); ii) inducir la expresión de los correceptores CD4 y CD8, y la proliferación celular de los timocitos, así como; iii) el reordenamiento del gen TRA, para producir timocitos dobles positivos (DP) ya en la zona cortical del timo (timocitos de tipo II),23,28 que representan alrededor del 80% del total de los timocitos, como consecuencia de la 14 Introducción 1 ׀. Linfocitos T intensa proliferación.29 Las células DP que hayan reordenado correctamente su cadena α se someten a una selección mayoritariamente positiva en la zona cortical, así como a una selección negativa, esta última predominantemente en la zona medular.22 Durante el desarrollo de los LT, los timocitos DP que producen un TCR que reconoce moléculas HLA de clase I (HLA‐I) pierden expresión de CD4 (y a partir de ese momento serán timocitos con expresión solo de CD8), mientras que aquellos con una especificidad de TCR restringida por moléculas HLA de clase II (HLA‐II) pierden la expresión de CD8 (y serán timocitos con expresión exclusiva de CD4), convirtiéndose ambas en células simples positivas (SPos).7,14,28,29 Tras su maduración, las células T abandonan el timo (desde la zona medular) y circulan por la SP y/o OLS como LT naïve Spos, hasta entrar en contacto con su Ag y promover respuestas inmunológicas.22,23,26,28 Figura 1. Representación esquemática del proceso de diferenciación linfoide T independiente de Ag en humanos. En la figura se puede observar la maduración T independiente de antígeno que tiene lugar en el timo, desde un PLC generado a partir de una CMT de la médula ósea, así como el fenotipo de cada uno de los estadios madurativos y el estado de reordenamiento de los genes del TCR. Abreviaturas (orden alfabético): CMT, célula madre hematopoyética totipotente; cy, citoplasmático; DN, doble negativo (CD4‐CD8‐/+d); DP, doble positivo (CD4+CD8+); EDP, doble positivo temprano; ETP, progenitor temprano de linaje T; d, expresión débil; IL, interleucina; ISP, simple positivo inmaduro; LT, linfocito T; MO, médula ósea; PLC, precursor linfoide común; SPos, simple positivo (CD4+CD8‐ o CD4‐CD8+); TdT, desoxinucleotidil transferasa terminal. El timo es extremadamente activo en el periodo fetal y perinatal, así como durante la infancia y etapa prepuberal, pero continúa generando nuevas células T en la edad adulta e incluso en la vejez. Aunque la producción de LT naïve disminuye a medida que el timo sufre una involución fisiológica 15 Introducción 1 ׀. Linfocitos T progresiva con el envejecimiento, esas células expresan un amplio repertorio de TCR que proporcionan la diversidad necesaria para responder al desafío antigénico.14,18,23,30,31 Dado que los dos eventos clave de la ontogenia T en el timo son la generación de un TCR funcionante (esto es, restringido por el sistema HLA propio) y autotolerante (es decir, no reactivo frente a proteínas propias), en los siguientes apartados se describen con más detalle estos procesos, precedidos de una sección en la cual se explica la estructura del complejo receptor de la célula T (TCR‐ CD3), para una mejor compresión de los siguientes apartados. 1.1.1.1. Complejo receptor de la célula T (TCR‐CD3) El complejo receptor de la célula T (TCR‐CD3) está formado por el TCR propiamente dicho (TCRαβ o TCRγδ, específico de cada LT) y por un conjunto de cadenas invariables que constituyen la molécula CD3, común a todos los LT.2,12,32 El TCR propiamente dicho es el encargado del reconocimiento específico del Ag, mientras que la función de CD3 es contribuir a la estabilización del complejo y a la transmisión de la señal de reconocimiento antigénico al interior celular. Desde el punto de vista estructural, el TCR es un heterodímero compuesto por dos cadenas polipeptídicas diferentes (TCRα y TCRβ en los LTαβ o TCRγ y TCRδ en los LTγδ) unidas por puentes disulfuro y ensambladas a la membrana del LT, que contienen cada una de ellas dos dominios extracelulares tipo inmunoglobulina (Ig) (uno constante –C– y otro variable –V–), un péptido de conexión proximal a la membrana, un segmento transmembrana y una cola citoplasmática corta que no es capaz de transducir señales moleculares (Figura 2A).2,32–34 La zona o dominio variable de las cadenas del TCR es la que interacciona con un complejo HLA:péptido determinado y por tanto, la que confiere la especificidad única a cada LT, generada por el proceso de recombinación somática que se describirá con más detalle en la siguiente sección;2,33 dentro de la zona variable en cada cadena del TCR, existen tres zonas en las cuales la variabilidad es mucho mayor, y que son realmente las que condicionan la complementariedad con un antígeno particular, denominadas por este motivo Introducción 1 ׀. Linfocitos T 16 Introducción 1 ׀. Linfocitos T “regiones determinantes de complementariedad” (CDR, abreviado del inglés Complementary Determining Regions): CDR1, CDR2 y CDR3. Por otro lado, la molécula CD3 consta de 4 subunidades o cadenas diferentes (γ, δ, ε y ζ) y están asociadas en cada complejo de la siguiente manera: i) dos heterodímeros CD3γε y CD3δε, compuestos por un único dominio de Ig extracelular, un péptido de conexión proximal corto, un segmento transmembrana y un motivo intracelular (corto) de activación basado en tirosinas (ITAM); y ii) dos homodímeros CD3ζ (CD247) unidos covalentemente, que tienen una porción intracitoplasmática larga con dominios ITAM.2,3,15,32,34,35 En la Figura 2A se representa de forma esquemática la estructura del complejo TCR‐CD3 de un LTαβ. En el espacio, el segmento transmembrana del complejo TCR‐CD3 adopta una estructura tridimensional en forma de barril, formada por la interacción de las dos hélices transmembrana de CD3ζζ con las de CD3γε y CD3δε (Figura 2B).32,34 A su vez, algunos bucles de los TCR‐Cβ y TCR‐Cα interactúan con CD3γε y/o CD3δε, respectivamente (Figura 2B).34 La función de CD3 de estabilización del complejo depende sobre todo de las cadenas CD3γ, CD3δ y CD3ε, mientras que la transmisión de la señal de reconocimiento del péptido:HLA al interior de la célula T depende sobre todo del homodímero CD3ζζ, gracias a sus colas intracitoplasmáticas largas con motivos ITAM.2,3,15,32,34,35 Figura 2. Representación esquemática y estructural del complejo TCRαβ‐CD3. A) Diagrama esquemático del receptor TCRαβ funcional, junto con las cadenas invariables de la molécula CD3. B) Modelo estructural en 3 dimensiones del complejo TCRαβ‐CD3,obtenido mediante cristalografía, en el que se aprecia la relación espacial de las cadenas CD3γ, δ y ε con las cadenas TCRα y β. Modificada de Dong et al.32 17 Introducción 1 ׀. Linfocitos T 1.1.1.1.1. Reordenamiento de los genes TCR. Mecanismos de generación de diversidad del TCR El repertorio inmunológico completo se desarrolla en cada individuo previamente al contacto con el Ag y sin recibir ninguna información por parte de este último. Previo al contacto con el antígeno se produce un reordenamiento y recombinación de los segmentos génicos de la línea germinal que heredan de sus precursores.36 Un punto clave de la diferenciación tímica es el proceso en el que una serie coordinada de reordenamientos de genes conducen a la creación de genes funcionales que codifican las cadenas αβ o γδ del TCR, mediante la elección (que se produce al azar) de una única versión de cada grupo de genes que codifican las distintas zonas del receptor para antígeno. Los TCR contienen segmentos de genes V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), siendo su configuración de línea germinal diferente para cada uno de ellos. En humanos, los genes de la cadena α del TCR se encuentran en el cromosoma 14 y comprende 54 regiones V, 61 regiones J y un único segmento C y los de la cadena β (localizados en el cromosoma 7) incluyen aproximadamente 67 regiones V, 2 regiones D, 13 regiones J y 2 regiones C. Las cadenas γ (cromosoma 7) y δ (cromosoma 14) son menos complejas, ya que tienen aproximadamente 12V‐5J‐2C y 8V‐3D‐4J‐1C genes, respectivamente.2,6,7,26,37–41 Cabe reseñar que los genes de la cadena δ se encuentran intercalados en el mismo locus del cromosoma 14 donde están los genes del TCRα. En el caso de los TCRβ y TCRδ, primero se reordenan al azar un segmento (de una versión alélica) del gen D con un segmento J (reordenamiento D‐J) y posteriormente se ensambla DJ reordenado a un segmento V (reordenamiento V‐DJ). En las cadenas TCRα y TCRγ, en las que no hay genes D, hay un reordenamiento directo de una versión alélica V con un segmento J elegido (reordenamiento V‐J). Finalmente, en las cuatro cadenas, se unen ambas estructuras al segmento C (VDJ‐C o VJ‐C) en un proceso ordenado, espacial y secuencial. Este reordenamiento, tras la exclusión alélica y la transcripción y traducción de los genes,26 produce un único TCR para un linaje de LT determinado que se expresa en la membrana de la célula (ejemplificado en la Figura 3, tomando como modelo el proceso de recombinación somática de la cadena β del TCR). Este proceso, denominado de recombinación Introducción 1 ׀. Linfocitos T 18 Introducción 1 ׀. Linfocitos T somática, lleva a la generación de un repertorio extraordinariamente diverso de reactividad antigénica potencial (>109 TCRs),6,7,42 aunque la población funcional es mucho menor debido a los requisitos de selección durante la maduración en el timo. La diversidad adicional (conocida como diversidad de unión), es conferida por alguna imprecisión inherente en las reacciones de unión del ácido desoxirribonucleico (ADN) involucradas en la ligadura de roturas del ADN de doble cadena, lo que resulta en alguna adición o eliminación de bases nitrogenadas.2,5 Además, la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) cataliza la adición independiente del molde de varios nucleótidos (generalmente de 1 a 5) en las uniones de los extremos rotos de ADN por acción de las enzimas recombinasas. Estas áreas de unión codifican primordialmente CDR3 del bolsillo de unión al Ag del TCR, siendo este el sitio de mayor variabilidad.2,5 Finalmente, la asociación al azar de las cadenas para formar el heterodímero TCR (siempre restringido a la unión de una cadena α con una β, y de una cadena γ con una δ) añade mayor diversidad al repertorio TCR. Estos tres mecanismos (recombinación somática, diversidad de unión y asociación de cadenas al azar) son los responsables de la generación de la extraordinaria diversidad de receptores para antígeno en los LT, y todos ellos acontecen previamente al contacto antigénico (es decir, el repertorio de TCR se genera exclusivamente durante la diferenciación independiente de antígeno en el OLP, a diferencia del repertorio de los LB).2,5 19 Introducción 1 ׀. Linfocitos T Introducción 1 ׀. Linfocitos T Figura 3. Representación esquemática del proceso de recombinación somática de la cadena beta del TCR (TCRβ). Diagrama esquemático de los pasos de reordenamiento secuencial, transcripción y traducción del gen TRB en el que, de forma aleatoria, se genera un receptor TCRαβ funcional, junto con las cadenas invariables de la molécula CD3. En el ejemplo A, se produce primero un reordenamiento de Dβ1 a Jβ1.5, seguido de un reordenamiento de Vβ2 a Dβ1‐Jβ1.5, que da como resultado la formación de una unión de codificación Vβ2‐Dβ1‐Jβ1.5‐Cβ1. En el ejemplo B, la codificación resultante es Vβn‐Dβ2‐Jβ2.5‐Cβ2. El gen TRB reordenado se transcribe y empalma en ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y finalmente se traduce a una cadena de proteína TRB. 20 Introducción 1 ׀. Linfocitos T 1.1.1.2. Selección positiva y negativa La selección positiva garantiza la restricción en el reconocimiento de moléculas del sistema HLA. Mediante este proceso, los timocitos DP (CD4+CD8+) en desarrollo que expresan TCRαβ funcionales son capaces de reconocer con baja afinidad moléculas HLA presentadas por células epiteliales tímicas (mayoritariamente en la zona cortical del timo), lo que les permite continuar su maduración hacia células SPos (LTαβ CD4+CD8‐ o CD8+CD4‐). En ausencia de selección positiva (es decir, cuando los timocitos no se unen a moléculas HLA en el estadio de células DP), estos entran en apoptosis, lo cual afecta a la gran mayoría de los timocitos corticales (aprox. 90‐95%), como se ha mencionado en apartados anteriores.2,3,13,22,33 Entre los timocitos rescatados por la selección positiva, existirán algunos con una gran afinidad por los péptidos provenientes de proteínas propias. Estos timocitos autorreactivos son eliminados (en la médula tímica) por selección negativa: aquellos TCRαβ de timocitos DP o SPos que se unan con una afinidad alta a moléculas HLA de las células epiteliales tímicas presentes en la zona medular sufren apoptosis para prevenir la generación de linfocitos autorreactivos, siendo este el principal mecanismo que asegura la inmunotolerancia central. Este proceso de selección negativa elimina aproximadamente un 50% de los timocitos, especialmente dentro del compartimento de los timocitos medulares CD8+.10,23,28,43 Al final de ambos procesos de selección, solo del 1% al 5% de los precursores de LT iniciales logran sobrevivir. Estas células emigran del timo como LT maduros naïve SPos CD4 o CD8 funcionales (es decir, con un TCR capaz de reconocer péptido ensamblado en molécula HLA propia) y no autorreactivos.7,23 No se conoce aún con precisión los mecanismos selectivos que sufren los LTγδ, aunque sí se sabe que su selección es independiente de moléculas HLA.7,22 1.1.2. Maduración T dependiente de Ag Una vez completado el proceso de maduración a LT SPos naïve, las células circulan por la SP y/o OLS a la espera de una estimulación antigénica a través de una CPA o de una célula diana (por ejemplo, una célula infectada por un virus, cuyos péptidos son presentados en moléculas HLA‐I de la célula), lo 21 Introducción 1 ׀. Linfocitos T cual desencadenará un programa de activación y llevará a la proliferación y diferenciación a LT efectores (capaces de eliminar al microorganismo que los activó) y a LT de memoria (para poder actuar más rápidamente ante futuros reencuentros con el mismo patógeno).2–4,44,45 La maduración dependiente de antígeno de los LT periféricos, maduros o postímicos, está integrada por las fases sucesivas de reconocimientoantigénico, activación, proliferación y diferenciación. 1.1.2.1. Reconocimiento antigénico El proceso comienza cuando el TCR de un LT SPos (TCD4 o TCD8) naïve (o LT virgen) reconoce un péptido antigénico específico ensamblado en una molécula HLA de una CPA (o de una célula diana) en los OLS (complejo TCR‐péptido‐HLA), una interacción que se estabiliza mediante la unión simultánea del correceptor correspondiente (CD4 o CD8), iniciándose una serie de eventos bioquímicos intracelulares que lleva a la formación de la sinapsis inmunológica y activación del LT (Figura 4).2,3,46 Como ya se comentó en el apartado de maduración T independiente de Ag, los LTCD8 reconocen epítopos presentados por moléculas HLA‐I (péptidos pequeños, de unos 8‐10 aminoácidos, de origen intracelular), mientras que los LTCD4 lo hacen por moléculas HLA‐II (péptidos más largos, de unos 13‐ 25 aminoácidos, generalmente de origen extracelular).3,7,14,28,29 En cambio, el reconocimiento del péptido en los LTγδ no es dependiente de moléculas HLA, pudiendo reconocer patrones moleculares asociados a patógenos y citocinas en ausencia de ligandos de TCR.2,3,47,48 1.1.2.2. Activación, proliferación y diferenciación Tras el reconocimiento antigénico, una vez formado el complejo TCR‐péptido‐HLA‐correceptor, se inicia un complejo proceso de señalización en el lado interno de la membrana y en el citoplasma, que tiene como finalidad la activación de 3 factores de transcripción: factor nuclear de LT activados (NFAT), proteína activadora 1 (AP1) y factor nuclear κB (NF‐κB).3 Estas vías de señalización comienzan cuando la fosfatasa CD45 (expresada de forma intensa en la membrana de los LT maduros) activa las tirosinas‐quinasas (Fyn y Lck, asociadas a las cadenas CD3ε y a los correceptores CD4/CD8, Introducción 1 ׀. Linfocitos T 22 Introducción 1 ׀. Linfocitos T respectivamente) que se autofosforilan y fosforilan los residuos ITAMs citoplasmáticos presentes en las cadenas CD3 (CD3γ, CD3δ, CD3ε y sobre todo CD3ζζ). Los ITAM fosforilados reclutan moléculas de señalización ZAP‐70 a través de sus dominios homólogos Src‐like 2 (SH2), cuya activación fosforila fosfolipasas Cγ1 (PLCγ1) y proteínas adaptadoras conocidas como LAT, activando varias vías de señalización. Estas cascadas de señalización inducen movilización de calcio intracelular, polimerización de actina y activación de MAP quinasas, que llevan finalmente a la activación de los tres factores de transcripción (NFAT, AP1 y NF‐κB), que se translocan al núcleo e inducen la expresión de genes esenciales para la proliferación y función de los LT y su regulación (Figura 4).2,3,7,32,49 Es importante tener en cuenta que para la adecuada activación de los LT se requiere, además de las señales mediadas por el complejo TCR (TCR‐CD3) y los correceptores CD4 o CD8, otras señales mediadas por moléculas coestimuladoras y/o citocinas proinflamatorias, con la finalidad de facilitar los primeros eventos en la señalización del TCR e inducir una activación óptima de la célula T.2,7,44 Entre las primeras, destaca especialmente la molécula CD28, imprescindible para la activación de los LT naïve (pero no para los LT de memoria), cuyos ligandos son CD80 y CD86 de la CPA; por su parte, las señales generadas por la interacción de las citocinas proinflamatorias secretadas por la CPA con sus receptores expresados en el LT llevan directamente a la generación de c‐Jun fosforilado, uno de los integrantes del factor de transcripción AP1. La consecuencia inmediata de la activación de los tres factores de transcripción descritos (NFAT, AP1 y NF‐κB) y su posterior translocación al núcleo, es activar la expresión de genes directamente involucrados en la proliferación de los LT, como la IL‐2 y la molécula CD25 (cadena alfa del receptor de IL‐2, que es la cadena que confiere al receptor de la IL‐2 una afinidad elevada por su ligando). La interacción (de forma autocrina y paracrina) de IL‐2 con su receptor de alta afinidad lleva a una fase de multiplicación muy intensa, que tiene como objetivo la expansión clonal, es decir, la generación de un número elevado de células hijas con la misma especificidad que el LT que fue inicialmente activado tras el reconocimiento específico.3,50 A las 48‐72 horas de la activación, el LT induce un incremento en la expresión en la membrana de la molécula CD152 (CTLA‐4, del inglés Cytotoxic T‐lymphocyte Antigen 4), que compite con CD28 por la unión a CD80 o CD86, pero que 23 Introducción 1 ׀. Linfocitos T transmite señales de inhibición para extinguir la activación del LT, evitando así una respuesta inmune incontrolada. Figura 4. Representación esquemática del proceso de activación del LT, iniciado a partir del reconocimiento específico del complejo péptido:HLA. Abreviaturas (orden alfabético): AP1, proteína activadora 1; Ca2+, calcio; CPA, célula presentadora de antígeno; DAG, diacilglicerol; Fyn, miembro de las tirosinas quinasas Src; HLA‐II, moléculas presentadoras de antígeno de clase II; IP3, trifosfato de inositol; LAT, enlazador para la activación de células T; Lck, proteína tirosina quinasa específica de linfocitos; MAPK, MAP quinasas; NFAT, factor nuclear de LT activados; NF‐κB, factor nuclear κB; PIP2, fosfatidilinositol 4,5‐bifosfato; PKC, proteína quinasa C; PLCγ1, fosfolipasas Cγ1; RAS, familia de proteínas de unión a GTP; TCR, receptor de célula T; ZAP‐70, proteína quinasa asociada a la cadena de 70 kDa. Figura adaptada de Cano et al 2013.3 Tras la expansión clonal (que es la fase de mayor duración del proceso, ya que se requieren entre 3 y 5 días), se produce la diferenciación a un LT efector, que migra a los tejidos para proceder a la eliminación del patógeno a través de diferentes mecanismos efectores, dependiendo del tipo de LT de que se trate (véase más adelante).2,7,32,44 A medida que se erradica el patógeno, los LT experimentan una fase de muerte celular durante la cual el 90% de las células efectoras se eliminan por apoptosis.3,7 Sin embargo, una pequeña fracción de estas células específicas de Ag sobreviven y persisten 24 Introducción 1 ׀. Linfocitos T circulantes en SP o no circulantes en los OLS, como LT de memoria efectora o central, respectivamente, volviendo a su estado de reposo o inactivación, preparadas para conferir una protección rápida e intensa ante un eventual reencuentro con patógenos conocidos.4,7,45,51,52 Por tanto, los LT pueden encontrarse en la SP en tres estados madurativos distintos: naïve (o vírgenes, ya que no han entrado en contacto con el antígeno desde que salieron del timo) o diferenciados a células de memoria o a células efectoras. Cuando se pone en marcha la respuesta inmunitaria específica, tanto los LT naïve como los LT de memoria se activan y maduran, dando lugar (al cabo de varios días) a LT efectores.3,7 1.2. Clasificación de los LT de acuerdo con sus funciones efectoras Aunque todos los LT comparten los principios básicos del desarrollo tímico y los mecanismos de activación, expansión clonal y diferenciación a los que se ha hecho referencia, existe una diversidad notable de funciones efectoras que se desencadenan en respuesta a la activación, en función del tipo de LT del que se trate: i) función auxiliar/colaboradora, proporcionando señales afines que implican contacto celular directo o bien a través de la liberación de citocinas, que promueven la activación de los mecanismos inmunológicos más idóneos para eliminar los patógenos (por ejemplo, a través de la secreción de citocinas que activan respuestas mediadas por los LB, o por otros LT, y/o activación de los fagocitos –monocitos y macrófagos–); ii) función citotóxica, mediante la eliminación de células infectadas por patógenos, a través de diversos mecanismos de citotoxicidad; y iii) respuesta inmunitaria limitando el daño tisular que se produce en respuestas inmunitarias autorreactivas(autoinmunes) o excesivamente inflamatorias.2 Cada una de estas funciones es llevada a cabo por un tipo de LT efector, como se describe en los siguientes apartados. En un primer nivel de clasificación de los LT, distinguimos dos grandes subpoblaciones celulares en función del tipo de TCR que expresen: LTαβ y LTγδ. Los LTγδ son LT periféricos que se encuentran fundamentalmente en las mucosas de los epitelios (y están poco representados en la SP, ganglio linfático y otros OLS), son precoces (es decir, abandonan el timo mucho antes que el resto de los 25 Introducción 1 ׀. Linfocitos T precursores linfoides T), tienen un repertorio escaso al presentar menor diversidad, pero son capaces de reconocer a través de su TCR a más de un Ag (no de forma simultánea), y su única función es la de citotoxicidad.47,53 En cambio, los LTαβ constituyen los LT más frecuentes de la sangre y de los OLS, son células cuya ontogenia ocurre de manera completa en el timo, y tienen un repertorio muy amplio, pero cada unidad de LT solamente es capaz de reconocer de forma específica un único Ag muy concreto, y no solo tienen función de citotoxicidad, sino que tienen funciones diversas.2,3,53 A su vez, dentro de cada tipo de LT (αβ o γδ), clásicamente se clasifican en función del patrón de expresión de los correceptores (CD4 y CD8). De este modo, dentro de los LTγδ solamente existe un tipo celular, que son aquellos que no expresan CD4 (CD4‐) y son CD8‐/+d, mientras que dentro de los LTαβ existen 4 subpoblaciones diferentes: 2 mayoritarias, que son los LTαβCD4+CD8‐ y los LTαβCD4‐CD8+ (que representan el 22‐82% y 9‐50% de los LT, respectivamente, en SP de adultos sanos, lo cual se traduce en una ratio normal TCD4/TCD8 en sangre de 0,7 a 4) y otros dos tipos de LT maduros menos representados en la sangre de sujetos sanos, que son los LTαβCD4+CD8+ y los LTαβCD4‐CD8‐/+d (0‐2% y 0,2‐2%, respectivamente, de los LT).54–58 1.2.1.1. LTαβ CD4 El grupo mayoritario de LT presentes en la SP humana es la población de LTαβCD4+CD8‐. La mayoría de estas células cumplen una función de colaboración con otras células del SI a través de la producción y secreción de citocinas, como son: ayudar a la respuesta de los LB, a la respuesta citotóxica llevada a cabo por los LT citotóxicos y células NK y a las células de la respuesta inflamatoria. Por este motivo, se les denomina LT colaboradores o Th (del inglés, helper).3,23,59 Hasta encontrar a su péptido‐ HLA‐II, los LT CD4 naïve tienen el potencial de orientarse hacia cualquiera de las diferentes subpoblaciones efectoras de linfocitos Th pero en función de las citocinas y otras señales presentes en el ambiente se induce la activación de ciertos factores de transcripción (Tabla 1) que llevan a la diferenciación hacia células Th1, Th2, Th9, Th17, Th1/Th17 o Th22. Cada subtipo de linfocitos Th produce un patrón de citocinas característico, que condiciona su función para iniciar y llevar a cabo respuestas inmunológicas distintas (Tabla 1).2–4,45,50,60–62 Además de su función convencional como 26 Introducción 1 ׀. Linfocitos T células Th, hoy sabemos que dentro del compartimento de los LTαβCD4+CD8‐ se encuentran células con otras funciones, como los LT colaboradores foliculares (TFH) y los LT reguladores (Treg) (Tabla 1).2– 4,45,60,61,63–66 Tabla 1. Subtipos de LTαβCD4+CD8‐, citocinas y factores de transcripción que promueven su diferenciación y citocinas que producen y secretan para llevar a cabo su función.2–4,45,60,61,63–66 Subtipo Citocinas que promueven su diferenciación Factores de Producción Función transcripción Th1 IL‐12, IL‐18, IFNγ Tbet IL‐2, IFNγ Promover la inmunidad celular contra patógenos intracelulares Th9 IL‐4, TGFβ IRF4, Smad2/3/4, ¿PUI.1? IL‐9, IL‐10 Promover el reclutamiento de mastocitos y mediador de inmunidad frente a helmintos Th1/Th17 IL‐1β, IL‐12, IL‐23 Tbet, RORγt IL‐17, IFNγ IL‐13, IL‐22, FGF, Definida por su papel patogénico en inducir inflamación crónica en enfermedades autoinmunes Promover la proliferación de queratinocitos Th22 IL‐6, IL‐23, TNFα AHR, FOXO4 TNFα e inhibir su diferenciación. Regular respuestas inmunológicas en la piel TFH IL‐6, IL‐12, IL‐21 Bcl6 IL‐4, IL‐10, IL‐21 Activación y diferenciación de las células B y formación de los centros germinales Abreviaturas (orden alfabético): FGF, factor de crecimiento fibroblástico; IFNγ, interferón γ; IL, interleucina; TFH, LT colaborador folicular; TGF‐β, factor de crecimiento transformante β; Th, LT colaborador; TNFα, factor de necrosis tumoral α; Treg, LT regulador. IL‐33 25 como varios aspectos de la hipersensibilidad y las respuestas extracelulares IL‐23, TGFβ IL‐6, IL‐9, IL‐17A, IL‐ 17F, IL‐21, IL‐ inducir y activar respuestas inflamatorias 22, TNFα Suprimir la activación, proliferación y células inmunitarias Introducción 1 ׀. Linfocitos T 27 Introducción 1 ׀. Linfocitos T 1.2.1.2. LTαβ citotóxicos Los LTαβCD4‐CD8+, aunque menos frecuentes que los LTαβCD4+CD8‐, representan una fracción numerosa de los LT circulantes. Su función es eliminar células que albergan patógenos intracelulares (incluidos virus) y células transformadas (p. ej., células tumorales), a través de un mecanismo dependiente fundamentalmente del contacto directo con la célula diana, tras la generación de la sinapsis inmunológica.2,3 Los linfocitos LTαβCD4‐CD8+ naïve activados tras la interacción con un péptido ensamblado en molécula HLA‐I, proliferan y se diferencian en LT citotóxicos (también denominados linfocitos grandes granulares –LGG–, por sus características morfológicas típicas cuando se visualizan al microscopio óptico, aunque esta morfología es común para otros tipos de células con funciones citotóxicas; Figura 5). También los LTαβCD4+CD8+ y los LTαβCD4‐ CD8‐/+d y algunos LTαβCD4+ (generalmente LTαβCD4+CD8+d) se diferencian a células efectoras citotóxicas.67 Este proceso citotóxico está mediado por la rápida movilización de los gránulos del LGG hacia la zona donde se ha creado la sinapsis inmunológica, seguida de una fusión de la membrana del LGG con la membrana de la célula diana y la liberación del contenido de los gránulos a la sinapsis, incluidas perforina y diversas granzimas (citolisinas). La perforina polimeriza y perfora la membrana de la célula reconocida como extraña creando poros que actúan como canales, permitiendo la entrada de líquido extracelular (Figura 6A‐I) y facilitando el paso de las granzimas al citosol y al núcleo de la célula diana (Figura 6A‐II). Un mecanismo alternativo de entrada de las citolisinas en las células diana sería mediante endocitosis, donde las granzimas escaparían de las vesículas endocitóticas con ayuda de los poros creados por la perforina (Figura 6A‐III). La entrada de líquido extracelular genera un desequilibrio osmótico que puede llevar a la lisis celular, mientras que las granzimas pueden inducir su acción proteolítica mediante la activación de la vía intrínseca o mitocondrial (disfunción mitocondrial), 28 citotóxico en el que se aprecia la morfología un microscopio óptico) Introducción 1 ׀. Linfocitos T mediante la vía extrínseca de activación de las caspasas o por apoptosis independiente de caspasas (Figura 6).2,3,59,68 Una vía proapoptótica paralela sería mediante la activación del TCR en la sinapsis inmunológica, que induce la expresión de ligandos miembros de la familia de TNF (TNF, FasL –CD178– o TRAIL) en los LGG que, a su vez, activa a las proteínas de membrana de la superfamilia del receptor de TNF (receptores TNF‐1 o ‐2, Fas – CD95– y receptores TRAIL, respectivamente) en la membrana de la célula diana, desencadenando la apoptosis mediante la vía extrínseca de activación de las caspasas (Figura 6B).2,3,59Figura 6. Representación esquemática del proceso citotóxico mediado por un LGG. A) Citotoxicidad mediada por gránulos líticos (granzima y perforina). B) Citotoxicidad mediada por ligandos miembros de la familia de TNF (FasL o TRAIL). Figura adaptada de Prager et al 2019.69 Finalmente, cabe mencionar que los LTαβCD4‐CD8+ también tienen la capacidad de producir citocinas (mayoritariamente de patrón Th1), que actúan sobre células diana situadas a cierta distancia de las células con las que establecen contacto directo, con la finalidad de amplificar respuestas inmunológicas de tipo “celular” (frente a microorganismos intracelulares o células transformadas).70 29 Introducción 1 ׀. Linfocitos T 1.2.1.3. LTγδ Los LTγδ (CD4‐CD8‐/+d) representan del 1 al 10% de los linfocitos circulantes en la SP humana de adultos, están muy localizados en tejidos no linfoides y constituyen la mayoría de las células inmunes en algunas superficies epiteliales (p. ej., intestino).47,71 Parecen estar en la interfaz entre la inmunidad innata y adaptativa al ser células que generan respuestas efectoras rápidas sin necesidad de receptores antigénicos altamente específicos, siendo de este modo, la primera línea de defensa como células linfoides más “innatas” dentro de los LT.53 Los LTγδ participan en la regulación y vigilancia inmunológica; pueden reconocer numerosos microorganismos y células infectadas o transformadas y ejercer una actividad citotóxica directa (se incluyen también por tanto dentro del compartimento de LGG), que involucra vías secretoras y no secretoras (es decir, la liberación de granzimas y perforinas y la participación de receptores de ligandos inductores de apoptosis relacionados con Fas y TNF, respectivamente; Figura 6).2,3,47 Además, estos LT participan en el mantenimiento de las barreras epiteliales protegiendo los epitelios de entrada de todos los sistemas del organismo (digestivo, respiratorio y genitourinario), pudiendo propiciar la curación de los tejidos dañados.47 De forma similar a los LTαβ, los LTγδ pueden diferenciarse a células con diversos perfiles efectores y producir diferentes quimiocinas y una amplia gama de citocinas (como IFN‐γ, TNF‐α, IL‐17, IL‐21 e IL‐22) que orquestan el curso de las respuestas inmunitarias.47,72 1.3. Características inmunofenotípicas de los LT circulantes en SP Como ya se ha comentado en apartados anteriores, existen distintas subpoblaciones de LT (LTαβCD4+CD8‐, LTαβCD4‐CD8+, LTαβCD4+CD8+, LTαβCD4‐CD8‐/+d y LTγδCD4‐CD8‐/+d), cada una de las cuales puede encontrarse en SP en distintos estados funcionales y madurativos, que pueden identificarse mediante citometría de flujo, gracias a que conocemos el perfil de expresión de proteínas típico de cada una de esas fases madurativas y/o funcionales, en cada tipo celular. Los LT naïve son células T maduras que todavía no han entrado en contacto con el antígeno tras abandonar el timo y expresan en su membrana las moléculas coestimuladoras CD27 y CD28, la isoforma CD45RA del antígeno panleucocitario CD45, el receptor de quimiocinas CD197 (que dirige su migración hacia los 30 Introducción 1 ׀. Linfocitos T OLS) y la selectina leucocitaria (CD62L), en ausencia de CD45RO (Tabla 2). El encuentro con el antígeno provoca que los LT naïve generen múltiples subpoblaciones de LT maduros que pasan por distintas etapas caracterizadas por la expresión de sus moléculas de superficie y perfiles de expresión génica.73 Esos distintos estadios de maduración son: memoria central, memoria transicional, memoria efectora, célula efectora temprana y célula efectora terminal (en orden de menos a más maduro; Tabla 2). Tras el contacto con el antígeno, la expresión de CD45RA es reemplazada por CD45RO, generándose células que se encuentran recirculando entre la SP y los OLS (LT de memoria central que retienen CD27 y CD197) y células que migran a lugares más periféricos (LT de memoria transicional y efectora que pierden la expresión de CD197, y CD27 y CD197, respectivamente, dependiendo de la afinidad de interacción del Ag; Tabla 2). Por último, los LT maduros se diferencian a células efectoras (tempranas o terminales) asociados a la sustitución de la isoforma CD45RO por CD45RA, que vuelve a expresarse de nuevo (Tabla 2).4,61,63,73–79 Tabla 2. Fenotipo de los distintos estadios de maduración de un LT maduro. 4,61,63,73–79 Estadio de maduración CD27 CD28 CD45RA CD45RO CD62L CD197 Abreviatura: Het, expresión heterogénea. Además de estos cambios en la expresión de moléculas de membrana asociados a la maduración de las células T, los LT normales de SP pueden presentar variación en la expresión de otros marcadores en sus distintas etapas de maduración/diferenciación, al igual que en función de su estado de activación: i) marcadores pan‐T, que aunque están presentes en prácticamente todos los LT circulantes en sangre, su patrón de expresión es ligeramente diferente en cada tipo celular y sobre todo en cada estadio madurativo/funcional (p. ej., CD2, CD3, CD5 y CD7); ii) moléculas coestimuladoras y coinhibidoras (p. ej., CD26 y CD28, o CD152 y CD279, respectivamente); iii) marcadores asociados a la activación (p. ej., CD25 –también expresado constitutivamente por LTreg–, CD38, CD69, CD71, CD134, 31 (=CCR7) Naïve + + + ‐ + + Memoria central + + ‐ + + + Memoria transicional + + ‐ + ‐ ‐ Memoria efectora ‐ ‐/+ ‐ + Het ‐ Efector temprano + ‐ ‐/+ ‐/+ Het ‐ Efector terminal ‐ ‐ + ‐ Het ‐ Introducción 1 ׀. Linfocitos T CD137, HLADR o Ki67);80 iv) receptores de IL‐2 distintos de CD25 (como CD122) y otros receptores de citocinas (p. ej., CD127 –cadena alfa del receptor de la IL‐7–); v) receptores de quimiocinas (además de CD197, como CD183, CD185, CD194, CD195, CD196 o CCR10, entre otros, cuya expresión define subpoblaciones funcionales Th dentro de los LTαβCD4);61 vi) moléculas citotóxicas expresadas en LGG de línea T (CD11c, CD16, CD56, CD57 y diferentes citolisinas intracitoplasmáticas como perforina, diversas granzimas, granulolisina y TIA‐1); vii) receptores “killer” de la familia de las Ig (p. ej., los KIR CD158a/b/e/j/k/e1) y de tipo lectina (p. ej., CD94 y receptores CD161), expresados en subpoblaciones de LT citotóxicos; y viii) receptores de regulación e inmunosenescencia (p. ej., CD223 –LAG3–, CD272 –BTLA–, CD279 –PD‐1–, CD366 –TIM3– KLRG1 o TIGIT).56,78 La expresión de muchos de estos marcadores se solapa significativamente entre sí, pero se pueden distinguir perfiles o patrones fenotípicos generales dentro de la heterogeneidad de la población normal de LT (Figura 7). A modo de ejemplo, un LT naïve parte de una expresión positiva de moléculas coestimuladoras (como CD26, CD27 y CD28) y marcadores pan‐T (CD2+CD3++CD7++), en ausencia de marcadores asociados a activación y moléculas citotóxicas. A medida que este LT madura (tras el contacto antigénico), disminuye la intensidad de expresión en la membrana de marcadores como CD7, CD26 y CD28 (asociado en general a un disminución menos acusada en los niveles de expresión de CD3 y CD5), y aumenta la intensidad de expresión de CD2 (CD2++), empiezan a expresarse marcadores de activación de manera secuencial y moléculas citotóxicas (esto último en el caso de poblaciones de LT citotóxicas), y en casos de activación más prolongada, finalmente se expresan moléculas asociadas a inmunosenescencia.25,56,85– 87,58,63,78,79,81–84 Cuando se produce una infección por un patógeno, las características fenotípicas y funcionales de los LT y sus vías de diferenciación son diferentes en función de la naturaleza y tipo de patógeno. En la figura 7 se muestra la distribución fenotípica habitual de los LT específicos de ciertos virus, después de su eliminación (p. ej., gripe) o en etapas de infección latente (p. ej., para el virus de la hepatitis C – VHC–, virus de Epstein‐Barr –VEB–, virusde la inmunodeficiencia humana –VIH– y citomegalovirus – CMV–).78 En cambio, ante una infección viral aguda, se produce una expansión masiva de LT con Introducción 1 ׀. Linfocitos T 32 Introducción 1 ׀. Linfocitos T fenotipo activado en un estadio no concreto de maduración, pasando de una célula naïve a una célula efectora (inicialmente efectora temprana), que dará lugar directamente a un LT efector terminal (CD2++CD7+dCD16‐ CD28‐/+dCD38++CD45RA‐/+dCD45RO++CD56‐CD57‐CD62L‐HLADR++).81 Figura 7. Asociaciones fenotípicas dentro de cada estadio de maduración de LT y su distribución de acuerdo con la especificidad de cada virus. Abreviaturas (orden alfabético): CMV, citomegalovirus; ET, célula efectora terminal; ETemp, célula efectora temprana; MC, memoria central; MT, memoria transicional; VEB, virus de Epstein‐Barr; VHC, virus de la hepatitis C; VIH, virus de la inmunodeficiencia humana. Figura adaptada de Appay et al 2008.78 33 Introducción 2 ׀. Células NK 2. Células NK Las células asesinas naturales o células NK (del inglés, natural killer) son una subpoblación de células clasificadas actualmente dentro del compartimento de las llamadas células linfoides innatas (ILC, del inglés Innate Lymphoid Cells), que representan alrededor del 10‐15% del total de los linfocitos circulantes en SP.88,89 Son células asesinas naturales, como su propio nombre indica, que contribuyen a la primera línea de defensa contra la infección por virus y la transformación celular (tumoral), y también están implicadas en el control de la respuesta inflamatoria a través de sus funciones efectoras de lisis directa de células diana y secreción de citocinas (citotoxicidad natural).88,90,91 Aunque tradicionalmente las células NK se clasifican como un componente del sistema inmunológico innato, también muestran ciertas características del sistema inmune adaptativo, como la propiedad de expansión de células “específicas” de patógenos, la generación de células de “memoria” de larga duración capaces de persistir en el encuentro con el Ag, y la posibilidad de inducir un aumento de la respuesta secundaria de recuerdo a la hora de volver a hacer frente al patógeno, como se expondrá en apartados siguientes de esta sección.88,89,92 2.1. Ontogenia de las células NK Las células NK se generan a partir de un progenitor en la MO, que finalmente da lugar a las células más diferenciadas de línea NK en la misma MO o, de acuerdo con las teorías más recientes, en los tejidos linfoides secundarios (TLS), tras lo cual se diseminan por los tejidos tanto linfoides como no linfoides (p. ej., piel, intestino y pulmones), donde se activan para realizar sus funciones efectoras.89,90,93–95 Se ha descrito que una pequeña parte de estas células generan “memoria” específica, produciendo una mayor respuesta efectora ante la exposición al mismo patógeno viral.96– 98 En conjunto, todos estos procesos integran la maduración de las células NK, formada por 2 fases sucesivas que tienen lugar en la MO y en tejidos tanto linfoides como no linfoides: i) desarrollo y diferenciación; y ii) activación y proliferación. 34 Introducción 2 ׀. Células NK 2.1.1. Desarrollo y diferenciación Aunque el desarrollo de las células NK pueda efectuarse en diferentes partes del organismo, los progenitores de las células NK proceden de la MO, donde se genera un PLC a partir de una CMT, que puede dar lugar a los LT, LB y células NK.89,90,92–95 Este proceso requiere de interacciones celulares directas con las células del estroma, en presencia de un micro‐medioambiente adecuado caracterizado por la presencia de SCF (factor de célula stem), el ligando de FLT3, e IL‐7.99 Además, la adquisición del receptor de IL‐15 (CD122) marca la decisión irreversible del destino de los PLCs hacia el linaje NK, dando lugar a un progenitor NK (PNK).88,90,92,100–102 Se han descrito 5 etapas en la ontogenia de las células NK en función de la expresión diferencial de marcadores de superficie específicos del linaje, como pueden ser CD34, CD56, CD94, CD117 y CD161 entre otros (Figura 8).88,90,94,98,101–103 Este proceso tendría lugar en la propia MO en sus etapas iniciales, pero en fases más avanzadas de la ontogenia, la maduración a partir de precursores hematopoyéticos se produciría en los TLS (como en los ganglios linfáticos y en el tejido MALT), e incluso en órganos no linfoides, como el hígado o el útero.98 La aparición de CD56 marca la transición final de células NK inmaduras (NKi) a células NK maduras (NKm). La hipótesis más aceptada actualmente es que las células NKm evolucionan a una población CD56++ (que equivale aproximadamente al 5% de las células NK presentes en SP, pero representan la mayoría de las células NK en los OLS) que mayoritariamente se acaba diferenciando en una población CD56+d (>90% en SP). No obstante, también se ha postulado la teoría de que las células NKm pueden dar lugar directamente a una población de células CD56+d, y que habría dos vías madurativas paralelas, aunque aún no se ha confirmado esta hipótesis (Figura 8).88,90,100 A medida que avanza el desarrollo a lo largo de este proceso continuo, las células adquieren la capacidad de secretar citocinas (p. ej., IFN‐γ), muestran citotoxicidad natural y pierden la capacidad de diferenciarse en otras células (células dendríticas, LT o ambas).88 35 Introducción 2 ׀. Células NK Figura 8. Representación esquemática del proceso de diferenciación de la célula NK en humanos. En la figura se puede observar el proceso de diferenciación de una célula NK a partir de una célula PLC procedente de la médula ósea, dando lugar a células NK CD56++, que a su vez originan las células NK CD56+d, aunque también se sugiere que esta última población pueda ser generada directamente de la célula NK madura. Abreviaturas (orden alfabético): CMT, célula madre hematopoyética totipotente; KIR, receptores de tipo inmunoglobulina asesinos (abreviado del inglés killer Immunoglobulin‐like receptor); MO, médula ósea; NKi, célula NK inmadura; NKm, célula NK madura; PLC, precursor linfoide común; PNK, progenitor NK; TLS, tejido linfoide secundario. Finalmente, las células NK experimentan un proceso de homeostasis y autotolerancia, permaneciendo en un estado de reposo debido a la participación de receptores de células NK (RNK) inhibidores expresados en la superficie celular (véase más adelante).89,98 1.3.1.1. Receptores de reconocimiento de las células NK Las células NK, a diferencia de los LB y LT, no experimentan reordenamiento génico somático y por tanto, no expresan receptores de reconocimiento de antígenos único; sin embargo, a través de la expresión de un repertorio complejo de moléculas/receptores de superficie durante su desarrollo, codificados (no reordenados) en la línea germinal, las células NK pueden generar “especificidad” y diversidad en sus receptores.88,89,92 Los RNK pueden ser activadores o inhibidores (Figura 9) y sus diferentes combinaciones permiten la formación de receptores específicos de ligandos de células NK; en otras palabras, la unión del receptor a su ligando expresado en una célula diana activa o suprime una respuesta funcional de la célula NK.88,89 Dichos receptores se dividen en tres categorías generales (Tabla 3): i) receptores asesinos de tipo Ig (KIR) o receptores tipo Ig, ii) receptores con dominios de tipo lectina, y iii) receptores inhibidores de leucocitos.88,92,103–107 Introducción 2 ׀. Células NK 36 Introducción 2 ׀. Células NK Figura 9. Receptores de membrana de las células NK. En la figura se pueden observar distintos receptores de células NK: activadores (en verde) inhibidores (en naranja), de citocinas (en violeta) y receptores que pueden ser tanto activadores como inhibidores (en amarillo). Abreviaturas (orden alfabético): KIR, receptor
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