El laboratorio de microbiología importancia del diagnóstico microbiológico en odontología

Biología

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SIN SIGLA

Yovanny Gutiérrez

26/3/2024

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Biología

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EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA: IMPORTANCIA
DEL DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO EN
ODONTOLOGÍA

Dra. María Alejandra Bojanich
Especialista en Microbiología

Contenido
PARTE I .................................................................................................................................................. 3
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................... 4
A.DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO ........................................................................................................ 5
1. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA ........................................................................................................... 5
2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA ............................................................................................................ 6
3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: IDENTIFICACIÓN BACTERIANA .................................................. 8
 MÉTODOS FENOTÍPICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA ......................................................... 9
 MÉTODOS GENOTÍPICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA ....................................................... 21
 MÉTODOS PROTEÓMICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA .................................................... 22
B. DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO ............................................................................................................. 23
1. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA ......................................................................................................... 23
2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA .......................................................................................................... 24
3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: IDENTIFICACIÓN VIROLÓGICA ................................................ 24
C. DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO ............................................................................................................ 28
1-RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA .......................................................................................................... 28
2-TRANSPORTE DE LA MUESTRA ........................................................................................................... 29
3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: IDENTIFICACIÓN MICOLÓGICA ............................................... 29
D. DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO ..................................................................................................... 33
1- RECOLECCIÓN y TRANSPORTE DE LA MUESTRA ............................................................................... 33
2-PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: IDENTIFICACIÓN PARASITOLÓGICA ......................................... 33
PARTE II ............................................................................................................................................... 35
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE............................................................................... 36
ESTREPTOCOCOS ORALES .................................................................................................................... 36
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS PERIODONTOPATÓGENAS .................. 38
CANDIDIASIS OROFARÍNGEA ............................................................................................................... 41
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE CÁNDIDA ORAL ..................................................... 41
DETECCIÓN ORAL DEL VIRUS HPV ........................................................................................................ 43
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................... 45

PARTE I

EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA:
DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO

INTRODUCCIÓN

El diagnóstico microbiológico es un conjunto de procedimientos y técnicas
complementarias empleadas para establecer la etiología del agente responsable de una
enfermedad infecciosa.
En los últimos años se le ha dado especial atención al rol que cumple el Laboratorio
de Microbiología en el diagnóstico de los microorganismos de la cavidad bucal. El
objetivo del laboratorio de microbiología es proporcionar al profesional odontólogo
información sobre la presencia o ausencia de microorganismos patógenos o
potencialmente patógenos y conocer la etiología microbiana de un proceso patológico
infeccioso para que, en caso de ser necesario, seleccionar el antimicrobiano adecuado y
determinar la eficacia del tratamiento realizado.
El diagnóstico microbiológico es un trabajo en equipo entre el odontólogo, que
establece su diagnóstico presuntivo diferencial sobre la base del cuadro clínico y
radiográfico, y el especialista en microbiología, que dependiendo del diagnóstico
presuntivo, debe indicar como tomar y transportar la muestra clínica, así como también,
orientar la metodología específica en el diagnóstico a seguir.

El laboratorio de microbiología es un lugar físico habilitado para manejar y estudiar
microorganismos. El trabajo debe realizarse de acuerdo con los estándares técnicos y de
seguridad propios de un laboratorio de Microbiología Clínica.
Es importante recordar que la finalidad es determinar los microorganismos presentes
en la muestra a estudiar. Es preciso extremar las precauciones para evitar
contaminaciones que den lugar a resultados erróneos.
Todas las muestras deben ser manejadas con precaución por su potencial de
patogenicidad.
Los pasos a seguir para llegar al diagnóstico de una enfermedad infecciosa son:
1. Recolección de la muestra
2. Transporte de la muestra
3. Procesamiento de la muestra

A.DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

El diagnóstico bacteriológico puede definirse como el conjunto de procedimientos y
técnicas complementarias empleadas para establecer la etiología del agente
responsable de una enfermedad infecciosa.

1. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

La muestra clínica representa una porción o cantidad de material biológico que es
sometida a pruebas para determinar la presencia o ausencia de microorganismos
específicos, patógenos o potencialmente patógenos en los diferentes sitios de la boca.
Este es un paso muy importante deben tenerse en cuenta los siguientes requisitos:
 Debe ser seleccionada del área afectada, con el fin de aislar e identificar los
agentes etiológicos del proceso infeccioso.
 Se debe obtener una cantidad adecuada, para realizar las diferentes pruebas
diagnósticas.
 Es importante evitar arrastrar flora microbiana que habita normalmente en piel
y mucosas.
 Debe ser tomada antes de administrar antimicrobianos al paciente.
 Debe realizarse en condiciones de máxima asepsia, evitando contaminaciones
ambientales, del profesional y del propio enfermo.
 No debe estar en contacto con sustancias desinfectantes.

La toma de muestra (Figura 1: A, B, C).se debe realizar utilizando instrumental estéril,
que pueden ser
A-Hisopos estériles para la toma de muestra de la mucosa oral.
B- Puntas de papel absorbentes para la toma de muestra de lugares como el surco
gingival o la bolsa periodontal.
C- Citobrush estéril para muestras de mucosa.

Las muestras de zonas purulentas se pueden obtener mediante punción con jeringa
y aguja, intentando obtener la máxima cantidad de muestra posible.
También se pueden tomar muestras de saliva que son de importancia para
determinaciones microbiológicas, bioquímicas o moleculares.
Después de realizar la toma de la muestra, esta debe ser rotulada con el nombre del
paciente, número de historia clínica, fecha y origen de la misma. Esta información debe
corresponder con los datos de la orden de solicitud del estudio microbiológico.Una vez obtenida correctamente la muestra debe ser enviada inmediatamente al
laboratorio, pues existen factores que pueden modificar la composición inicial de la
misma, tales como: temperatura, humedad y algunas sustancias que producen los
microorganismos que pueden inhibir el crecimiento de otros.
Si se sospecha de la existencia de microorganismos aerobios o anaerobios en el
proceso infeccioso, las muestras pueden ser transportadas al laboratorio a través de
procedimientos especiales. Sobre este punto es importante recordar que la mayor parte
6

de los microorganismos asociados a las enfermedades de la cavidad bucal son
anaerobios facultativos o anaerobios estrictos, esta premisa deberá tenerse en cuenta
a la hora de efectuar el transporte de muestras al laboratorio, ya que deben tomarse en
cuenta ciertas precauciones, como por ejemplo, el uso de medios de transporte
especiales que permitan la viabilidad de los microorganismos hasta ser sembrados en
los medios de cultivo selectivos.
Toda la información diagnóstica que el laboratorio de microbiología puede
proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida. Por ello, una toma mal
realizada, pobremente recogida o mal transportada determinará un posible fallo en la
recuperación de los agentes patógenos, que puede inducir a errores diagnósticos, e
incluso a un tratamiento inadecuado del enfermo.

A B C
Figura 1: recolección de muestras microbiológicas de diferentes zonas de la boca. A.: con hisopo estéril;
B: punta de papel estéril; C: citobrush.

2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA

La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio, pues existen factores
que pueden modificar la composición inicial de la misma, tales como: temperatura,
humedad y algunas sustancias que producen los microorganismos que pueden inhibir el
crecimiento de otros.
Para realizar esta acción se requiere de diferentes medios de transporte que deben
ser utilizados desde el momento de la extracción de la muestra hasta su posterior
estudio. Aseguran la viabilidad de las bacterias, sin multiplicación significativa de los
microorganismos evitando también la posible la desecación de la muestra, lo que
favorece la destrucción bacteriana. Se recomienda un límite de 2 horas desde la
recolección de las muestras y su estudio en el laboratorio.
Existen medios de transporte que no son nutritivos, sino que preservan las bacterias
existentes, sobre todo si son escasas, a la vez que impiden el crecimiento exagerado de
otra flora bacteriana no deseada.
Los medios de transporte más frecuentemente utilizados son los de Stuart, Cary –
Blair y Amies

 Medio de STUART
Permite la conservación y el transporte e un gran número de microorganismos
patógenos, como Neisseria gonorrhoeae, Heamophilus influenzae, Corynebacterium
diphteriae, Streptococcus spp., Salmonella sp., Shigellas sp., etc.
7

Se trata de un medio muy reducido debido a la presencia de tioglicolato que dificulta
las reacciones enzimáticas de autolisado. A su vez, la ausencia de una fuente de
nitrógeno evita la proliferación de la flora acompañante (Figura 2.A).

 Medio Cary-Blair
Es semisólido debido a la baja concentración de agar. Tiene un mínimo aporte de
nutrientes que permite la recuperación de los microorganismos sin que haya replicación.
El tioglicolato de sodio se incluye para proveer un bajo potencial redox; y el pH
relativamente alto minimiza la destrucción bacteriana por acidificación (Figura 2.B).

 Medio de AMIES
Es una modificación del medio de Cary Blair. Básicamente, cambia el glicerofosfato
por un fosfato inorgánico y el azul de metileno por carbón vegetal neutro farmacéutico.
Además, añade iones calcio y magnesio, que ayudan a conservar la permeabilidad de la
célula bacteriana.
Permite la supervivencia de organismos incluso hasta 48 horas. Es un medio apto para
la conservación de una gran parte de patógenos como Neisseria sp., Haemophilus sp.,
Corynebacterium sp., Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans, Streptococcus
pneumoniae, Enterobacterias, etc. (Figura 2, C).

Algunos microorganismos pueden resistir en el medio durante tres o más días, sin
embargo, es conveniente que la muestra llegue al laboratorio antes de las 24 horas.

A B C
Figura 2: diferentes medios de transporte de muestras microbiológicas. A: Medio de STUART; B:Medio
Cary-Blair; C: Medio de AMIES.

 Medio de Transporte para Bacterias Anaeróbicas
La mayoría de los aislamientos de muestras seleccionadas y recolectadas en el
ambiente bucal corresponden a la categoría de anaerobios facultativos y obligados
estrictos.
Los microorganismos anaerobios facultativos son más tolerantes a los efectos tóxicos
de oxígeno que los anaerobios obligados estrictos.
Los factores limitantes fundamentales que pueden afectar el crecimiento de los
anaerobios estrictos son: el efecto inhibitorio de oxígeno atmosférico y sus derivados
tóxicos; y el potencial de óxido-reducción de los medios de cultivo. Los anaerobios
obligados estrictos mueren cuando se exponen al oxígeno atmosférico durante 10
minutos o más. Las razones por la que los anaerobios varían su tolerancia al oxígeno
depende de su producción de enzimas como la superóxido dismutasa, la catalasa y la
8

peroxidasa, que son protectoras contra los productos tóxicos de la reducción del
oxígeno.
Las condiciones oxidantes que prevalecen en el tejido humano sano que está bien
oxigenado y tiene un suministro de sangre continua son menores comparados con un
medioambiente humano anaerobio como son los abscesos, o un tejido necrótico y el
intestino grueso humano. Esto facilita el desarrollo de los anaerobios ya sean
comensales o patógenos.
Lo anterior implica que para obtener un buen diagnóstico de una muestra en que se
sospecha la presencia de anaerobios obligados, ya sean moderados o estrictos, las
condiciones en que se transporta la muestra es de primordial importancia.
Los medios de transporte más utilizados para bacterias anaeróbicas o facultativas
son: fluido de transporte reducido (FTR) que permite conservar la anaerobiosis de las
muestras y el AnaeroLin: compuesto por un frasco –ampolla con tapón de goma y sello
de aluminio que contiene un medio líquido especial para recolección y desarrollo de
anaerobios. Al cual se le han agregado sustancias reductoras como son el tioglicolato y
la L –cistina que aseguran la reducción del medio (Figura 3).

Figura 3: medio Anaerolin con jeringa estéril para recolección de muestras microbiológicas anaeróbicas.

Una vez llegada la muestra al laboratorio, se procede a realizar la identificación del o
los microorganismos.

3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Una de la tareas fundamentales del laboratorio de microbiología es la aplicación de
una metodología precisa que permita la identificación de los microorganismos
implicados en procesos clínicos asociados a infecciones o de aquellos que tienen relación
con el ambiente bucal o el ser humano.
Con el objetivo de identificar el agente etiológico responsable del proceso infeccioso
y para conocer las implicaciones patogénicas/patológicas, la evolución clínica y aplicar
una terapia antimicrobiana eficaz, un pilar fundamental en la práctica de la
microbiología clínica lo constituye la asignación de especie a un aislamiento microbiano.
Se presentan tres maneras diferentes de abordar la identificación bacteriana:
a) métodos fenotípicos o tradicionales
b) métodos genotípicos o moleculares
c) métodos basados en la proteómica
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Aunque no son los únicos, son los más importantes y los que mayor impacto tienen
en el trabajo diario del microbiólogo.
Las técnicas fenotípicas son métodos que se realizande manera rutinaria aunque
muestran algunas limitaciones que se observan de manera específica y más evidente
para algún tipo de microorganismos.
Los métodos genotípicos o moleculares permiten soslayar algunas de estas
limitaciones, si bien su implementación no es universal en todos los laboratorios. Este
hecho se debe al costo elevado y al grado de especialización del personal que se requiere
para su aplicación.
La identificación molecular no es siempre accesible de forma inmediata y
generalmente se utiliza conjuntamente con la identificación tradicional.
Los métodos basados en la proteómica han irrumpido, últimamente, de manera
importante en el campo del diagnóstico microbiológico.
Dicha ciencia estudia al conjunto entero de proteínas expresadas en una célula.

 MÉTODOS FENOTÍPICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

La identificación fenotípica bacteriana se basa en las características observables de
las bacterias, como su morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas.
El cultivo, cuando es factible, continúa siendo el método diagnóstico de elección;
permite el aislamiento del microorganismo implicado, su identificación, el estudio de
sensibilidad a los antimicrobianos y la aplicación de marcadores epidemiológicos.
En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las
condiciones de incubación.
La elección de las diferentes pruebas bioquímicas está en función de la fiabilidad de
las mismas, del género o de la especie bacteriana que se pretende identificar y del origen
del aislado bacteriano.
En el proceso de identificación bacteriana tradicional se establecen tres niveles de
procesamiento:
a) Pruebas primarias, como la de morfología a través de la tinción de Gram u otras
tinciones, crecimiento en diferentes atmósferas de incubación, crecimiento en varios
tipos de medios de cultivo. Utilizando estas pocas pruebas generalmente es posible
situar a las bacterias, en uno de los principales grupos de importancia médica-
odontológica.
b) El segundo nivel de identificación debe especificar el género al que pertenece el
microorganismo. Tanto en este nivel como en el anterior, la hipótesis sobre la probable
identidad de un microorganismo se apoya en las características del cultivo (por ejemplo
atmósfera) y en pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo
de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento.
Las pruebas primarias son: tinción de Gram, morfología, catalasa, oxidasa, oxidación-
fermentación, fermentación de glucosa, producción de esporas, crecimiento en
anaerobiosis y anaerobiosis y movilidad. Se debe tener en cuenta los datos clínicos que
aporta el odontólogo.
c) Por último, la identificación a nivel de especie. El empleo de ciertas pruebas
bioquímicas permite identificar con un alto grado de precisión la mayoría de las
bacterias clínicamente significativas. Si la identificación no pudiera hacerse usando este
10

primer esquema, puede utilizarse una batería de pruebas más amplia como las que se
encuentra en diferentes sistemas comerciales.

 Microscopio
El microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, ya que permite
la observación de microorganismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple
vista. Su uso es indispensable para el estudio de la morfología y estructura de los
microorganismos, así como, el comportamiento frente a diferentes colorantes.
Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de iluminación
utilizada, se agrupan en:
Microscopios ópticos: La fuente de iluminación es la luz.
 De campo claro. Permiten la observación de preparaciones, al natural o
contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante (Figura
4. A).
 De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan
brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas
especiales.
 De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos
especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de
las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya
que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas.
 De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una
imagen en relieve de las mismas.
 De fluorescencia. La luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en las
células o añadidas a la preparación, y que emiten fluorescencia en el espectro
visible.
Microscopios electrónicos: La fuente de iluminación es una fuente de electrones y las
lentes son electroimanes.
 De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que
son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas,
denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que
éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia según el número de
electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más
intensamente impedirán el paso de electrones y por lo tanto no permitirán la
emisión de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecerán oscuras en un
fondo más brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos.
 De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes
finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas.
Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos (Figura 4. B).
 Confocal. Permite obtener imágenes bi y tridimensionales de alta resolución. Es
un microscopio computarizado que acopla un láser. El análisis se realiza en forma
digital por ordenador.
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A B
Figura 4: A: Microscopio óptico; B: Microscopio electrónico

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LAS BACTERIAS
Como ya lo mencionamos, los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo
humano y para observarlos es esencial el microscopio óptico.
El estudio microscópico en fresco y posterior tinción revela la forma y la manera de
agruparse, la estructura de las células y su tamaño.
Los objetos a observar, deben poseer un cierto grado de contraste con su medio
circundante para poder ser percibidos a través del microscopio. Por ello es que los
microorganismos necesitan ser previamente teñidos para poder distinguirlos del medio
(tinciones simples). Las tinciones son el primer paso, y ocasionalmente el único, para la
identificación bacteriana.

* Tinciones y tipos de tinciones
La coloración o tinción es el proceso de teñir artificialmente los microorganismos con
colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscópico de forma, agrupación y
estructuras.
Se pueden usar los colorantes de varias formas:
 Para teñir bacterias y hacerlas visibles al microscopio
 Para mostrar estructuras del organismo estudiado.
 Para la identificación de microorganismos en base a sus características de
tinción, por ejemplo, si son o no alcohol-ácido resistentes, si son Gram
positivas (Gram+) o Gram negativas (Gram -).
 En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y así
poder estudiar selectivamente a los microorganismos que si crecen.

Existen diferentes tipos de tinciones:
-Tinción simple
Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve para hacer más fácilmente visibles a
las bacterias sin resaltar ninguna característica en especial. Por ejemplo: azul de
metileno, para observación de microorganismos vivos.
También se utiliza el montaje directo húmedo o examen en fresco o sin colorante. En
este caso las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos
para su observación y es fijado al calor.
-Tinción negativa.
Este método de tinción utiliza colorantes neutros o ácidos ya que tienen poca afinidad
por la célula bacteriana, por lotanto como no se absorben se colorea el fondo en el que
están las bacterias pero la célula queda incolora y transparente, así pues las bacterias
aparecen como pequeñas áreas iluminadas en un fondo oscuro. La tinción acídica con
tinta china son las más usadas.
-Tinción diferencial.
Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física como químicamente, por lo cual
su reacción ante algunos colorantes también será diferente dando lugar así a grupos
tintoreales característicos. Las más utilizadas e imprescindibles son la de Gram y la de
Ziehl- Neelsen.

 Tinción de Gram: descubierta por Hans Christian Gram en 1884.Se utiliza tanto
para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar
una primera aproximación a la diferenciación bacteriana: bacterias Gram
positivas y bacterias Gram negativas (Figura 5).
Las bacterias Gram positivas, son aquellas que se tiñen de azul oscuro o violeta y
las bacterias Gram negativas son aquellas que se tiñen de un color rosado tenue.
Esta característica química está íntimamente ligada a la estructura de la pared
celular de las bacterias, por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana.

Figura 5: tinción de Gram. Se utiliza para diferenciar y clasificar bacterias.

 Tinción de Ziehl- Neelsen: usada para la identificación de bacterias ácido-alcohol
resistente (BAAR), como Mycobacterium tuberculosis o M. marinum, entre otros.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un
https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_grampositiva
https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_grampositiva
https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_gramnegativa
https://es.wikipedia.org/wiki/Azul
https://es.wikipedia.org/wiki/Violeta_(color)
https://es.wikipedia.org/wiki/Rosado
https://es.wikipedia.org/wiki/Envoltura_celular
https://es.wikipedia.org/wiki/Envoltura_celular
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Franz_Ziehl&action=edit&redlink=1
13

bacteriólogo, y Friedrich Neelsen (1882), un patólogo. Las paredes celulares de
ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50
a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por
esto se denominan ácido-alcohol resistente (Figura 6).

Figura 6: tinción de Ziehl-Neelsen para diferenciar bacterias ácido alcohol resistente.

-Tinción estructural.
Existen diferentes tipos de colorantes, que de acuerdo a su afinidad, se utilizan para
teñir y detectar ciertas estructuras de la célula bacteriana como son las esporas, los
flagelos y las cápsulas. Para visualizar formas específicas o distintas características
morfológicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales.
Se emplea la siguiente terminología en las preparaciones teñidas:
- forma: cocos, bacilos, cocobacilos, bacilos filamentosos, bacilos curvos, etc.
- cápsula: presente o ausente
-endosporas: ovales, esféricas, terminales, subterminales
- tamaño: cortos, largos, etc.
- bordes laterales: abultados, paralelos, cóncavos, irregulares
- extremos: redondeados, puntiagudos
- disposición: parejas, cadenas, tétradas, racimos, etc.
- variación en forma y tamaño: formas irregulares, ramificadas, fusiformes, etc.

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LAS BACTERIAS
* Morfología
La morfología de las colonias es fundamental en la identificación preliminar y para la
diferenciación de los microorganismos. Para la observación morfológica es preferible
examinar colonias de cultivos frescos crecidas en medios no selectivos o de cultivos
puros compuestos por un solo tipo de microorganismo.
Las colonias de una única especie, cuando crecen en medios específicos se
caracterizan por el tamaño, la forma, la consistencia, y a veces por su color.
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Friedrich_Neelsen&action=edit&redlink=1
https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_mic%C3%B3lico
14

El tamaño de las colonias bacterianas es generalmente uniforme entre una misma
especie. Por ejemplo, las colonias de estreptococos tienen un tamaño más pequeño que
las de los estafilococos y las enterobacterias.
La forma está determinada por los bordes y el grosor de la colonia. El borde puede
ser liso o rugoso e irregular; la colonia, abultada o plana. La textura de la colonia es
también importante. Puede variar desde seca a viscosa, con superficie lisa o granular.
Algunos microorganismos producen una colonia pigmentada, lo que puede ser de
ayuda en el proceso de identificación, por ejemplo: Pseudomona aeruginosa (pigmento
verde), Serratia marcescens (pigmento rojo); en una misma especie puede haber cepas
no pigmentadas (Figura 7).

Figura 7: morfología y crecimiento de las colonias bacterianas

 Medios de cultivos
Se entiende por medio de cultivo al conjunto de nutrientes asimilables, balanceados
en su concentración que, junto a factores ambientales adecuados, permiten el
crecimiento y multiplicación de los microorganismos pretendiendo reproducir
artificialmente las condiciones de su hábitat natural.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión
de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
En los medios de cultivo las bacterias se multiplican y es necesario esperar al menos
18-24 horas para visualizarlas.
En términos generales todas las bacterias necesitan una fuente de energía, unafuente
de carbono, una fuente de nitrógeno, algunas sales, oligoelementos y agua.
Todos los medios de cultivo han de cumplir como mínimo con estos requisitos pero
en muchas ocasiones se necesitan además otras sustancias adicionales como vitaminas,
factores o aminoácidos esenciales.
Los medios de cultivo se utilizan para una amplia variedad de propósitos en el
laboratorio, tales como:
 Aislamiento y propagación de bacterias
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 Estudio de las propiedades fisiológicas, metabólicas, morfológicas, antigénicas y
patogénicas de los microorganismos que sirven, entre otras cosas, para su
identificación.
 Transporte y conservación de microorganismos.
 Estudio de la sensibilidad de los gérmenes a los antimicrobianos.
 Fabricación de antígenos para desarrollo de vacunas
 Selección de mutantes o variantes genéticas microbianas.

Con respecto a su composición los medios de cultivo pueden contener una gran
variedad de sustancias; deben incluir los elementos indispensables para satisfacer
todas las necesidades nutricionales de los microorganismos que se desea estudiar.
Los componentes más importantes son:
 Agua: constituye aproximadamente el 80-95% del medio de cultivo, permitiendo
mantener en solución o suspensión a los demás constituyentes del medio.
 Peptonas: se obtienen por hidrólisis ácida o enzimática de proteínas. La gelatina,
de carne, de soja o de albúmina constituyen una fuente fundamental de
nitrógeno, pero también de carbono y azufre.
 Extractos de carne vacuna: son concentrados de productos hidrosolubles de la
carne, aportan elementos muy ricos como xantina, glucógeno, vitaminas,
oligoelementos, etc.
 Hidratos de carbono: los medios de cultivo pueden contener cualquier clase de
mono, di y polisacáridos; se los usa como fuente de energía o para el estudio de
su capacidad fermentativa.
 Minerales: se los usa en forma de sales inorgánicas. Los más utilizados son sodio,
calcio, potasio, cloro, fósforo, azufre, hierro, cobre y magnesio.
 Factores de crecimiento: son otras sustancias que los microorganismos son
incapaces de sintetizar por sí solos, como aminoácidos, vitaminas, bases púricas
y pirimidínicas.
 Agentes selectivos: son sustancias químicas que, adicionadas al medio de cultivo,
impiden el desarrollo de un grupo de bacterias sin inhibir otros.
Ejemplos: Colorantes cristal violetaque inhibe bacterias Gram positivas; verde
brillante se usa en medios altamente selectivos para eliminar la flora
acompañante Gram positivas y Gram negativas.
 Sustancias indicadoras: sirven para detectar algunas propiedades metabólicas de
los gérmenes. Ejemplos: colorantes indicadores de pH como el azul de timol, rojo
de fenol, azul de bromo timol.
 Sustancias de enriquecimiento: son sustancias que adicionadas al medio de
cultivo permiten el desarrollo de microorganismos exigentes. Se emplea
generalmente sangre total humana.
16

 Agentes solidificantes: se le incorporan para obtener medios de cultivo sólidos o
semisólidos. El más utilizado es el agar, que es un polímero extraído de algas
rojas.
El crecimiento de las bacterias, en un medio sólido, produce un gran número a partir
de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de tiempo de incubación y en
las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia de individuos iguales:
unidades formadoras de colonias (UFC), por mililitro o gramo de medio (Figura 8).

Figura 8: crecimiento de bacterias en un medio sólido. Dentro de un cultivo de células, una colonia debe
presentar un crecimiento significativo para poder realizar el recuento de UFC de microorganismos.

Los medios de cultivo de pueden clasificar en:
 No selectivos: para cultivo de una amplia variedad de organismos. A menudo
están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV,
glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar
Sangre, Agar Chocolate).
 Selectivos: se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de
bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. (Mac Conkey,
Kanamicina, Vancomicina).
 Para Enriquecimiento: suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal
potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).
 Para Aislamiento: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen
requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación.
 Para Pruebas de Sensibilidad de Antibióticos: medios estandarizados en sus
concentraciones iónicas para ser utilizados por la técnica de difusión con discos
para determinar concentración inhibitoria mínima (CIM) de los antibióticos en
las pruebas de sensibilidad.
 Para Preservación: medios diseñados para mantener viables por largos períodos
de tiempo cepas microbianas en estado latente.
 Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las características
bioquímicas y fisiológicas específicas de las bacterias: nutrición y respiración
(Oxidación-Fermentación).
17

 Medios Cromogénicos: Formulas que se basan en las características enzimáticas
de algunas bacterias que son capaces de desdoblar un sustrato cromogénico en
un cromóforo que al quedar libre intracelular le otorga el color a la colonia . Esta
es una reacción específica enzimática (Figura 9).

Figura 9: Características morfológicas de las colonias en un medio de cultivo sólido cromogénico

CARACTERÍSTICAS METABÓLICAS DE LAS BACTERIAS
El metabolismo bacteriano se define como el conjunto de procesos por los cuales un
microorganismo obtiene la energía y los nutrientes que necesita para vivir y
reproducirse.
Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y
las especies pueden a menudo distinguirse en base a estas estrategias.
En el laboratorio de microbiología se realizan diferentes pruebas metabólicas y
bioquímicas de las bacterias para su identificación.
Se clasifican como: pruebas con lectura inmediata y pruebas con lectura lenta (18 a
48 horas).

*Pruebas con lectura inmediata
 Catalasa: La catalasa es una enzima presente en la mayoría de los
microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan la catalasa
hidrolizan el hidrogeno en agua y el oxígeno gaseoso que se libera produce
burbujas.
 Oxidasa: Sirve para determinar la presencia se enzimas oxidantes. La reacción de
la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que activa la
oxidación del citocromo el cual es reducido por el oxígeno molecular
produciendo agua o peróxido de hidrogeno según la especie Moraxella,
Helicobacter y Brucella.
 Indol: Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo
bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano
mediante la enzima triptófanosa.

* Pruebas con lectura lenta a las 18 - 48 horas
 Óxido-fermentación: mediante esta prueba se va a determinar si la utilización de
los hidratos de Carbono por parte de un microorganismo se realiza vía oxidativa
o por vía fermentativa.
 Reducción de nitratos: Sirve para determinar la capacidad de un organismo de
reducir nitratos en nitritos. Se utiliza para asignar bacterias a la familia
Enterobacteriaceae.
 Rojo de metilo: Es un indicador de pH. Actúa entre un pH 4,2 y 6,3 variando desde
rojo hasta amarillo respectivamente. Mediante esta prueba se comprueba la
capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos
terminales ácidos de la fermentación ácido-mixta. Se utiliza como parte de la
identificación a nivel especie de los bacilos entéricos Gram negativos.
 Voges-Proskauer: permite observar si el microorganismo fermenta la glucosa por
la vía butanodiólica. Se usa en la identificación de bacilos entéricos Gram
negativos.
 Agar de Hierro Kligler: mediante esta prueba se puede determinar la capacidad
de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono específico
incorporado en un medio de crecimiento básico; la producción o no producción
de gases CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de
carbono. Y la producción de ácido sulfhídrico.
 Sistemas comerciales multipruebas: existen en el mercado numerosos sistemas
o equipos multipruebas bioquímicas con el fin de conseguir una mayor rapidez
en la identificación de algunas bacterias. Estos sistemas pueden ser manuales o
estar automatizados.
 Sistemas comerciales manuales o galerías multipruebas: se trata de celdillas
aisladas con un sustrato liofilizado que se inoculan individualmente y que
permiten realizar simultáneamente entre 10 y 50 pruebas bioquímicas.
Es un método bien establecido para la identificación manual de microorganismos
a nivel de especie.
Algunos de los sistemas comerciales disponibles en el mercado son: API
(bioMérieux), Enterotube (BBL),Oxi/FermTube (BD), RapIDsystems y
MicroID(Remel), Biochemical ID systems (Microgen) (Figura 10).

Figura 10: API: kits de prueba para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas

 Sistemas comerciales automatizados: existe en el mercado galerías
multipruebas, como las descritas en el apartado anterior pero cuya inoculación,
incubación y lectura se efectúan de modo automatizado.
También existe paneles en los que además de encontrarse los sustratos para el
desarrollo de pruebas bioquímicas, se encuentran diversos antimicrobianos a
distintas concentraciones, con lo que se realiza simultáneamente la
identificación y antibiograma del microorganismo objeto de estudio. Existen
distintos paneles para distintos grupos de microorganismos.
La inoculación y la lectura de estos paneles se suele hacer de forma automática,
incorporándose los datos obtenidos en un ordenador, el cual proporciona con un
índice alto de fiabilidad, la identificación del microorganismo. Algunos de los
sistemas de paneles comerciales disponibles de uso más extendido son:
MicroScan,Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix (Figura 11).

Figura 11: El sistema VITEK® para pruebas de laboratorio que permiten una identificación
microbiana rápida y precisa.
20

 Hemólisis: algunas bacterias producen hemolisinas que causan la lisis de los
hematíes enmedios que contienen sangre. Esta hemólisis puede ser:
-Alfa: halo de color verdoso alrededor de la colonia
-Beta: zona clara alrededor de la colonia
-Gama: sin presencia de hemólisis, los microorganismos que crecen sin modificar
la apariencia del agar (Figura 12).
Figura 12: Tipos de hemólisis: Gama: sin presencia de hemólisis. Beta: zona clara alrededor de la colonia.
Alfa: halo de color verdoso alrededor de la colonia.

CARACTERÍSTICAS ANTIGÉNICAS DE LAS BACTERIAS
Un serotipo o serovar es un tipo de microorganismo infeccioso clasificado según
los antígenos que presentan en su superficie celular. Los serotipos permiten diferenciar
organismos a nivel de subespecie, algo de gran importancia en epidemiología.

* Pruebas serológicas
 ELISA: La técnica ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) es una técnica
de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante
un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable,
como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones. También existe un
anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por
un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente
mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente
mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra
 Western blot: el Western blot, inmunoblot o electro transferencia, es una técnica
analítica usada en biología celular y molecular para
identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como
la que se presenta en extractos celulares o de tejidos
 Inmunofluorescencia Directa e Indirecta: La inmunofluorescencia es una técnica
de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos químicamente a una
sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada
molécula.
https://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo
https://es.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgeno
https://es.wikipedia.org/wiki/ELISA
https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunoensayo
https://es.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgeno
https://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpo
https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima
https://es.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgeno
https://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometr%C3%ADa
https://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot
https://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa_celular
https://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa_molecular
https://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna
https://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna
https://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula
https://es.wikipedia.org/wiki/Tejido_(biolog%C3%ADa)
https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunofluorescencia
https://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpo
21

 Precipitado: las reacciones de precipitación son las más simples de realizar y
visualizar, al hacer reaccionar un antígeno soluble con
un anticuerpo correspondiente. Al antígeno es multivalente, posee varias copias
del mismo determinante antigénico y puede ser de naturaleza proteica, toxinas u
otros productos de bacterias. El anticuerpo por lo general pertenece a las IgG
 Neutralización: la neutralización es una prueba que se utiliza para detectar
anticuerpos que neutralizan la toxicidad de algunas moléculas o la inefectividad
de las bacterias. Estos anticuerpos se fijan a la molécula tóxica e impiden que se
produzca el daño.
 Fijación del complemento: la prueba de fijación del complemento se usa para
demostrar la presencia o no de anticuerpos en el suero sanguíneo de un
paciente.

 MÉTODOS GENOTÍPICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Dados los problemas inherentes que presentan los sistemas de identificación
fenotípicos (no todas las cepas de una misma especie muestran características
homogéneas, una misma cepa puede generar diferentes patrones bioquímicos, entre
otros), los métodos moleculares se han establecido como procedimientos
complementarios, alternativos o incluso de referencia a los fenotípicos.
El estudio de los genes permite establecer relaciones filogenéticas entre las bacterias,
como los genes que codifican para las subunidades ribosómicas 5S, 16S, 23S.
En la taxonomía bacteriana, el análisis de la secuencia génica del ARNr 16S es la
herramienta más ampliamente utilizada.
El ARNr 16S además de ser útil para la detección de bacterias, proporciona
información rápida sobre su identificación y filogenia mediante la comparación con
bases de datos. Debido a los avances tecnológicos en las técnicas de secuenciación, se
han ido utilizando genes que permiten una mayor precisión en la identificación.
Inicialmente, la identificación bacteriana basada en el análisis de las secuencias se
hallaba limitada a determinados centros o laboratorios, en la actualidad y como
consecuencia de la automatización y simplificación del proceso, estas técnicas se han
introducido en un mayor número de laboratorios.

* Pruebas con técnicas moleculares
Con el nombre de Diagnóstico Molecular se engloba una serie de técnicas basadas en
el análisis del DNA o ácido desoxirribonucleico.
Dicho análisis puede tener dos objetivos:
a- la detección de microorganismos de forma rápida y eficaz.
b- el estudio de variaciones en los genes humanos que pueden condicionar la
aparición de enfermedades.
Estas técnicas moleculares sirven, entre otros, para estudios epidemiológicos,
determinación de algunas enterotoxinas, identificación de genes de resistencia,
identificación de especies difíciles de cultivar o no cultivables, clonación de secuencias
de genes. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es muy utilizada y
posee una sensibilidad superior a la del método microbiológico.
https://es.wikipedia.org/wiki/Precipitado#Precipitado_antig%C3%A9nico
https://es.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgeno
https://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpo
https://es.wikipedia.org/wiki/Determinante_antig%C3%A9nico
https://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna
https://es.wikipedia.org/wiki/Toxina
https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria
https://es.wikipedia.org/wiki/IgG
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Neutralizaci%C3%B3n_(inmunolog%C3%ADa)&action=edit&redlink=1
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Fijaci%C3%B3n_del_complemento&action=edit&redlink=1
22

Como ejemplos de su aplicación podemos mencionar:
 La detección de la presencia de Streptococcus mutans en saliva constituye una
alternativa para su identificación rápida y segura.
 Diferenciación de los estreptococos del grupo mutans de otros estreptococos
pertenecientes al Grupo viridans, enfocándose en los genes específicos
asociados con la virulencia de Streptococcus mutans, tales como:
glucosiltranferasas, fructosiltransferasas, dextranasas, proteína fijadora de
glucanos, antígeno proteínico
 Identificación de genes del rRNA 16S del Streptococcus mutans.
 La prueba de PCR en tiempo real es una variante de la PCR tradicional, más
rápida, y ha permitido la rápida detección y cuantificación de bacterias
cariogénicas humanas incluyendo S. mutans y Streptococcus sobrinus de
muestras orales.

 MÉTODOS PROTEÓMICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

La proteómica es el estudio y caracterización del conjunto de proteínas (proteoma)
expresadas por un genoma. Las técnicas de proteómica abordan el estudio de este
conjunto de proteínas y las más usadas se basan en la electroforesis y en la
espectrometría de masas.
Dependiendo del objetivo del estudio se pueden agrupar las técnicas de proteómica
en los siguientes grupos:
-Técnicas empleadas para analizar globalmente el proteoma y separar sus proteínas.
-Técnicas usadas para analizar individualmente las proteínas.

B. DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO

Los métodos para reconocer las infecciones por virus pueden utilizarse para
demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma
viral) o la respuesta inmune por parte del hospedador en el curso de la infección.

Los métodos de diagnóstico virológico pueden estar dirigidos a detectar:1. El virus como agente infeccioso (aislamiento e identificación viral).
2. El virus como partícula viral (microscopía electrónica).
3. La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, Southern Blot, Northen Blot).
4. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas): inmunofluorescencia
directa (IFD), ELISA, inmunohistoquímica (IHQ), inmunocitoquímica (ICQ).
5. La presencia de anticuerpos: seroneutralización, inmunodifusión en gel de agar
(IDGA), inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA.

1. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

Las mejores muestras son las que se obtienen en un estadio temprano de la
enfermedad (dentro de las primeras 72hs), cuando el virus se excreta en
concentraciones relativamente elevadas y todavía no se ha unido con anticuerpos.
Después de transcurridos 7días habitualmente no vale la pena realizar cultivos virales
cuando se trata de huéspedes inmunocompetentes. No obstante en huéspedes
inmunocomprometidos y en las infecciones virales persistentes o crónicas, el virus
puede estar presente durante períodos prolongados.
Las muestras deben obtenerse de forma aséptica. El volumen de la muestra debe ser
suficiente como para permitir la realización de los ensayos apropiados y la conservación,
por ejemplo: en caso de tener que repetir el ensayo en pruebas adicionales, como PCR.
Las muestras pueden obtenerse a partir de:
* Hisopados de: -Conjuntivales
-Genital
-Rectales
-Mucosa oral
-Lesiones cutáneas

* Sangre
* Aspirado nasofaríngeo
* Lavado bronquio alveolar
* Expectoración
* Orina
* Líquido cefalorraquídeo
* Materia fecal
* Biopsia

2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Dado la gran labilidad de los virus, estos deben ser transportados en un medio de
transporte que les provea estabilidad. Esto se obtiene agregando proteínas como puede
ser la albúmina bovina. El agregado de antibióticos y antifúngicos logra prevenir el sobre
desarrollo de la flora bacteriana y fúngica residente del huésped.
Además, las muestras deben transportarse a 4ºC (no congelarlas antes del envío), en
recipientes estériles adecuados y con tapa hermética.
Para transportar virus de alta transmisibilidad como virus de la Hepatitis B o virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH), debe colocarse el recipiente que contiene la
muestra dentro de un contenedor de preferencia metálico con tapa a rosca y rotularse
como peligro biológico. Estos contenedores se encuentran comercialmente disponibles.

3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: IDENTIFICACIÓN VIROLÓGICA

Los métodos que posibilitan la recuperación del virus viable a partir de una muestra
problema son:
A) Cultivos y líneas celulares
- Cultivos celulares: los más usados en la rutina.
-Cultivos primarios: Se obtienen a partir de células, tejidos u órganos tomados
directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.
-Líneas celulares diploides: Son aquellas líneas celulares que pueden subcultivarse
aproximadamente 50 veces y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo
correspondiente a la especie de la cual provienen.
-Líneas celulares continuas: Permiten un número infinito de subcultivos
- Huevos embrionados: usualmente utilizados para cultivar virus propios de las aves
como el Virus de la Influenza Aviar.
- Animales de laboratorio: ratón (encefalitis, herpes neonatal diseminado); conejo
(enfermedad ocular).
Luego de inocular la muestra, el cultivo celular se incuba a 37º C y se observa
diariamente para determinar la aparición de efecto citopático (ECP). Los ECP son los
cambios morfológicos en las células inoculadas producidas por la acción del virus, entre
los que podemos mencionar la lisis celular, la vacuolización, la formación de sincitios,
entre otros.
Se usan cultivos celulares no inoculados como control y comparación con cualquier
cambio morfológico observado en los cultivos inoculados.
Cuando los virus no producen ECP, se puede recurrir a técnicas que ponen en
evidencia su presencia en el cultivo. La más usada es la inmunofluorescencia directa
(IFD), aunque también puede utilizarse la hemadsorción, hemaglutinación.
- Hemadsorción: Algunos virus durante su replicación expresan en la membrana de la
célula huésped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoproteínas
capaces de unirse a receptores específicos en la membrana de glóbulos rojos de
diferentes especies animales. De modo que si se agregan glóbulos rojos a un cultivo
inoculado, se puede poner en evidencia la infección de esas células a través de la unión
de los glóbulos rojos a la superficie celular.
- Hemaglutinación: Las hemaglutininas pueden ponerse en evidencia en el
sobrenadante de los cultivos utilizando el mismo fundamento que para la
hemadsorción.
25

B) Microscopía Electrónica
Permite la visualización de las estructuras virales y la morfología y tamaño del virión,
lo que ayuda a la identificación taxonómica viral.

C) Técnicas para la detección de ácidos nucleicos
- Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR):
Es una técnica que sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad se basa en
que luego de la amplificación resulta mucho más fácil identificar el genoma viral.
Habitualmente, los resultados de una reacción de PCR se visualizan al usar
electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel es una técnica en la que una
corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz de gel y los
fragmentos de ADN se separan según su tamaño. Típicamente se incluye un estándar, o
marcador de peso molecular, para que pueda determinarse el tamaño de los fragmentos
en la muestra de PCR. Los fragmentos de ADN de la misma longitud forman una "banda"
en el gel que se puede identificar a simple vista si el gel se tiñe con sustancias que se
unan al ADN.
-Southern Blot, Northen Blot y Western Blot:
Las técnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar ADN
y ARN, respectivamente.
La técnica de Southern fue desarrollada por Edwin Southern para separar ADN y por
analogía la separación de ARN se denominó Northern y la transferencia de proteínas que
se denominó Western blot.
Estas técnicas comienzan con una electroforesis en gel con el objetivo de separar las
moléculas por su tamaño, posteriormente la transferencia a una membrana para
finalmente identificar un fragmento específico de ADN, una molécula de ARN particular
o una proteína de interés mediante la unión específica de otra molécula de ácido
nucleico (sonda) para ADN o ARN o anticuerpo para proteínas.

D) Técnicas inmunológicas para la detección de antígenos virales
- Inmunofluorescencia directa:
La muestra que presuntamente contiene antígenos virales es puesta en contacto con
un anticuerpo conjugado con fluoresceína dirigido contra dicho antígeno. Si el antígeno
esperado está presente se formará un complejo antígeno-anticuerpo.
Luego de los lavados, solo quedarán presentes estos complejos y la reacción positiva
emitirá fluorescencia que puede verse con la ayuda de un microscopio de fluorescencia
(Figura 13).

Figura 13: esquema para la detección de antígenos virales por inmunofluorescencia
26

-ELISA:
Se realiza en placas de 96 pocillos. En general, uno de los componentes (antígeno o
anticuerpo) se adsorbe sobre un soporte (inmunoadsorbente) y se agregan antígenos o
anticuerpos marcados con una enzima.
La reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por lo tanto, será fácilmente
revelada mediante la adición de un sustrato específico. Al actuar la enzima sobre el
sustrato producirá un color, observable a simple vista (cualitativo) o cuantificable
mediante el uso de un espectrofotómetro, expresándose como densidad óptica
(cuantitativo). En cada placa se colocan controles positivos y negativos de absorbanciaconocida (Figura 14).

Figura 14: esquema de la técnica de ELISA para la detección de antígeno

-Inmunohistoquímica e inmunocitoquímica:
La inmunohistoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico sobre un
corte de tejido determinado y ubicar en qué estructuras del mismo se encuentra. Para
la detección de antígenos, el único Ac a utilizar se encuentra conjugado con la enzima
reconociéndose la unión del mismo con el antígeno tras el agregado del sustrato
cromógeno.
La inmunocitoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico sobre
células mediante un procedimiento similar.

E) Técnicas inmunológicas para la detección de anticuerpos virales.
Las técnicas indirectas son las usadas para la detección de anticuerpos como la
inmunofluorescencia indirecta e ELISA indirecto (Figura 15).

Figura 15: esquema de la detección de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta

Otras técnicas utilizadas de rutina son la seroneutralización y la inmunodifusión en
gel de agar.
-Seroneutralización:
Se fundamenta en la detección de anticuerpos neutralizantes en el suero problema.
Se colocan los sueros, diluidos en medio de cultivo con el virus a neutralizar, en placas
previamente sembradas con células. Luego se incuban las diluciones seriadas en una
estufa a 37°C y se determina si hay o no presencia de ECP en un microscopio invertido.
Al realizar diluciones del suero es posible determinar la concentración o título de
anticuerpos neutralizantes presentes en la muestra. El título de anticuerpos se
determina como la dilución más alta que presenta inhibición completa del ECP después
de 72 horas de incubación (Figura 16).

Figura 16: esquema de la seronuetralización viral

-Inmunodifusión en gel de agar (IDGA):
Empleando el medio adecuado (gel de agar), es posible hacer migrar por difusión
tanto Ag como Ac, de modo que al encontrarse en proporciones óptimas, interaccionen,
produciendo una banda de precipitado visible.

C. DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO

Durante las últimas décadas, el aumento en la prevalencia de las infecciones fúngicas
ha sido constante, relacionado fundamentalmente con el incremento de pacientes
inmunocomprometidos, con el uso generalizado de antimicrobianos, con la utilización
de inmunosupresores, con maniobras diagnósticas invasoras y la implantación de
alimentación parenteral.
Para identificar a los hongos causantes de los diferentes tipos de micosis, el cultivo
sigue siendo el “Gold standard” del diagnóstico microbiológico, ya que permite la
identificación del agente etiológico y la realización del estudio de sensibilidad.
Las nuevas técnicas diagnósticas independientes del cultivo tienen como objetivo
mejorar la sensibilidad y reducir el tiempo necesario para realizar el diagnóstico.
Las principales técnicas se clasifican en:
a) detección en sangre de antígenos y/o anticuerpos:
-antígeno capsular
-antígeno galactomanano
-antígeno manano
-anticuerpos anti-manano
-anticuerpos anti-micelio
b) detección de otros componentes fúngicos:(1→3)-β-D-glucano

1-RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

Para alcanzar el éxito en el diagnóstico micológico partiendo de una sospecha clínica,
es fundamental realizar adecuadamente la recolección dela muestra a partir de la lesión
y evitar posibles contaminaciones en su transporte y procesamiento.
Ante un crecimiento fúngico hay que tener siempre presente la necesidad de
diferenciar un “aislamiento significativo” de otros que no lo son, ya que no es lo mismo
identificar una especie fúngica que diagnosticar una micosis.
Para optimizar la recolección de las muestras:
 Es necesario recoger las muestras asépticamente, utilizando contenedores
estériles, remitirlas al laboratorio antes de 2 horas y sembrarlas lo antes posible.
 La muestra debe recogerse antes de instaurar el tratamiento antimicótico y
siempre de la parte activa de la lesión
 Las muestras de lesiones cerradas y abscesos deben aspirarse con jeringa y
transferirse a un contenedor estéril con solución salina.
El recipiente de recolección se identificará con los datos del enfermo (nombre y
apellidos, número de historia clínica, sexo, etc.) y los datos clínicos (diagnóstico
presuntivo, tratamiento antimicótico, etc.).

2-TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Todas las muestras deben enviarse al laboratorio rápidamente, sin conservantes. Las
muestras deben transportarse en un recipiente estéril ya prueba de vertidos.
En general, no deben introducirse en medios de transporte, a no ser quesea fácil
retirar la muestra del medio.
Las muestras en que se sospeche la presencia de dermatofitos u hongos dimórficos
se conservarán a temperatura ambiente, nunca refrigerados.

3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: IDENTIFICACIÓN MICOLÓGICA

Es importante que la muestra se recoja y se transporte en condiciones apropiadas y
que no se demore su cultivo debido a la pérdida de viabilidad de algunos hongos por la
desecación, la temperatura elevada (>37ºC) o baja (<10ºC), el sobre crecimiento
bacteriano, la presencia de leucocitos, etc.

 OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA
Las muestras, antes de ser procesadas, tienen que observarse macroscópicamente,
en busca de material caseoso, purulento, hemorrágico, necrótico o gránulos.

 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Cuando los elementos fúngicos están presentes en número suficiente se puede
establecer una orientación diagnóstica presuntiva y/o definitiva. Se informa al
odontólogo clínico, para la instauración temprana de una terapia antifúngica. Esto es de
importancia en los pacientes inmunocomprometidos.
Con frecuencia los hongos tardan en desarrollar las estructuras características (hifas,
esporas sexuales, asexuales) para su identificación definitiva. Por lo tanto, es de gran
utilidad que simultáneamente se inoculen los medios de cultivo y se realicen las técnicas
microscópicas directas.
-Examen microscópico directo: proporciona un diagnóstico definitivo si se observan
elementos fúngicos patognomónicos: cápsula, levaduras pequeñas, quistes, levaduras
con brotes de base ancha, levaduras con gemación multipolar, etc. (Figura 17).

Figura 17: observación en fresco al microscopio óptico de Candida albicans

Los métodos usados para la visualización fúngica difieren en algunos aspectos de los
de las bacterias; el mayor tamaño de los hongos hace, generalmente innecesarios la
tinción de frotis secos; en su lugar son más utilizadas las preparaciones directas en fresco
con o sin líquidos de montaje y clarificación.
Las tinciones más usadas para mejorar la sensibilidad son: tinta china, Giemsa,
argénticas, agentes quimiofluorescentes, etc.

 Levaduras
La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran número
de medios de cultivos: agar sangre, agar glucosado Sabouraud (AGS), agar chocolate,
agar CLED, etc. El AGS, con o sin antibióticos añadidos, es el medio de aislamiento por
excelencia para la identificación de levaduras. En este medio las colonias de levaduras
suelen ser completas, ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa
o rugosa, con olor dulzón agradable, volviéndose más pastosas a medida que la colonia
envejece.

 IDENTIFICACIÓN MICOLÓGICA CONVENCIONAL
Si se visualiza crecimiento que sugiera posibilidad de levaduras, se realiza una
extensión en fresco. Si en la misma se observan levaduras, se procede a la identificación
mediante subcultivo a un medio cromogénico, de los que hay varios comercializados. En
el caso que no se trate de ninguna de las especies que este medio identifica, se procede
a hacer la identificación mediante auxonograma de carbono o mediante alguno de los
métodos comerciales basados en él.

* Medios de cultivos
El objetivo fundamental de la utilización de los medios de cultivo es optimizar el
crecimiento de los microorganismos. En los medios de cultivo micológicos,los
antimicrobianos se utilizan tanto para inhibir el crecimiento bacteriano como el de otros
hongos ambientales.

* Clasificación de los medios de cultivos

-Generales: El más característico y clásico es el agar glucosado Sabouraud (AGS). Se
utiliza como medio de cultivo general y fundamentalmente para la realizar la descripción
de las características morfológicas de la mayoría de los hongos.
-Enriquecidos: Se utilizan especialmente en micosis sistémicas endémicas
(histoplasmosis, blastomicosis), para la recuperación de la fase levaduriforme. Un
ejemplo de estos medios es el agar cerebro-corazón con sangre (BHI).
-Selectivos: Son medios que favorecen el crecimiento de los microorganismos deseados
impidiendo el de otros. Los componentes más sutilizados como agentes selectivos son
antibacterianos (cloranfenicol, gentamicina, penicilina, estreptomicina) y también
inhibidores de hongos como la cicloheximida que es especialmente útil en las muestras
cutáneas y respiratorias para el diagnóstico de micosis sistémicas endémicas.
-Diferenciales: Se utilizan para ayudar a la identificación del hongo basada en la
apariencia de éste en dicho medio, merced a la adición de determinados componentes
como por ejemplo sustancias cromógenas, o indicadores de pH como en el DTM
(“Dermatophyte Test Medium”, Indicador de pH rojo fenol, el medio cambia de amarillo
31

(ácido) a rojo (alcalino).Urea Agar es un medio diferencial, no selectivo, tiene como
indicador de la producción de acidez o alcalinidad el Rojo Fenol.
-Especializados: Son aquellos medios que contienen algún componente (por ejemplo,
ácidocafeico) destinado a aislar un agente concreto (C. neoformans), favorecer la
identificación de ciertas especies (por ejemplo, el medio de Czapeck), u obtener
estructuras de reproducción sexual (por ejemplo, agar acetato, agar patata zanahoria).
-Medios cromogénicos para levaduras: contienen diversos sustratos enzimáticos que
están unidos a compuestos cromogénicos. Muy útil para el estudio de levaduras (Figura
18).

Figura 18: diferenciación de Cándidas spp por medio cromogénico

-Medios comerciales basados en la asimilación de nutrientes, en pruebas enzimáticas
- AUXACOLOR: en la galería Auxacolor (Bio-Rad) la asimilación se visualiza por el cambio
de un indicador de pH. Posee la prueba de resistencia a la actidiona (inhibidor del
crecimiento de ciertas levaduras y hongos) y otra para la detección de la actividad de la
enzima fenol-oxidasa (Figura 19).

Figura 19: prueba comercial para la identificación de Cándidas
.
- API 20 C AUX: la galería API 20 C AUX (bioMérieux) se compone de 20 cúpulas con
sustratos deshidratados que permiten realizar 19pruebas de asimilación. Las cúpulas se
inoculan con un medio mínimo semisólido y las levaduras sólo se reproducen si son
capaces de utilizar el sustrato correspondiente. Permite identificar un total de 34
especies diferentes. La lectura de estas reacciones se hace por comparación con un
control de crecimiento y la identificación se obtiene, a partir de un código numérico,
mediante un catálogo analítico o un programa informático (Figura 20).
32

Figura 20: prueba comercial para la identificación de diferentes especies de levaduras

* Técnicas de biología molecular
La PCR es una herramienta útil para detectar las especies de Cándida spp
comúnmente causantes de infección en pacientes comprometidos inmunológicamente.
La PCR y sus variantes superan a los procedimientos convencionales en tiempo,
sensibilidad y especificidad.
Las técnicas diagnósticas moleculares para la detección de patógenos fúngicos están
dirigidas principalmente a los siguientes aspectos del diagnóstico micológico:
a) identificación de especie mediante secuenciación de dianas taxonómicamente
relevantes.
b)diagnóstico clínico precoz de las infecciones fúngicas.
c) detección de los mecanismos de resistencia a los antifúngicos.
d) tipificación subespecífica de cepas clínicas.

D. DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

El objetivo del estudio parasitológico de una muestra clínica es el de proporcionar
información sobre la presencia o ausencia de patógenos, o de sus productos, que
pudieran participar en la enfermedad de un paciente.
El proceso diagnóstico comienza por un problema clínico o epidemiológico que hace
necesaria la demanda de una o varias pruebas, toma y transporte adecuado de las
muestras a investigar, información de los datos demográficos y clínicos del paciente,
recepción en el laboratorio, procesamiento, análisis e interpretación de los resultados y
un informe final.

1- RECOLECCIÓN y TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Para las determinaciones es importante tener en cuenta el tipo de muestra a tomar,
y qué precauciones deben tomarse para que sea satisfactoria en el momento de su
análisis e investigación.
Las muestras de heces deben ser transportadas inmediatamente al laboratorio
después de recogidas, pero si van a estar más de dos horas, se tienen que conservar en
refrigeración a 4 °C y en caso de que se observen después de las 4 o 6 horas de recogida,
sería conveniente el uso de persevantes como la formalina al 5 o al 10 %, los que se
deben mezclar con las heces, en proporción de tres partes del líquido preservante por
una de heces.
-Formol al 5%: para preservar quistes de protozoarios.
-Formol al 10%: para huevos y larvas de helmintos.

2-PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: IDENTIFICACIÓN PARASITOLÓGICA

El diagnóstico de las infecciones parasitarias puede establecerse de dos maneras
fundamentales:

A.- Métodos directos:
Permite determinar o precisar el agente causal por hallazgo del parásito o de sus
elementos morfológicos.
Dentro de los métodos directos se encuentra:
* El análisis parasitológico de heces: consta de un examen microscópico directo,
con y sin coloraciones. La observación microscópica (microscopio óptico)
permite observar las diferentes fases evolutivas del parásito (quistes,
trofozoitos, huevos y larvas).
* El examen macroscópico: que permite identificar el parásito en su estado adulto
o fragmentos de ellos y comprende el examen a simple vista o con lupa
* Los métodos de concentración en:
* -Solución salina fisiológica:
Para reconocer trofozoítos de protozoos y otros estadios de diagnóstico de protozoos
y helmintos (larvas, huevos). Es el mejor método para detectar trofozoítos en una
amebiasis invasora por Entamoeba histolytica en heces o en otros productos humanos.
Sirve para ejecutar cuenta de huevos de algunos helmintos y así estimar la intensidad
de la infección.
34

* -Solución de Lugol:
Para colorear en forma temporal trofozoítos y quistes de protozoos. Inmovilizar y
colorear estructuras internas de larvas e identificar por morfología específica

B.- Métodos indirectos:
Dirigidos a hacer evidente la respuesta inmune del hospedador frente al parásito. Los
métodos indirectos de diagnóstico tienen fundamental importancia para el diagnóstico
de parasitosis en que es imposible, o muy difícil, la visualización directa del parásito o
de alguno de sus elementos; también para controlar la evolución post-terapéutica de la
infección.
Dentro de los métodos indirectos se encuentra:
 Citodiagnóstico: a través del hemograma
 Histodiagnóstico: que permite observar la reacción granulomatosa, metaplasia
e inflamación
 Inmunodiagnóstico: determinación de inmunoglobulinas, fijación del
complemento, hemaglutinación indirecta, ELISA, etc.

PARTE II

IMPORTANCIA DEL
DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO EN
ODONTOLOGÍA

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE
ESTREPTOCOCOS ORALES

* Recolección de Muestras
Las muestras se recolectan hisopando la mucosa de los carrillos, el dorso de la lengua,
el piso de la boca y el paladar duro.
Generalmente y según la zona afectada por la enfermedad de caries, se toma muestra
de la biopelículabacteriana localizada en las diferentes superficies de los primeros
molares superiores e inferiores.

* Medio de cultivo selectivo
Se utiliza el agar Mitis Salivarius (MS) suplementado con 0,2 U/ml de bacitracina y
con 0,001% de Tellurite de potasio.
En el agar MS, muchos estreptococos orales muestran una morfología característica
delas colonias. Pueden presentarse blanquecinas, de bordes definidos, colonias firmes
muy adherentes al medio de cultivo, lo cual permite su diferenciación inicial.
Usualmente, la placa de agar se cultiva en una atmósfera del 95% de nitrógeno y 5% de
dióxido de carbono a 37°C por 1 o 2 días seguida de una incubación en aire por 1 o 2 días
(Figura 21).

Streptococcus salivarius
Streptococcus mutans
Streptococcus mitis

Figura 21: características morfológicas de las colonias estreptocócicas en AMS

Los azúcares en este medio son la sacarosa y la glucosa, así como los colorantes son
el azul tripán y el cristal violeta. El azul tripán es absorbido por las bacterias, causando
que se vuelvan azules. El cristal violeta, junto con el 1% de telurito agregado a este
medio, inhibe las bacterias Gram negativas así como muchas otras bacterias Gram
positivas.
-Streptococcus salivarius usa los azúcares para producir un levanos, produce colonias
pegajosas, mucoides y en forma de gota de goma.
-Las colonias de Streptococcus mitis son pequeñas, planas y de color azul claro.
-Streptococccus mutans produce colonias de forma irregular, con una apariencia
granular de vidrio esmerilado y produce dextranos a partir de azúcar.
37

Con relación a los estreptococos orales, pueden diferenciarse por su habilidad para
fermentar ciertos azucares, por adherirse a superficies lisas en presencia de sacarosa,
por el tipo de crecimiento aeróbico o anaeróbico, etc.

* Morfología y características en cultivo de Streptococcus mutans
Es un coco Gram positivo, dispuesto en cadena, no móvil, catalasa negativo,
productor rápido de ácido láctico con capacidad de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2
en, aproximadamente, 24 horas.
Fermentador de glucosa, lactosa, rafinosa, manitol, inulina y salicina con la
producción de ácido. Normalmente no desamina la arginina para producir amoniaco.
Usualmente no producen ni hemólisis ni decoloración en agar sangre, es principalmente
alfa o gamma hemolítico en agar sangre de cordero, aunque se han reportado unas
pocas cepas hemolíticas (Tabla 1).
S. mutans se ha subclasificado en varios tipos con base en las propiedades
inmunológicas, biológicas y genéticas: los serotipos de S. mutans son c, e, f y k.
El hábitat natural de S. mutans es la boca humana. En cavidad oral, las colonias se
adhieren muy cerca de la superficie del diente e igualmente se puede recuperar en
lesiones cariosas. Puede aislarse frecuentemente de heces en humanos ratas. Aunque
S. mutans no se distribuye ampliamente en animales salvajes, se ha aislado en monos,
murciélagos, ratas salvajes habitantes de campos de cultivo de caña de azúcar y de
monos Rhesus. Igualmente, se ha aislado en ratas y hámsteres de experimentación.

Tabla 1: características para la identificación de especies del Grupo Mutans. (Hamada.S. Biology,
immunology and cariogenicity of Streptococcus mutans. Microbiological reviews.1980)

* Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de Streptococcus
mutans
Los métodos microbiológicos y bioquímicos, disponibles actualmente, no permiten la
rápida detección e identificación de esta bacteria. Se utiliza la metodología de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar la presencia de S. mutans en saliva y
biopelícula dental.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS
PERIODONTOPATÓGENAS

* Recolección de Muestras de fluido crevicular gingival (FCG)

Se selecciona la localización con la mayor profundidad y sangrado al sondaje.
Se eliminan cuidadosamente los depósitos de biopelícula supragingival, se aísla las
zonas de interés mediante rollos de algodón y secado con aire.
Se introduce dos puntas de papel estériles, de tamaño medio (Figura 22) de forma
consecutiva en la profundidad de la bolsa o del surco periodontal y se deja en esa
posición durante 10 a 20 segundos. Las puntas de papel se introducen en un vial con 2
ml de fluido estéril de transporte reducido que permite conservar la anaerobiosis de las
muestras (Figura 23).

Figura 22: toma de muestra de la bolsa o surco periodontal

Figura 23: muestras de puntas de papel estéril en vial con fluido estéril de transporte reducido
39

* Procesamiento de las muestras de FCG
Se siembran las muestras en placas de Petri con un medio de agar no selectivo (Oxoid
no 2; Oxoid, Basingstoke, UK), suplementado con sangre al 5%, hemina (5mg/l) y
menadiona (1mg/l) para la determinación del recuento total de anaerobios (UFC) y para
la identificación de los patógenos bacterianos específicos (Figura 24).

Figura 24: Placa de agar sangre con crecimiento de bacterias periodontopatógenas

Para el recuento de Agregatibacter actinomycetemcomitans, las muestras se
siembran en un medio Dentaid-1.
Las placas de agar sangre se incuban en atmósfera anaeróbica (80% N2, 10% H2, 10%
CO2) a 37°C durante 7 y 14 días.
Las placas Dentaid-1 se incuban en aire con 5% de CO2 a 37ºC durante 3 y 5 días
La presencia y la cantidad de los patógenos periodontales P. gingivalis (Figura 25. A),
Prevotella intermedia, Tanneralla forsythia, Parvimonas micra, Campylobacter rectus y
Fusobacterium nucleatum, se realiza en las placas de agar no-selectivo.
La determinación de especie bacteriana se realiza mediante test bioquímicos
comerciales estándares (RapID™ ANA II System; Remel, Lenexa, KS, EE.UU.) (Figura 25.
B),

A B

Figura 25: A: placa de agar sangre con Porphyromonas gingivalis; B: Kit comercial RapID™ ANA II System

* Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de bacterias
periodontopatógenas
Los métodos que utilizan fragmentos de ADN para la detección de
periodontopatógenos son pruebas rápidas, sensibles y específicas, en comparación con
los que utilizan medios de cultivo. Sin embargo, se encuentran disponibles sólo para
unos cuantos patógenos y no permiten conocer la sensibilidad de los microorganismos
a los antibióticos.
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 PCR: se utiliza un termociclador para la amplificación en cadena de la polimerasa.
Con alta sensibilidad y especificidad. El producto final de esta reacción
exponencial es un ácido nucleico de doble cadena que puede ser analizado en
tamaño, secuencia y cantidad o servir para otras técnicas moleculares. Se utiliza
para la búsqueda de material genético de un agente infeccioso en una muestra
clínica y para la identificación de aislamientos (Figura 26).

Figura 26: Termociclador para realizar PCR

 PCR tiempo real: es una variante de la PCR convencional que se emplea para la
cuantificación de ácidos nucleicos, tanto de ADN como de ARN mensajero en una
muestra. Permite cuantificar proporciones de P. gingivalis, P. intermedia y A.
actinomycetemcomitans, y debido a su gran rapidez y sensibilidad son de gran
utilidad en los estudios epidemiológicos. La presencia o ausencia de la bacteria
puede ser insuficiente para evaluar los efectos terapéuticos de algún
tratamiento, por lo que la cuantificación de los niveles o proporciones de las
especies en el biopelícula proporciona un mejor resultado.
 Southern Blot: Transferencia de fragmentos de ADN originados por
endonucleasas de restricción y posterior hibridación con una sonda marcada.
Permite la comparación de patrones genéticos
 Sondas: las muestras subgingivales son sometidas a la digestión enzimática del
ADN bacteriano,