Estudo sobre Vacina GnRH-I em Ratones

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UNIVERSIDAD DE CHILE 
 
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS 
ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAMBIOS HISTOLÓGICOS GONADALES E HIPOTALÁMICO-
HIPOFISIARIOS EN RATONES HEMBRA INMUNIZADOS CON UNA 
VACUNA PEPTÍDICA CONTRA LA HORMONA LIBERADORA DE 
GONADOTROFINAS (GnRH-I) 
 
 
 
 
RAFAEL SEVILLA REYES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SANTIAGO, CHILE 
2013 
Memoria para optar al Título 
Profesional de Médico Veterinario 
Departamento de Ciencias 
Biológicas Animales 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE CHILE 
 
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS 
ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS 
 
 
 
 
 
CAMBIOS HISTOLÓGICOS GONADALES E HIPOTALÁMICO-
HIPOFISIARIOS EN RATONES HEMBRA INMUNIZADOS CON UNA 
VACUNA PEPTÍDICA CONTRA LA HORMONA LIBERADORA DE 
GONADOTROFINAS (GnRH-I) 
 
 
RAFAEL SEVILLA REYES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NOTA FINAL: ………………… 
 
 
 NOTA FIRMA 
 
PROFESOR GUÍA : LEONARDO SÁENZ ITURRIAGA ………………. ………….…… 
 
PROFESOR CONSEJERO: MARÍA SOLEDAD FERNÁNDEZ ………………. ………………. 
 
PROFESOR CONSEJERO: JULIO LARENAS HERRERA ……………….. ………………. 
 
 
 
SANTIAGO, CHILE 
2013
Memoria para optar al Título 
Profesional de Médico Veterinario 
Departamento de Ciencias 
Biológicas Animales 
3 
 
Resumen 
En el presente estudio se determinaron los cambios histológicos gonadales e hipotalámico-
hipofisiarios en ratones hembra Balb/c inmunizados con una vacuna peptídica contra la 
hormona GnRH-I, basada en el antígeno recombinante GnRX/ GQ y quitosano como 
adyuvante, en una formulación soluble y una estrategia de micropartículas. Los animales 
inmunizados (días 1 y 30) desarrollaron anticuerpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a contra el 
antígeno recombinante desde la primera vacunación y contra la hormona nativa GnRH-I desde 
la revacunación. Se observó una disminución del número de cuerpos lúteos y folículos 
preovulatorios en el parénquima ovárico de los individuos inmunizados, principalmente en el 
grupo donde se utilizó quitosano soluble como adyuvante. Por otro lado, en los animales 
inmunizados se determinó mediante inmunohistoquímica, un aumento de células positivas para 
GnRH-I en la zona hipotalámico-hipofisiaria, sin embargo, en estudios futuros se debe 
complementar la inmunohistoquímica de encéfalo con un método cuantitativo como qPCR, 
debido a la difícil estandarización y cuantificación de los resultados obtenidos mediante 
inmunohistoquímica encefálica en ratones. 
 
Abstract 
This study examined gonadal and hypothalamic-pituitary histological changes in female Balb/c 
mice immunized with a peptide vaccine against GnRH-I, constituted with the recombinant 
antigen named GnRX / GQ and chitosan as adyuvant, in a soluble and microparticar 
formulation. The inmunized animals (days 1 and 30) developed specific antibodies IgG, IgG1 
and IgG2a against the recombinant antigen from the first vaccination and against the native 
hormone GnRH-I from the booster. There was a decrease in the number of corpus luteum and 
preovulatory follicles in the immunized mice ovarian parenchyma, mainly in the group where 
soluble chitosan was used as adjuvant. Increased GnRH-I-positive cells in the hypothalamic-
pituitary zone in immunized animals were determined by immunohistochemistry, however, due 
to the difficult standardization and quantification of the results of the encefalic 
immunohystochemistry in mice, future studies should complement brain 
immunohistochemistry with a quantitative method such as qPCR. 
 
 
 
 
 
 4 
INTRODUCCIÓN 
 
Hace muchos años que la búsqueda de tecnologías de regulación de la actividad reproductiva 
se ha hecho muy importante. Actualmente, lo más utilizado para la supresión de la actividad 
reproductiva es la castración quirúrgica. La castración es muy utilizada en animales de 
producción y también en animales domésticos, sin embargo, su implementación presenta varias 
limitaciones como la necesidad de utilización de instrumental quirúrgico estéril, anestésicos y 
analgésicos en el post operatorio, así como la necesidad de personal entrenado y capacitado 
para realizar dicha cirugía. Además, existen algunos riesgos asociados a dicho procedimiento, 
como la ocurrencia de infecciones post operatorias y otras complicaciones como la aparición 
de hernias y dolor asociados a la operación. Debido a esto, se han desarrollado métodos 
alternativos a la castración quirúrgica, siendo uno de los más innovadores la castración 
inmunológica utilizando vacunas que bloquean la actividad de la hormona liberadora de 
gonadotrofinas (GnRH-I). Esta técnica presenta diversas ventajas, como los menores costos y 
tiempos de implementación, la reducción del estrés asociado a la cirugía, así como también, la 
disminución de los riesgos y las dificultades de implementación de una castración quirúrgica. 
Además, su uso en especies productivas genera beneficios evidentes en diferentes parámetros 
productivos, tales como una mejoría en la ganancia diaria de peso (GDP) (Fabrega et al., 
2010). 
 
Vacunación contra la hormona GnRH-I 
La hormona GnRH-I es altamente conservada en mamíferos machos y hembras, por lo que las 
tecnologías para el control de la fertilidad, basadas en esta hormona, tienen un amplio rango de 
aplicaciones en diferentes especies (Turkstra y Meloen, 2006). 
La hormona GnRH-I es un blanco deseable para el control reproductivo debido a que actúa a 
través de una unión específica y de alta afinidad a los receptores de las células gonadotrofas 
presentes en la adenohipófisis. Es por esto que distintos agentes para el control de la fertilidad 
basados en GnRH-I han sido importantes objetos de estudio para el control de la reproducción 
en humanos, animales domésticos y silvestres. 
Es así como por varios años, los científicos han intentado inmunoneutralizar la hormona 
GnRH-I, bloqueando su entrada a la hipófisis, controlando así la esteroidogénesis, ovogénesis 
y espermatogénesis (Kirkpatrick et al., 2011; Ferro et al., 2004; Geary et al., 2006; Robbins, 
2002). 
 5 
La inmunización contra GnRH-I induce una inhibición del eje hipotálamo-hipófisis-gonadal, 
genera una barrera inmunológica entre el hipotálamo y la hipófisis anterior, debido a que 
anticuerpos específicos se unen a GnRH-I en la circulación portal hipofisiaria, lo que evita la 
unión de la hormona a los receptores en los gonadotrofos adenohipofisiarios. Esto genera una 
disminución en la secreción de LH y FSH, inhibiéndose así el desarrollo de esteroides 
sexuales, gametos y también el comportamiento reproductivo (Herbert y Trigg, 2005; Turkstra 
y Meloen, 2006; Geary et al., 2006). 
Vacunas eficaces contra GnRH-I se han desarrollado en un gran número de especies animales 
(Kirkpatrick et al., 2011; Ferro et al., 2004; Geary et al., 2006; Robbins, 2002). En 
comparación con la castración quirúrgica, la inmunocastración es un método menos engorroso, 
no doloroso, menos invasivo, aplicable a mamíferos de ambos sexos y eventualmente 
reversible con el tiempo en animales prepúberes y adultos (Basulto et al., 2003). Sin embargo, 
debido que se trata de un péptido propio y a que posee un bajo peso molecular, la hormona 
GnRH-I se comporta como un antígeno vacunal débil, lo que hace necesaria su utilización en 
conjunto con proteínas “carriers” o formulaciones adyuvantes que aumenten su 
inmunogenicidad (Herbert y Trigg, 2005). 
En el laboratorio BIOVETEC de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la 
Universidad de Chile, se ha diseñado, expresado y purificado una proteína recombinante 
(GnRX G/Q) con una estructura primaria repetida en tándem, que incorpora la secuencia 
aminoacídica de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) fusionadaa una secuencia 
espaciadora que facilita la presentación al sistema inmune innato. Esta molécula, por tener una 
estructura repetida en tándem, posee un tamaño que le permite ser reconocida y presentada por 
las células presentadoras de antígeno (CPA) del sistema inmune innato. Sin embargo, al ser un 
péptido recombinante purificado, necesita la presencia de un adyuvante para tener capacidad 
inmunogénica y obtener el efecto fisiológico deseado de bloqueo en la actividad reproductiva. 
 
Adyuvantes vacunales 
Los adyuvantes vacunales son definidos como sustancias que aumentan respuestas inmunes 
adaptativas a antígenos. Comprenden un grupo diverso de moléculas definidas o de 
formulaciones más complejas. Los adyuvantes han sido usados como componentes críticos en 
vacunas inactivadas contra una gran variedad de enfermedades microbianas por más de un 
siglo (Schijns y Lavelle, 2011). 
 
 6 
Los adyuvantes pueden ser usados con varios propósitos: (i) para aumentar la inmunogenicidad 
de antígenos altamente purificados o recombinantes; (ii) para disminuir la cantidad de antígeno 
o el número de inmunizaciones necesarias para una inmunidad protectiva; (iii) para aumentar la 
eficacia de vacunas en recién nacidos, ancianos o personas inmunocomprometidas, o (iv) como 
sistemas de liberación del antígeno para la captación de este en la mucosa oral y nasal 
(McElrath, 1995). 
El diseño de vacunas comienza con el conocimiento extenso de la respuesta inmune inducida 
por la vacuna. Por lo tanto, es necesario definir la respuesta inmune requerida para la eficacia 
de una determinada vacuna y qué tipo de respuesta inmune efectora debe ser inducida por una 
formulación vacunal (Schijns y Lavelle, 2011). 
En este proyecto se utilizó un biopolímero derivado de la quitina llamado quitosano, en una 
formulación soluble y otra en micropartículas. El quitosano ha demostrado inducir una 
respuesta inmune mixta, humoral y celular (Zaharoff et al., 2007; Saenz et al., 2009), tanto en 
su forma soluble como en micropartículas, siendo las micropartículas una estrategia que ha 
mostrado en recientes estudios muy buenos resultados debido a la inducción de una potente 
respuesta celular (Senel, 2011), debido a esto, es interesante ver si existen diferencias en los 
cambios histológicos gonadales e hipotalámico-hipofisiarios entre ambas estrategias 
adyuvantes en relación a los animales no inmunizados, lo que permitiría deducir cual 
formulación es más eficiente en la alteración del funcionamiento del eje hipotálamico-
hipofisiario-gonadal. 
 
Sistema inmune: Respuesta inmune humoral y celular 
La función del sistema inmunitario consiste en la defensa contra los microorganismos 
infecciosos. Sin embargo, incluso una sustancia ajena que no tenga carácter infeccioso puede 
despertar una respuesta inmune. Así mismo, aquellos mecanismos que en condiciones 
normales protegen de las infecciones y eliminan las sustancias ajenas, en algunas 
circunstancias también son capaces de provocar una lesión tisular y una enfermedad (Abbas et 
al., 2012). 
Dentro de los componentes del sistema inmune podemos distinguir dos grandes grupos, la 
inmunidad innata y la inmunidad adaptativa (López et al., 2004). La inmunidad innata y el 
resultante proceso inflamatorio, tienen un rol clave en el inicio de la respuesta inmune 
adaptativa por medio de dos puntos correlacionados: las células de la inmunidad innata 
reconocen e incorporan los antígenos, los procesan y presentan como fragmentos peptídicos a 
 7 
los linfocitos T y al mismo tiempo se activan adquiriendo capacidad para proveer una señal 
secundaria a los linfocitos T, necesaria para su activación (Kenney y Edelman., 2004). 
Existen dos tipos de respuestas inmunitarias adaptativas, llamadas inmunidad humoral e 
inmunidad celular. La inmunidad humoral se basa en la acción de anticuerpos neutralizantes 
que son producidos por los linfocitos B. La inmunidad celular está a cargo principalmente de 
los linfocitos T (Kuby, 2008). Las células dendríticas (CD) de la inmunidad innata tienen un 
rol crucial en la activación de los linfocitos T, pudiendo controlar parte importante de la 
inmunidad adaptativa en respuesta a la internalización y procesamiento de antígenos a través 
de la vía de moléculas de histocompatibilidad clases I y II (MHC I y MHC II) y la presentación 
de péptidos antigénicos a los linfocitos T colaboradores (CD4
+
) y citotóxicos (CD8
+
) (Reddy et 
al., 2006). 
Existen dos subtipos de linfocitos colaboradores o “helper” (Th). El subtipo Th1 es responsable 
de muchas funciones mediadas por células (como la hipersensibilidad retardada y la activación 
de células T citotóxicas) y de la producción de anticuerpos IgG promotores de la 
opsonización (anticuerpos que se unen con alta afinidad a los receptores Fc de los fagocitos e 
interactúan con el sistema del complemento), como IgG2a en ratones. El subtipo Th2 estimula 
la activación y diferenciación eosinofílica, proporciona ayuda a las células B y promueve la 
producción principalmente de IgG1 en ratones (Abbas, 2008; Kuby, 2004). 
Por su parte, los linfocitos T CD8
+ 
monitorean constantemente las células del organismo con el 
fin de eliminar a cualquiera que exhiba un antígeno, como ocurre en células infectadas con 
virus, células tumorales, células provenientes de transplantes, etc. Las células que expresan un 
antígeno foráneo en el contexto de una molécula MHC- I son llamadas “células propias 
alteradas” y son las células diana de los linfocitos T citotóxicos, que poseen la capacidad de 
destruirlas (Kuby, 2004; Roitt, 2001.). 
Además, se ha descrito que en células dendríticas (CDs), péptidos derivados de partículas 
interanlizadas, pueden ser presentadas de forma cruzada eficientemente por moléculas MHC-I, 
induciéndose así una respuesta citotóxica contra células propias que presenten un antígeno en 
particular (Ackerman et al., 2005). 
 
Hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) y funcionamiento del eje hipotálamo 
hipofisiario gonadal 
La hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I), es un decapéptido altamente conservado 
en mamíferos, secretado desde la porción medio-basal del hipotálamo y es responsable de 
inducir principalmente la liberación de la hormona luteinizante (LH) y en menor medida de la 
 8 
hormona folículo estimulante (FSH) desde la hipófisis anterior o adenohipófisis, que regulan en 
conjunto la esteroidogénesis y gametogénesis gonadal (Stanislaus et al., 1998; Wojcik-Gladysz 
et al., 2009). 
La hormona GnRH-I es transportada vía axonal a los pequeños vasos sanguíneos en la 
eminencia media, donde se libera hacia la sangre. Los vasos sanguíneos están irrigando la 
hipófisis anterior, permitiendo que la GnRH-I alcance dicha zona en altas concentraciones. En 
la hipófisis, la GnRH-I se une a sus receptores en las células gonadotrofas para estimular la 
liberación de FSH y de LH a la circulación. El patrón pulsátil de la secreción de GnRH-I 
induce la liberación cíclica de LH y en un menor grado de FSH, ya que es más importante en la 
mantención de los niveles de FSH que en su secreción inicial (Clarke, 2002; Turkstra y 
Meloen, 2006). En los machos, la LH estimula la síntesis y secreción de los andrógenos, como 
la testosterona, producidos por las células de Leydig en los testículos. Los niveles de 
andrógenos, inhiben directa e indirectamente la secreción de LH por un mecanismo de 
retroalimentación que actúa en la hipófisis y en hipotálamo, donde inhibe la liberación de 
GnRH-I. La FSH es responsable del inicio de la espermatogénesis, mientras que en adultos 
puede desempeñar un papel, junto con la testosterona, en la producción sostenida de los 
espermatozoides. La FSH se une a los receptores específicos en las células de Sértoli 
estimulando la producción de diversos factores de crecimiento. Por otro lado, en las hembras, 
la FSH induce el crecimiento folicular y posteriormentela secreción de estradiol e inhibina por 
las células de la granulosa. Los altos niveles de estradiol, producidos por los folículos maduros, 
conducen a una retroalimentación positiva en el hipotálamo durante la etapa de proestro, que 
causa la oleada de GnRH-I y en consecuencia de LH responsable de la ovulación (Turkstra y 
Meloen, 2006). 
En el presente proyecto se plantea que el bloqueo inmunológico de la hormona GnRH-I, 
inducirá cambios en el parénquima ovárico de los animales inmunizados debido a la ausencia 
del estímulo de la hormona GnRH-I sobre la adenohíposifisis, y por lo tanto, a una disminución 
de la secreción de las hormonas LH y FSH, responsables del correcto desarrollo del ciclo 
ovárico y la producción de esteroides gonadales. Pudiendo además, estos cambios inducidos a 
nivel ovárico, conducir a alteraciones en la expresión de GnRH-I a nivel hipotalámico-
hipofisiario debido a alteraciones en el feedback hormonal característico del eje hipotalámico-
hipofisiario-gonadal. 
 
 
 
 9 
HIPÓTESIS 
 
Dado que la inmunización contra GnRH-I induce una respuesta inmune y un bloqueo en la 
actividad de dicha hormona, el uso de una vacuna anti-GnRH-I generará cambios histológicos 
en el tejido hipotalámico- hipofisiario y gonadal. 
 
OBJETIVOS 
 
 OBJETIVO GENERAL 
Evaluar los cambios histológicos en hipotálamo-hipófisis y gónadas en los animales 
inmunizados con una vacuna peptídica contra GnRH-I. 
 
 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
1. Determinar los niveles de inmunoglobulinas específicas en animales inmunizados con 
una vacuna contra la hormona GnRH-I. 
2. Evaluar los cambios histológicos en las gónadas de los animales inmunizados. 
3. Evaluar los cambios histológicos en la zona hipotalámico-hipofisiaria de los animales 
inmunizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 10 
MATERIAL Y MÉTODOS 
 
Grupos para inmunización 
Se utilizaron ratones (Mus musculus) hembra de la cepa Balb/c dispuestos en 3 grupos, cada 
uno con 3 individuos, siendo cada grupo elegido aleatoriamente. 
Grupo 1 control, inoculados sólo con la formulación adyuvante. Grupo 2, vacunados con la 
proteína recombinante GnRX G/Q en micropartículas de quitosano de bajo peso molecular 
como adyuvante. Grupo 3, vacunados con la proteína recombinante GnRX G/Q en quitosano 
soluble de bajo peso molecular como adyuvante. 
 
Antígeno recombinante GnRX/GQ 
Proteína de fusión para inmunocastración de 29 kDa (patente WO2010/118547) que 
comprende la secuencia aminoacídica primaria de la hormona liberadora de gonadotrofinas 
(GnRH-I) fusionada a una secuencia teórica, espaciadora que le otorga capacidad 
inmunogénica. La secuencia del antígeno GnRX/GQ es la siguiente: 
 
 
 
Formulaciones adyuvantes 
Quitosano soluble 
Cien gramos de quitosano de bajo peso molecular (PM: 70 kDa), un porcentaje de 
desacetilación ≥75% y una viscosidad de 20.000 cps (Aldrich), se lavaron con acetona y 
metanol y secaron hasta un peso constante. Luego, se disolvió 1 gramo de dicho quitosano en 
100 mL de ácido acético 5% (pH: 4) y se filtró de forma estéril para ser usado en la 
formulación de la vacuna en conjunto con el antígeno GnRX/GQ, generándose una dosis de 
inmunización de 50 g del antígeno en 200 L de quitosano. 
 
Micropartículas de quitosano 
Las micropartículas de quitosano fueron generadas usando Tripolifosfato (TPP) como agente 
iónico entrecruzante. Quitosano de bajo peso molecular al 1% p/v en una solución de ácido 
acético al 0,5%, fue mezclado con el antígeno GnRX/GQ (650 μg/ml, pH 7.0). Ambos 
GPPFSGGGGPPFSGQHWSYGLRPG 
n 
 11 
componentes fueron mezclado mediante agitación orbital por un minuto. Luego se agregó la 
solución de TPP al 5% (p/v) como agente entrecruzante, en una relación de 15:1:25 de 
quitosano, antígeno y TPP respectivamente. Las micropartículas fueron examinadas en su 
forma y tamaño usando microscopía electrónica de barrido (SEM) (TESLA BS 343A) y su 
potencial zeta usando el equipo Zplus (Brookhaven). 
 
Los animales fueron inmunizados por vía subcutánea con 500 µg de la vacuna anti GnRH-I en 
las formulaciones adyuvantes ya descritas los días 1 y 30 del estudio y cada 15 días se extrajo 
una muestra de sangre de los animales para obtener el suero de los individuos y evaluar los 
niveles de anticuerpos generados contra la vacuna y contra la hormona nativa GnRH-I. 
Los procedimientos de administración de la vacuna, extracción de sangre y eutanasia de los 
animales fueron previamente evaluados y autorizados por el comité de Bioética de la Facultad 
de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. 
 
Determinación de los niveles de IgG específicos 
Se realizó un ensayo de ELISA en placas de 96 pocillos para determinar los niveles de IgG, 
IgG1 e IgG2a específicos generadas contra el péptido recombinante y la hormona nativa en el 
suero de los animales inmunizados. Se puso 2 μg de antígeno vacunal en cada pocillo, en 50 
μL de tampón de recubrimiento (0,15 M Na2CO3, 0,35 M NaHCO3, pH 9,6) por 2 horas, luego 
las placas se lavaron cinco veces con tampón de lavado (1x PBS plus, 0,05% Tween-20) y 
fueron bloqueados con 200 μL de tampón de bloqueo (1x PBS, 1% BSA) y dejados durante la 
noche a 4°C. Posteriormente, las placas se lavaron cinco veces con tampón de lavado y fueron 
incubadas con 150 μL de suero diluido a 1:250 en tampón de dilución (1x PBS, 0,05% Tween-
20, 0,1% BSA) durante 2 horas a 37 ° C. Después de eso, las placas se lavaron cinco veces con 
tampón de lavado e incubaron con 150 μL de inmunoglobulinas de conejo anti IgG, de ratón 
conjugado con inmunoperoxidasa (HRP), en una dilución de 1:5.000 en tampón de dilución a 
37 ° C. Finalmente, las placas fueron lavadas y reveladas con 150 μL de 1-Step ™, TMB 
ELISA (Pierce Chemical Company) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción 
se detuvo con 150 μL de 1,5 M H2SO4 y la absorbancia se leyó a 450nm. 
 
 
 
 
 
 12 
Preparación de las muestras histológicas 
Los animales fueron sacrificados mediante la administración inhalatoria de CO2. Luego de la 
eutanasia, se extrajeron quirúrgicamente las gónadas de los ratones inmunizados machos y 
hembras. Para realizar el posterior análisis anátomo-histológico de los ovarios, estos fueron 
fijados en solución de formalina tamponada al 10% (v/v), sometidos a técnica estándar, 
procesadas en un gradiente ascendente de alcoholes en un procesador de tejidos con vacío 
(Leica TP1020). Cortes de 5 µm de espesor fueron montados y teñidos con hematoxilina-
eosina, los cuales se visualizaron en un microscopio óptico para evaluar el estado del 
parénquima gonadal. 
Después del sacrificio, también fue removido el cráneo de los animales inmunizados, el cual 
luego fue fijado en paraformaldehído 2% + glutaraldehído 0.2% en tampón fosfato 0.1 M. 
Posteriormente, los cráneos fueron descalcificados con solución de descalcificación (ácido 
fórmico al 10% + citrato de sodio al 5%, en una relación 1:1.), luego los cerebros fueron 
lavados con PBS para eliminar el fijador y sometidos a la técnica de rutina, realizando un 
gradiente ascendente de alcoholes e inclusión en parafina. Finalmente los cerebros incluidos en 
parafina fueron sometidos a 30 cortes transversales sucesivos en la zona de interés (cortes 
transversales aproximadamente 20 mm craneal al cerebelo, realizando los cortes sucesivos 
hacia craneal), de 5 m utilizando un micrótomo y montadas sobre portaobjetos de vidrio. 
 
Inmunohistoquímica 
Para la inmunohistoquímica se utilizó el “kit” comercial UltraVision LP Large Volume 
Detection System HRP Polymer (Thermo scientific), siguiendo las indicaciones del fabricante. 
Las muestras fueron lavadas con PBS y rehidratadas. Luego, fueron incubadas por 10 minutos 
en peróxido de hidrógeno al 3% y luego en la solución de bloqueo Ultra V Block (Thermo 
scientific) (suero bovino con albúmina 4%, Triton 0,4% X100 en PBS) por 5 minutos. 
Posteriormente, lasmuestras fueron incubadas por 20 minutos con el anticuerpo primario anti-
GnRH-I (Santa Cruz Biotechnology, Inc) en una dilución de 1:20 en solución de bloqueo a 
temperatura ambiente, lavadas e incubadas con el Polímero HRP (Anticuerpo secundario 
asociado a enzima peroxidasa, Thermo scientific) durante 15 minutos. Luego, fueron lavadas e 
incubadas con el cromógeno DAB (Tecnolab) por 20 minutos. Finalmente, los cortes fueron 
lavados, teñidos con hematoxilina como tinción de contraste, deshidratados, montados y 
cubiertos utilizando el medio de montaje Neo-Mount (Merck Millipore). 
Todo este procedimiento fue realizado en el laboratorio multidisciplinario de la Facultad de 
Ciencias Veterinarias de la Universidad Andrés Bello. 
 13 
Análisis de las muestras histológicas 
Las muestras de ovarios y cerebro fueron analizadas y fotografiadas en un microscopio Nikon 
eclipse E400 con una cámara Nikon Digital Sight DS-5MC y analizadas con el software Nis-
Elements BR versión 3.0. 
El análisis de las muestras se basó en la identificación y evaluación de ciertos parámetros 
relacionados con la funcionalidad del tejido a evaluar comparados con los animales controles 
sin inmunizar. 
Para evaluar el tejido gonadal, se analizó el número de folículos en diferentes estadios de 
desarrollo folicular y el número de cuerpos lúteos presentes en 20 cortes consecutivos del 
parénquima ovárico. 
Para evaluar el tejido encefálico se compararon las muestras de los animales inmunizados con 
las de los animales control, evaluando la marcación de células positivas a GnRH-I en la zona 
hipotálamo-hipofisiaria mediante 30 cortes seriados de un espesor de 5 µm. 
 
Análisis estadístico 
Para el análisis de los resultados obtenidos en relación a los títulos de inmunoglobulinas, se 
utilizaron las siguientes pruebas no paramétricas: 
- Mann-Whitney de dos colas: Para la comparación entre cada grupo experimental y el 
grupo control. 
- Kruskal-Wallis: Para evaluar diferencias entre los tres grupos. 
 
El software utilizado para realizar estos análisis fue el Graph Pad Prism. Las diferencias fueron 
consideradas significativas con un p< 0,05. 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
Generación de micropartículas de quitosano 
El tamaño de las micropartículas de quitosano obtenidas fue entre 929,5 y 1001,8 nm, con 
un promedio de 910,5 nm. El potencial zeta de las micropartículas fue de entre 36,19 y 
36,63 mV, con un promedio de 34.95 mV. En la figura 1 se muestran las fotografías 
obtenidas de la microscopía electrónica de barrido de las micropartículas de quitosano 
generadas. 
 
 14 
 
 
Títulos de anticuerpos específicos en los animales inmunizados 
Tal como se muestra en la figura 2, la inmunización con la proteína recombinante GnRXG/Q 
 
Inmunidad específica inducida por la vacunación 
La vacunación de los animales indujo un alza importante en la producción de inmunoglobulinas 
IgG (Figura 2A), IgG isotipo 1 (Figura 2B) e IgG isotipo 2a (Figura 2C) específicas contra el 
antígeno GnRXG/Q, esta respuesta fue significativa luego de la primea vacunación, 
,manteniéndose alta durante los 220 días del estudio. Luego, para determinar la generación de 
inmunogenicidad cruzada debida a la vacunación, se determinó la producción de IgG específica 
contra la hormona nativa GnRH-I. Como se observa en la figura 2D, desde el día 15 post 
inmunización se observaron altos niveles de IgG específica contra la hormona GnRH-I, que se 
hicieron mayores desde el día 45, es decir, después de la revacunación realizada el día 30 del 
ensayo. Esto indica que luego de la revacunación, se indujo una respuesta inmune más potente y 
duradera contra la hormona nativa. En todos los casos se encontraron diferencias significativas 
entre ambos grupos experimentales y el grupo control (p≤0.01), pero no se encontraron 
diferencias estadísticamente significativas entre grupos experimentales. 
 
Figura 1. Fotografía de micropartículas obtenida mediante SEM con un aumento de 1700X (A 
y B) y 3300X (C). 
 15 
 
 
 
 
 
 
 
Por lo tanto, el uso de quitosano soluble y en micropartículas como estrategia adyuvante, fue 
eficiente en la inducción de inmunogenicidad específica contra el antígeno GnRXG/Q, lo que 
coincide con resultados obtenidos por otros investigadores, donde el quitosano soluble 
(Seferian y Martinez 2001; Zaharoff et al., 2007; Saenz et al., 2009) y en micropartículas 
(Davis 2006; Jiang et al., 2008) indujo una respuesta inmune específica potente contra distintos 
antígenos vacunales. Además, en concordancia con lo descrito por otros investigadores 
(Seferian y Martinez 2001; Zaharoff et al., 2007), el quitosano indujo una respuesta de tipo 
mixta Th1/Th2, con producción de IgG1 asociada a una respuesta de tipo Th1 o celular e 
IgG2a, asociada a una respuesta de tipo Th2 o humoral (Abbas, 2012). Además, la vacunación 
fue capaz estimular una inmunogenicidad cruzada, es decir, indujo la producción de 
anticuerpos específicos contra la hormona nativa GnRH-I, similar a los observado por Sáenz et 
Figura 2. IgG (A), IgG1 (B) e IgG2a (C) contra el antígeno GnRXG/Q y niveles de IgG 
contra la hormona nativa GnRH-I (D) en animales inmunizados usando micropartículas de 
quitosano (▲) y quitosano soluble (●) como adyuvante, en relación a los animales control 
(■). Fue utilizado un pool de sueros de cada grupo (n=3). Las flechas indican los días en 
que se realizaron las inmunizaciones (1 Y 30). Los datos están expresados en valores 
promedio de densidad óptica ± DS. El asterisco indica diferencias significativas (*) p≤0.01. 
 
 16 
al., (2009) usando quitosano soluble como adyuvante para el bloqueo inmunológico de la 
hormona GnRH-I. En relación a esto, se pudo observar que los títulos de anticuerpos contra el 
antígeno recombinante aumentaron considerablemente desde la primera vacunación, en 
cambio, los anticuerpos específicos contra la hormona nativa aumentaron preferentemente 
luego de la revacunación, lo que indica que la respuesta contra la proteína nativa requiere de la 
revacunación para la generación de células de memoria que permitan una respuesta potente y 
duradera. 
 
Cambios histológicos gonadales en los animales vacunados 
Se realizó el conteo de los folículos y cuerpos lúteos claramente definidos en el parénquima 
ovárico, analizando 20 cortes consecutivos. En dicho análisis, se pudo determinar que en el 
caso de las hembras inmunizadas con la formulación que usó quitosano como adyuvante, tanto 
en la formulación soluble como en micropartículas existe un menor número de folículos en 
estadíos avanzados de desarrollo o antrales, predominando la presencia de folículos en estadíos 
tempranos de desarrollo o folículos primarios, en relación al grupo control (tabla 1). En 
relación a la presencia de cuerpos lúteos, se encontró una disminución del tejido luteal 
claramente definido en los ovarios de los animales inmunizados con quitosano soluble como 
estrategia adyuvante (tabla 1). 
Las observaciones realizadas en el tejido gonadal de los animales vacunados se ven 
representadas en las figura 3, 4 y 5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 17 
Tabla 1: Conteo visual de folículos antrales y cuerpos lúteos claramente definidos observados 
en el parénquima ovárico en los distintos grupos experimentales. Los resultados representan 
el promedio del conteo realizado a partir de los distintos cortes histológicos de ovarios de los 
animales pertenecientes a los tres grupos en estudio. 
 
Grupo Experimental Folículos antrales o 
preovulatorios 
Cuerpos lúteos 
Quitosano Soluble 1 2 
Micropartículas de 
Quitosano 
3 5 
Grupo Control 6 10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Cortes de ovarios de hembras del grupo control, inoculadas solo con el adyuvante, 
en ausencia del antígeno. Las flechas negras indican folículos en estadíos tardíos de 
desarrollo o antrales y las flechas amarillas indican tejidoluteal en el parénquima ovárico. 
Tinción H/E 40x. A, B, C y D corresponden a distintos animales del grupo control. 
 
 18 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Cortes de ovarios de hembras inmunizadas con la proteína recombinante 
GnRXG/Q y quitosano soluble como adyuvante. Las flechas negras indican folículos en 
estadíos tardíos de desarrollo o antrales y las flechas amarillas indican tejido luteal en el 
parénquima ovárico. Tinción H/E 10x (A, C y D) 40x (B). A, B, C y D corresponden a 
distintos animales del grupo inmunizado con quitosano soluble. En A y D se observa atrofia 
ovárica, sin presencia de folículos antrales ni de cuerpos lúteos claramente definidos en el 
parénquima ovárico. 
 
 19 
 
 
 
 
 
 
 
Tal como se ha observado en otros estudios (Hsu et al., 2000), el bloqueo inmunológico de la 
hormona GnRH-I induce cambios degenerativos en los ovarios de las hembras inmunizadas. 
En este sentido, en el presente estudio se observó que el uso de quitosano soluble como 
estrategia adyuvante indujo mayor atrofia ovárica que la estrategia de micropartículas de 
quitosano, es decir, la formulación de quitosano soluble resultó más eficiente en el bloqueo de 
la actividad ovárica de los animales inmunizados. 
Sin embargo, es importante considerar en futuros estudios, la realización de la sincronización 
reproductiva de las hembras antes de la vacunación, lo que facilitaría de forma importante los 
análisis posteriores realizados en el tejido ovárico y eventualmente en los niveles de 
progesterona o estrógenos sexuales séricos, principalmente, debido a que el ciclo reproductivo 
Figura 5. Cortes de ovarios de hembras inmunizadas con la proteína recombinante 
GnRXG/Q y micropartículas de quitosano como adyuvante. Las flechas negras indican 
folículos en estadíos tardíos de desarrollo o antrales y las flechas amarillas indican tejido 
luteal en el parénquima ovárico. Tinción H/E 40x (A y D) y 10x (A y B). A, B, C y D 
corresponden a distintos animales del grupo inmunizado con micropartículas de quitosano. 
 20 
de los ratones hembras es de 4 a 5 días en promedio (Baligar y Kaliwal, 2002), lo que hace 
difícil realizar comparaciones con exactitud, ya que es posible encontrar a las hembras en 
distintas etapas del ciclo reproductivo. 
 
Cambios histológicos hipotalámico-hipofisiarios en los animales inmunizados 
Esta técnica permitió conocer a nivel celular la localización de la proteína GnRH-I en 30 cortes 
consecutivos del tejido hipotalámico-hipofisiario, para lo cual se utilizó un anticuerpo 
específico contra la hormona GnRH-I (Santa Cruz Biotechnology, Inc). 
La hormona GnRH-I se expresa en distintos órganos diferentes al encéfalo, entre ellos el 
intestino (Huang et al., 2001; Yao et al., 2003), por lo cual en primer lugar se determinó la 
expresión de GnRH-I en la lámina propia de intestino delgado como control positivo (figura 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Corte de intestino delgado de ratón sometido a 
inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti GnRH-I. 
Las flechas muestran las células positivas. Tinción de 
contraste Hematoxilina 40x. 
 
 21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Cortes de encéfalo de ratones del grupo control, inoculados solo con la 
formulación adyuvante, sometidos a inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti 
GnRH-I. Las células marcadas en color marrón corresponden a células positivas en la 
zona de interés. Tinción de contraste Hematoxilina (40X). A, B, C y D corresponden a 
cortes histológicos de diferentes animales pertenecientes al grupo control. 
 
 22 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Cortes de encéfalo de ratones del grupo inmunizado con el antígeno 
recombinante GnRXG/Q y quitosano soluble como adyuvante, sometidos a 
inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti GnRH-I.. Las células marcadas en 
color marrón corresponden a células positivas en la zona de interés. Tinción de contraste 
Hematoxilina (40X). A, B, C y D corresponden a cortes histológicos de diferentes 
animales pertenecientes al grupo control. 
 
 23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Al analizar las células positivas a GnRH-I en los animales pertenecientes a los distintos grupos 
experimentales, se observó marcaje positivo en los tres grupos de estudio (figuras 7, 8 y 9). Al 
analizar las muestras de forma cualitativa, se observó mayor cantidad de células positivas en 
los cortes de animales inmunizados con el antígeno vacunal y quitosano soluble que en los 
animales inmunizados con micropartículas de quitosano como adyuvante. Además, los cortes 
de animales de los grupos control (inoculados solo con el adyuvante, sin el antígeno vacunal) 
presentaron el menor número de células positivas a GnRH-I, en relación a los dos grupos de 
animales vacunados con el antígeno GnRXG/Q. Esto podría explicarse, debido a que la vacuna 
indujo alteraciones en el parénquima ovárico, lo que induciría una disminución en la 
producción de esteroides gonadales, inhibiendo probablemente el feedback negativo que estos 
realizan a hipotálamo, generándose así una mayor producción de la hormona GnRH-I a nivel 
Figura 9. Cortes de encéfalo de ratones del grupo inmunizado con el antígeno 
recombinante GnRXG/Q y micropartículas de quitosano como adyuvante, sometidos a 
inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti GnRH-I.. Las células marcadas en 
color marrón corresponden a células positivas en la zona de interés. Tinción de contraste 
Hematoxilina (40X). A, B, C y D corresponden a cortes histológicos de diferentes 
animales pertenecientes al grupo control. 
 
 24 
hipotalámico, que no se encuentra sometido al control natural de su secreción, dado por la 
producción de esteroides gonadales en los animales no inmunizados (Clarke y Pompolo, 2005; 
Turkstra y Meloen, 2006). 
 
 
 
 
 
 
Si bien se realizó la cuantificación de células positivas en la zona de interés, se encontraron 
muchas diferencias entre los distintos cortes de los diferentes animales, por lo cual no se pudo 
realizar un análisis cuantitativo ni evaluar la significancia estadística de los resultados 
obtenidos (figura 10). Debido a la dificultad de obtener cortes encefálicos exactamente en la 
misma zona, que permitan realizar una cuantificación objetiva de las células positivas en los 
distintos animales de los diferentes grupos experimentales, en futuros estudios que utilicen la 
determinación de GnRH-I mediante inmunohistoquímica, esta técnica debe ser necesariamente 
previamente estandarizada en ratones, principalmente en cuanto a las zonas específicas y 
número de cortes a analizar, para poder realizar un análisis cuantitativo certero de los 
resultados obtenidos. Además, para entregar más exactitud y objetividad a estos análisis, sería 
recomendable que en estudios futuros donde se quiera determinar la expresión de GnRH-I en 
encéfalo, la técnica de inmunohistoquímica sea realizada en conjunto con otro método de tipo 
cuantitativo, como la reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa o en tiempo real 
(qPCR), ya que la determinación de GnRH-I mediante qPCR ya ha sido estandarizada y 
realizada con éxito (Giacobini et al., 2007). Esto permitiría hacer un análisis cuantitativo y más 
certero de los cambios en la expresión de dicha hormona en los animales inmunizados. 
 
0
100
200
300
400
500
600
n
° 
cé
lu
la
s 
p
o
si
ti
va
s 
Grupos de inmunización 
Conteo células positivas IHQ 
Contr
ol
Chi-
Sol
Figura 10. Número de células positivas a GnRH-I en los cortes de encéfalo de los 
animales control, vacunados con el antígeno GnRXG/Q y quitosano soluble (Chi Sol) o 
micropartículas de quitosano (Chi Mp) como adyuvante. 
 
 25 
CONCLUSIONES 
 
1. La vacunación con el antígeno GnRXG/Q usando quitosano soluble y micropartículas 
de quitosano, induce una respuesta inmune específica contra el antígeno vacunal en los 
animales inmunizados,a partir de la primera vacunación. 
2. La vacunación con el antígeno GnRXG/Q con ambas formulaciones adyuvantes induce 
una inmunogenicidad cruzada contra la hormona GnRH-I en los animales inmunizados, 
siendo esta significativa luego de la revacunación. 
3. El perfil de respuesta inmune específica contra el antígeno GnRXG/Q y contra la 
hormona nativa GnRH-I fue mixta, de tipo Th1/Th2 dado por el isotipo de 
inmunoglobulinas expresado. 
4. Disminuye el número de folículos preovulatorios y de cuerpos lúteos en el parénquima 
ovárico de los animales inmunizados, siendo esta atrofia ovárica más evidente en el 
caso del quitosano soluble como estrategia adyuvante. Sin embargo, se sugiere que en 
futuros estudios se realice la sincronización de las hembras antes de la vacunación para 
poder determinar de forma fehaciente los niveles de esteroides gonadales y compararlos 
con los cambios histológicos observados. 
5. Existe un mayor número de células positivas a GnRH-I en la zona hipotalámico-
hipofisiaria de los animales inmunizados en relación al grupo control, sin embargo, 
estas diferencias no pueden ser analizadas en términos cuantitativos, por lo que se 
sugiere que en futuros ensayos se incluya una técnica cuantitativa, como el qPCR para 
hacer más objetivos dichos resultados y poder realizar un análisis estadístico de los 
cambios en la expresión de GnRH-I en los animales inmunizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 26 
 
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