Manual_de_procedimientos_inmunologia_apl

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Presentación 
Este manual pretende ser una herramienta útil para el desarrollo académico y profesional de los estudiantes que cursen la Unidad de Aprendizaje Inmunología Aplicada, conozcan el manejo correcto de los productos biológicos y fomentar las buenas prácticas de laboratorio de inmunología así como capacitar a los alumnos para el manejo de los distintos materiales e instrumentos que apoyan la construcción de conocimientos acerca de los órganos, células y moléculas que integran el sistema inmunológico. 
En cada práctica se describen los aspectos teóricos que se han considerado más importantes e indispensables para la interpretación de los resultados de cada prueba, las habilidades que los estudiantes deben poner en práctica, los materiales que se usarán para desarrollar las técnicas que se proponen, los datos que deben tenerse presentes al interpretar los resultados, los valores normales y las referencias bibliográficas que fueron empleadas para elaborar cada uno de los instructivos. 
No debe sorprender al lector que los procedimientos técnicos usados en este manual tengan un propósito distinto al que se persigue al aplicarlos en el laboratorio clínico. Aquí, la finalidad central es que el estudiante obtenga aprendizajes significativos sobre los componentes del sistema inmunológico, sobre su función y también sobre los métodos que se usan rutinariamente para detectarlos. Los propósitos pueden ser diversos. 
Competencias 
a) Competencias específicas del perfil profesional 
 Aplica métodos y esquemas de análisis empleados en el estudio de diversas muestras biológicas, e interpreta con claridad los resultados 
 Obtiene y procesa diversas muestras del organismo humano para determinar parámetros bioquímicos, químicos y biológicos mediante métodos de laboratorio pertinentes a fin de contribuir a la evaluación del estado de salud de las personas, respetando los códigos de calidad y ética aplicables 
b) Competencia de la UAp 
Comprende la función e interacciones de los mecanismos efectores inmunitarios tisulares, celulares o moleculares y el fundamento de los métodos de laboratorio empleados para medir parámetros del sistema inmune en diversas muestras biológicas, con el fin de valorar el estado de su funcionamiento, siguiendo las normas de bioética, bioseguridad y de control de calidad aplicables en un manejo responsable.
Medidas de seguridad 
La sangre y sus derivados son de los biológicos más peligrosos a que puede estar expuesto el personal que trabaja en un laboratorio clínico. Por tal razón, se proponen normas que deben cumplirse cuando se está en el laboratorio o se está trabajando con muestras de sangre o reactivos como los sueros control, que pueden ser el medio para la transmisión de infecciones por virus de la hepatitis o virus de la inmunodeficiencia humana. El personal del laboratorio, en general, debe evitar el contacto indebido con cualquier de los reactivos que se usan en las distintas determinaciones que se hacen en inmunología, evitando especialmente el contacto con la piel, mucosas y heridas abiertas o úlceras. Así se evitaran riesgos para la salud. 
A continuación se propone una serie de normas mínimas de seguridad para preservar la salud de los estudiantes y del personal del laboratorio, pero también para generar el hábito de trabajar adecuada y profesionalmente. 
Precauciones que deben tenerse en el laboratorio 
1. Usar bata blanca, manga larga y abotonada. 
2. No comer, beber, fumar, maquillarse, ni llevarse cosas a la cara. 
3. No humedecer etiquetas con la lengua, morder los lápices ni llevarse objetos a la boca. 
4. Usar guantes al manejar muestras biológicas o al trabajar con reactivos para diagnóstico. 
5. Limpiar inmediatamente los reactivos y muestras de sangre que se derramen sobre la mesa de trabajo o el piso, con una solución de hipoclorito de sodio al 1% y, de preferencia, sumergir en la misma solución el material usado (algodón, franela). 
6. Mantener una adecuada ventilación del área de trabajo, para evitar la inhalación de compuestos volátiles. 
7. Usar siempre agujas y jeringas desechables y no hacer con ellas más de una punción. 
8. Cubrir las agujas con su protector plástico después de usadas y desecharlas en el recipiente rígido indicado. 
9. Evitar salpicaduras o formación de aerosoles. 
10. Esterilizar con calor húmedo (autoclave a 121.5 °C) aquellos materiales que consideren susceptibles de transmitir alguna infección. Usar hipoclorito de sodio al 1% (con los líquidos a desechar) en líquidos que no contengan ácidos. Deje trascurrir 30 minutos para que ocurra la desinfección. 
11. Poner el material empleado en la manipulación de biológicos en benzal, fenol o hipoclorito de sodio al 5%. 
12. Lávese meticulosamente las manos después de cada prueba. 
13. En caso de accidente (derrame de sangre o reactivos, contacto con ellos, etc.) avisar al profesor o encargado del laboratorio. 
14. Manejar todos los sueros (controles y muestras) como capaces de trasmitir hepatitis, infección por VIH, etc. 
15. Aplicar adecuadamente la NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo. 
Práctica 1. Inflamación
Introducción 
Cuando los patógenos superan las barreras externas de la inmunidad innata como la piel y mucosas, la infección o lesión tisular resultante puede inducir una compleja cascada de fenómenos conocida como respuesta inflamatoria (Goldsby, et. al., 2014). 
El primer suceso en la inflamación aguda es la liberación de factores quimiotácticos, actuando como señales químicas que activan moléculas de adhesión (selectinas) en los capilares locales. Esto genera un movimiento más lento para los leucocitos circulantes por los capilares. La liberación de interleucinas (IL-8) actúa atrayendo los polimorfonucleares (PMN) que transitan por el sitio y activa las adhesiones entre integrinas de superficie generando uniones firmes con el endotelio seguido de la extravasación del PMN a los tejidos donde se lleva a cabo la inflamación. La liberación de histamina (de los mastocitos), ácido araquidónico y prostaglandina completa el proceso de inflamación y dolor. Ante la primera interacción entre huésped y patógeno, las señales químicas movilizan las células y mediadores del sistema inmunológico al sitio inflamado, para llegar a una resolución del daño generado (Ryan & Ray, 2011). 
La respuesta de fase aguda es inducida por señales que viajan por la sangre desde sitios de lesión o infección. Las citosinas proinflamatorias e inflamatorios Factor de Necrosis Tumoral (TNF- α), IL-1 e IL-6 son las principales señales que inducen la fase aguda; actúan sobre los hepatocitos en el hígado activando la secreción de proteínas de respuesta de fase aguda (proteínas PRA). Algunas de las proteínas PARA son la proteína C reactiva (PCR), se encuentra en bajas concentraciones en sangre periférica. El aumento de las concentraciones de PCR proporciona una función protectora en infecciones, facilita la activación del complemento, actúa como una opsonina, dentro del hallazgo clínico la concentración circulante de PCR indica la magnitud del proceso de la inflamación (Goldsby, et. al., 2014).
 Las respuestas inmunitarias e inflamatorias por lo general se limitan por sí solas, de modo que una vez que el agente patógeno y el tejido dañado son eliminados, la inflamación por lo general disminuye y los tejidos sanan. La persistencia de agentes patógenos o de sustancias perjudiciales pueden causar inflamación crónica y daño tisular (Goldsby, et. al., 2014). 
La inflamación crónica agrupa las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Si se presenta una fase aguda, en general no se percibe y la infiltración celular está compuesta de linfocitos y macrófagos, con un número relativamente pequeño de PMN. En términos generales se asocia con patógenos de lento crecimiento, como las micobacterias, hongos y parásitos, para los que la inmunidad mediada por células (Th1) es la defensaadaptativa principal. Muchos de estos patógenos tienen mecanismos que les permiten endocitar macrófagos no activados y multiplicarse. Si las células T activan efectivamente a los macrófagos, cesa la multiplicación, y la inflamación y lesión son mínimas. En caso contrario, la multiplicación y la inflamación crónica continúan, generando un granuloma, siendo un indicativo de un componente de hipersensibilidad destructiva en la inflamación (Ryan & Ray, 2011). 
Habilidades 
· Identifica la presencia de inflamación mediante técnicas de laboratorio
· Sigue correctamente un protocolo para asegurar la confiabilidad del resultado
· Interpreta correctamente los resultados de las pruebas de laboratorio para el diagnóstico de inflamación.
Material y métodos 
A) Equipo 
· Microscopio óptico 
· Centrífuga 
· Agitador mecánico
· Clitómetro de flujo hemático
B) Material 
· Jeringa de 3 ml 
· Torniquete 
· Torundas con etanol 
· Tubos de 4 ml con anticoagulante (EDTA) 
· Portaobjetos 
· Cánulas
· Tubos de wintrobe
· Gradilla pata tubos de wintrobe
· Cubreobjetos 
· Gasas 
· Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
· Gradilla para tubos de ensaye
· Pipetas automáticas de 1000 µl
· Pipetas Pasteur
· Placas de fondo negro
· Hisopos estériles
C) Soluciones, biológicos y reactivos 
· Reactivo de látex para proteína C reactiva
· 100 ml de solución de wright
· 250 ml de buffer de fosfatos de pH 6.4 para tinción de Wright 
· 100 ml de solución de cristal violeta para tinción de Gram
· 100 ml de lugol para tinción de Gram 
· 100 ml de solución de safranina para tinción Gram
· 100 ml de alcohol-acetona para tinción de Gram
· 50 ml de solución salina de NaCl al 0.85%. 
· 50 ml de agua destilada
· 5 ml de sangre periférica con EDTA 
· 50 ml de orina de chorro medio de la primera orina de la mañana 
· Muestra de exudado faríngeo
· Suero 
Procedimientos 
Toma de muestra 
1. Tomar la muestra de exudado faríngeo a partir de una persona que refiera molestias de garganta, sin tratamiento con antibióticos o antiinflamatorios, sin aseo bucal en ayunas, haciendo uso de hisopos estériles. 
2. Descargar la muestra haciendo rotar el hisopo sobre un portaobjetos limpio. La rotación debe ser suave, sin friccionar vigorosamente, con el objeto de mantener lo más intacta posible la estructura celular. 
3. Fijar inmediatamente los extendidos al calor y teñir por la técnica de Gram y/o wright 
Tinción de Wright
1. Bañar la preparación con tinción de Wright e incubar durante 2 o 3 minutos 
2. Añadir tampón de fosfato (pH 6.4) y agitar suavemente la mezcla y dejar en reposo durante 2 o 3 minutos.
3. Lavar con agua destilada
4. Secar al aire y observar el extendido al microscopio para hacer el conteo de células.
NOTA: Si la preparación de Wright se observa sedimentada se filtra antes de su uso.
Tinción de Gram
1. Agregar cristal violeta en la zona donde se descargó la muestra con el hisopo y dejar durante 1 minuto.
2. Realizar lavado con agua común sin que el chorro toque directamente la muestra para quitar excedente del colorante.
3. Agregar lugol en la zona de la muestra y dejar durante 1 minuto.
4. Realizar nuevamente el lavado con agua común para quitar excedente del colorante.
5. Agregar alcohol-cetona para decolorar la tinción durante 10 segundos y realizar el lavado con agua común inmediatamente.
6. Agregar safranina en la zona de la muestra durante 1 minuto y realizar el lavado con agua común.
7. Dejar secar la muestra, posterior se agrega aceite de inmersión y observar por microscopia a 100 X. 
Examen del sedimento urinario 
1. Homogenice la muestra de orina y llene con ella un tubo de 13 x 100 mm. Centrifugue a 1500 rpm, durante 5 min. 
2. Con una pipeta Pasteur tomar 1 ml del fondo del tubo homogenizar y colocar 500 µl en un portaobjetos, colocar el cubreobjetos para observar el sedimento.
2. Elimine el sobrenadante. Resuspenda el sedimento en la cantidad de orina que le haya quedado. Con esta suspensión haga una preparación entre porta y cubre objetos. 
3. Observe al microscopio con objetivo de 40X en busca de filamento de mucina, cristales, cilindros, leucocitos, eritrocitos, epiteliales y m.o. Saque el promedio de leucocitos observados en un total de 10 campos y repórtelos en No. / Campo. 
Técnica de la proteína C reactiva
Prueba cualitativa
1. Todos los reactivos y especímenes deben estar a temperatura ambiente antes de su uso.
2. Colocar una gota (50 µl) del control positivo en el campo uno de la laminilla de fondo negro. Colocar una gota (50 µl) del control negativo en el campo dos.
3. Los campos restantes son usados para las muestras, colocando una gota.
4. Con suavidad resuspender el reactivo PCR, agregando una gota a cada campo.
5. Con un palillo extender cada una de las mezclas.
6. Rotar la lámina durante tres minutos e inmediatamente leer con luz baja.
7. Interpretación: una reacción negativa se indica por la suspensión uniforme sin muestras de aglutinación en la mezcla de reacción.
Prueba cuantitativa
1. Todo reactivo y especímenes debe estar a temperatura ambiente antes de su uso.
2. Con el buffer salino de glicina diluido 1:20 realizar diluciones del suero: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, según se requiera.
3. Colocar una gota de control negativo, control positivo en cada dilución en su lugar respectivo dentro de la placa de reacción.
4. Resuspender con suavidad el reactivo PCR y agregar una gota a cada campo.
5. Usar un aplicador para extender cada mezcla.
6. Rotar la lámina por tres minutos y leer inmediatamente bajo luz directa.
7. Interpretación: Una reacción positiva se indica por la aglutinación de la mezcla de reacción.
NOTA: Dependiendo la intensidad de la aglutinación por método cualitativo se valora la dilución máxima.
Técnica de velocidad de sedimentación globular
1. Extraer sangre venosa (1-2 ml) y homogenizar con anticoagulante.
2. Llenar con sangre el tubo de Wintrobe hasta donde se indique.
3. Asegurarse que el tubo quede en una posición de 90° con respecto a la superficie.
4. Tener cuidado con vibraciones o cualquier otro factor que pueda modificar su desarrollo.
5. Dejar transcurrir una hora.
6. Leer la sedimentación eritrocitaria, se expresa en mm/hrs.
Observaciones 
Resultados 
a) Interpretación 
· Valoración de los extendidos: Para que los extendidos se consideren representativos, deberá considerarse el número de células epiteliales, leucocitos y microrganismos presentes. Criterios: Se considerará que el paciente cursa con un proceso inflamatorio cuando en la preparación se encuentre un promedio de 8 a 10 leucocitos por campo de gran aumento, en por lo menos 10 campos leídos, en este caso la respuesta inflamatoria exudativa (RIE) se considerará escasa, a partir de esta referencia el analista reportará en términos relativos: escaso, moderado ó abundante. 
· En el sedimento urinario un número de 0-8 leucocitos por campo es considerado como normal (OMS, 1983). 
b) Reporte 
 El informe de laboratorio deberá contener una descripción detallada de todos los elementos y microorganismos encontrados e indicar su cantidad (pueden emplearse los términos de cantidad: escaso, moderado y abundante). La papeleta de resultados incluirá: 
Resultados de Laboratorio 
Nombre: ____________________________ Edad: ______ Sexo: ____ No. REG: ______________ 
Examen de laboratorio practicado: ____________________________________________________ 
Resultados 
 Células: especificar el tipo y número de células observadas 
 Microorganismos: Anotar el mayor número de características posibles de los m.o. que logre detectar en la muestra. (Agrupación, morfología y tipo de Gram)
 Intensidad de la reacción inflamatoria No. y tipo de leucocitos por campo, dependiendo de la muestra analizada.
 Valores de referencia por cada tipo de prueba.
____________________________________________
Practicó
Lugar y fecha _______________________________________
Análisis de los resultados 
Revise con sus compañeros los resultados obtenidos y analice los posibles errores del procedimiento. 
a) Errores pre-analíticos 
b) Errores analíticos 
c) Errorespost-analíticos 
¿Se pueden mejorar los resultados? ¿Qué sugiere para ello? ¿Tuvo dificultades para identificar las células que se encuentran presentes en la inflamación? ¿Podría hacerlo con mayor facilidad en ocasiones futuras en caso de ser no que información cree pertinente para mejorar? ¿Contaba usted con la información necesaria para identificar células que participan en la inflamación? 
Interpretación de resultados 
Conclusiones 
Referencias 
1. Goldsby RA., Kindt TJ., Osborne BA., Kuby J. (2014). Inmunología de Kuby. 7ª Edición. España: Editorial Mc Graw Hill. pp. 166-173. 
2. Ryan KJ., Ray CG. (2011). Microbiología Médica. 5ª Edición. EUA: Editorial Mc Graw Hill. pp. 21-22. 
Cuestionario 
1. ¿Qué es un exudado? 
2. ¿Cuáles son las células características de una inflamación aguda? 
3. ¿Cuáles son las proteínas de fase aguda de la inflamación? 
4. ¿Cuál o cuáles de ellas tienen utilidad en el diagnóstico por el laboratorio? 
5. Enlista las citocinas proinflamatorias. 
6. ¿Cuáles son las causas de la inflamación crónica? 
7. ¿Cuáles son las células características de inflamación crónica? 
8. Menciona los efectos sistémicos de la Inflamación 
Práctica 8. Detección de antígenos bacterianos: Reacciones febriles 
Introducción 
Durante el curso de una enfermedad infecciosa la respuesta inmune adaptativa es de vital importancia para el cuerpo humano en la formación de anticuerpos, que ayudan a combatir al agente infecciosos eficientemente contra organismos extracelulares, además de ser utilizados como biomarcadores contra microrganismos específicos para diagnosticar enfermedades. El aumento de los títulos de anticuerpos contra determinado microorganismo en suero de un paciente, indica que está infectado, estuvo infectado recientemente, o fue vacunado. El título o cantidad de anticuerpos se forma o aumenta lentamente a partir del séptimo día de evolución de la enfermedad, alcanza su máximo al vigésimo día y decae más tarde. Como regla general, las pruebas de aglutinación tienen mayor valor diagnóstico si se practican en forma seriada, para observar si el título de la aglutinación aumenta progresivamente (Fernández & Román, 1998). 
Las pruebas de reacciones febriles se mezcla el suero de un paciente con sospecha de enfermedad febril con los reactivos que contienen bacterias muertas (antígeno) de la misma especie que las causantes de la infección y, al reaccionar los antígenos con los anticuerpos correspondientes del paciente, se producen complejos antígenos-anticuerpos formando aglutinación. Las reacciones febriles, constituyen una serie de pruebas serológicas, para demostrar la presencia de anticuerpos aglutinantes contra bacterias productoras de tifoidea, paratifoidea, brucelosis y tifus exantemático (Fernández & Román, 1998). 
Las reacciones febriles son pruebas de aglutinación que buscan apoyar o descartar el diagnóstico de infecciones causadas por Salmonella typhi, Salmonella paratyphi y Brucella abortus, agentes etiológicos de infecciones comúnmente conocidas como Fiebre Tifoidea o Fiebre Ondulante, Paratifoidea y, Fiebre de Malta o Brucelosis respectivamente. Para esto se utilizan antígenos, que consisten de suspensiones bacterianas de cepas patógenas específicas que han sido muertas por procesos especiales que dejan íntegros los antígenos contra que reaccionan los anticuerpos producidos por el sujeto infectado (Zavala, et. al., 1994). Estos antígenos febriles son: 
 Antígeno “O” Salmonella typhi 
 Antígeno “H” Salmonella typhi 
 Antígeno Paratífico “A” 
 Antígeno Paratífico “B” 
 Antígeno Brucella abortus 
 Antígeno “Proteus OX-19” 
La aglutinación de células bacterianas con antisueros es una de las pruebas serológicas más antiguas de la inmunología práctica. Se inició como un método para el diagnóstico de las infecciones bacterianas y fue propuesta por Widal en 1896, tabla 1. En las pruebas de aglutinación bacteriana las células bacterianas desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos o bien, utilizando bacterias conocidas, pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente (Pasos, 2002).
Tabla 1. Origen de los antígenos usados en las reacciones febriles, enfermedad ocasionada por las bacterias y nombre de las pruebas de aglutinación.
Habilidades 
 Determina los títulos de anticuerpos producidos en contra de antígenos bacterianos a través de pruebas de aglutinación en placa. 
Material y métodos 
A) Equipo 
 Centrífuga 
 Microscopio óptico compuesto 
 Agitador de placas 
B) Material 
 Aplicadores de madera limpios (palillos) 
 1 placa de aglutinación con 6 lugares (círculos) 
 1 micropipeta de 5 a 20 μl 
 1 micropipeta de 10 a 100 μl 
 4 tubos de ensaye de 13 x 100 
 1 Jeringa desechable estéril de 3 ml 
 Puntas para micropipetas 
 Algodón (torundas en alcohol) 
C) Soluciones, biológicos y reactivos 
 Alcohol etílico al 70% 
 Solución salina fisiológica (SSF) 
 Suero lo más reciente, claro y limpio posible 
Antígenos Febriles: 
 Antígeno “O” Salmonella typhi 
 Antígeno “H” Salmonella typhi 
 Antígeno Paratífico “A” 
 Antígeno Paratífico “B” 
 Antígeno Brucella abortus 
 Antígeno “Proteus OX-19” 
Procedimientos 
Aglutinación en placa 
1) Los antígenos deben estar a temperatura ambiente, además deben homogeneizarse antes de realizar la prueba. 
2) Marcar la placa de aglutinación anotando el nombre del antígeno que se pondrá en cada uno de los 6 círculos. Antes de usarla debe estar perfectamente limpia. 
3) Mida 40 ul de suero (dilución 1:40) y deposite este volumen en cada uno de los seis círculos. 
4) Depositar una gota del antígeno correspondiente a cada volumen de suero colocado y mezclar con un aplicador limpio. 
5) Agitar la placa suavemente ya sea manualmente o con rotador mecánico a 120 rpm, durante 3 minutos, evitando que se mezcle el contenido de los círculos. 
6) Haga la primera lectura al microscopio en objetivo de 10X. Decida por el tamaño y la cantidad de grumos con cuál de los antígenos hubo aglutinación. 
7) Los antígenos que no den aglutinación serán inmediatamente reportados como negativos. 
8) Para los antígenos que hayan dado aglutinación, realizar la dilución 1:80 (20 ul de suero, más una gota del antígeno correspondiente). 
9) Repetir los pasos 5 y 6. 
10) Si cualquiera de los antígenos sigue dando aglutinación, continúe con las diluciones 1:160, 1:320 colocando 10 y 5 μl de suero respectivamente, decida cuál es la última dilución en la cual su muestra dio positiva. 
Lectura de los resultados. 
a) La lectura de los resultados se debe hacer al microscopio observando la aglutinación y valorándola en la forma siguiente: 
	Grado de aglutinación
	Valoración
	100%
	4 +
	75%
	3 +
	50%
	2 +
	25%
	1 +
	0%
	0
	
Las muestras que continuarán diluyéndose serán sólo aquéllas que tengan una aglutinación aproximada del 50 % o más para alguno de los antígenos usados en la prueba. 
Observaciones
Resultados 
Reporte de los resultados 
El título del suero se informa como la recíproca de la dilución más alta en la que todavía se observa aglutinación o simplemente como el valor de ésta. Por ejemplo 
Laboratorio de inmunología 
Resultado de pruebas inmunológicas 
NOMBRE______________________EDAD_____________SEXO________REG______ 
Examen de laboratorio practicado: Reacciones Febriles 
Antígenos Tifico “O” Positivo Dilución 1:160 (p.ej.) 
Tifico “H” Positivo Dilución 1:160 
Paratifico “A” Negativo 
Paratifico “B” Negativo 
Brucella abortus: Negativo 
Proteus OX-19: Negativo 
Lugar y fecha____________________________________________ 
______________________________________________ 
Nombre y firma del responsable 
Nota: Observe que cuando las muestras no presentan aglutinación con alguno de los antígenos no se anota el título. 
Análisis de resultados 
Revise con sus compañeros los resultados obtenidos y analice los posibles errores del procedimiento. 
a) Errores pre-analíticos 
b) Errores analíticos 
c) Errores post-analíticos 
¿Se pueden mejorar los resultados? ¿Cuáles pueden ser las fuentes de error en esteprocedimiento? ¿Qué factores pueden afectar una reacción de aglutinación?¿Tuvo dificultades para identificar la aglutinación del suero analizado? ¿Podría hacerlo con mayor facilidad en ocasiones futuras? ¿Contaba usted con la información necesaria para el desarrollo de la práctica y la interpretación adecuada de los resultados? 
Interpretación de resultados 
Conclusiones
Referencias 
 Fernández Tilapa G., Román Román A. (1998). Manual de laboratorio en Inmunología Clínica. 1ª edición. México: Lama editores. pp.63-67. 
 Zavala Trujillo Y, Nava Zavala A, Guerra Cáceres J, Quiroz Miranda C. “Brucelosis”. (1994). Infectious Disease Clinics of North America, 8 (1), 225-241. 
 Pasos Salazar NG. (2002). Manual de Laboratorio de Inmunología. Benemérita Universidad Autónoma De Puebla, Facultad De Ciencias Químicas. pp. 17-18. 
Cuestionario 
1. ¿De qué están compuestos los “grumos” que observó al microscopio? 
2. ¿Qué contenían los frascos de reactivos? 
3. ¿Qué tipo de aglutinación se da en esta prueba? 
4. Esquematiza la reacción antígeno anticuerpo. 
5. ¿Qué es el efecto prozona? y ¿Cómo puede afectar los resultados? 
6. ¿Por qué se dice que las reacciones febriles son poco específicas? 
7. ¿Cómo podemos determinar si la infección está activa o estamos detectando anticuerpos de memoria? 
Práctica 8. Diagnóstico serológico de Hepatitis Viral B 
La hepatitis es un término clínicopatológico muy inespecífico que abarca las lesiones en el hígado, la etiología más frecuente son las causadas por infecciones virales que abarca una gran variedad de grupos conocidos por virus de la hepatitis A, B, C, D y E que tienen como tropismos el hígado (Sánchez y Nogales, 2009). 
El Virus de la Hepatitis B (VHB) es un virus de DNA de 40-42 nm perteneciente a la familia Hepadenaviridae, posee un core central icosahédrico de 27 nm una de las formas más comunes de transmisión es por vía sanguínea, vía sexual, perinatal y por el canal de parto. El periodo de incubación del virus es altamente variable pero se estima que es de 75 hasta 180 días. La historia natural de la infección por VHB es altamente variada se puede presentar una etapa aguda donde puede o no presentar sintomatología, dentro de los síntomas agudos se encuentran cuadros ictéricos de ojos y piel, fatiga extrema, nauseas, vomito, dolor en el hipocondrio superior derecho. Por otra parte la infección crónica no presenta signos ni síntomas, es una enfermedad necroinflamatoria generando un daño irreversible como la cirrosis o hepatocarcinoma (Mc Mahon, 2009).
La progresión de la enfermedad varía según la presencia de diversos factores como son, genotipo viral, subgenotipo, mutaciones especificas del virus, predisposición genética del paciente etc. Como estrategia de prevención en 1991 la Organización Mundial de la Salud recomendó la incorporación de la vacuna VHB en México, y el 1999 se incorporó en el plan de inmunización en niños. Sin embargo esto no es suficiente para evitar el riesgo de infección que se presente en ocasiones futuras (Barrera, Cabrera, et al., 2009)
Para realizar el diagnostico de hepatitis viral tipo B no basta con la presencia de signos y síntomas ya que no puede identificar el tipo viral causante. Primero se realiza la identificación de la inflamación hepática en base a los signos y síntomas, posterior se realiza pruebas de laboratorio para identificar las principales alteraciones bioquímicas. Para el diagnostico serológico de VHB se utilizan diferentes marcadores virales (Sánchez y Nogales, 2009).
HBs Ag: Proteína codificada por el DNA viral, localizada en la superficie de la envoltura del virus.
HBc Ag: Proteína de la cápside icosahédrica.
HBe Ag: Proteína que ancla el DNA viral a la cápside. Su presencia es indicativo de replicación viral.
HBV DNA: Material genético especifico del virus. Su detección es mediante qRT PCR.
Anti-HBs: Anticuerpos con especificidad en contra de la envoltura de VHB
Anti-HBc: Anticuerpo con especificidad en contra de la cápside del VHB.
El perfil de marcadores serológicos en la infección aguda se utiliza para dar seguimiento al progreso de la infección. A las 6 semanas de la infección se detecta HBsAg y los marcadores de replicación viral como son HBeAg y VHB DNA. El diagnóstico de la infección aguda se establece con la detección de IgM Anti-HBc, en algunos casos se encuentra HBs Ag pero desaparece de la sangre cuando inician los síntomas. Durante el periodo de ventana suele disminuir la cantidad de HBs Ag y aumenta los títulos de Anti-HBs (Sánchez y Nogales, 2009).
La Guía de Práctica Clínica de la Secretaria de Salud en México ha determinado diversos estadios en base a los marcadores serológicos de la infección y el perfil bioquímico hepático.
Fase de portador inactiva: Ausencia de HBe Ag, bajos niveles de VHB DNA (< 14 copias/ml), niveles normales de ALT.
Fase crónica: Presencia o ausencia de HBe Ag, niveles persistentes o intermitentes de DNA de VHB (> 104 copias/ml) y de ALT, histológicamente se observa actividad necroinflamatoria.
Fase de Ventana: Disminución de HBs Ag y aumento de IgM Anti- Hbs.
Para realizar el diagnostico existen distintas métodos para la detección de los marcadores virales, ya sea por inmunoensayos cromatográfico de flujo lateral que contienen anticuerpos Anti-HBs Ag y reactivo de Oro coloidal activados con anticuerpos Anti-HB, detección de anticuerpos específicos de VHB por el método de ELISA ya sea de clase IgG o IgM e incluso ambos por ELISA recombinante. El diagnostico de VHB es importante debido que se puede prevenir la infección crónica y las futuras lesiones hepáticas (Barrera, Cabrera, et al., 2009).
Habilidades
Práctica 8. Diagnóstico serológico de Hepatitis Viral C
El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus de RNA de cadena sencilla, pertenece a la familia Flavoviridae, del genero Hepacavirus, posee un core icosahédrica y es un virus envuelto. La infección viral de la hepatitis viral tipo C se considera un problema de salud importante debido a que sus principales consecuencias es la inflamación necrosante causando cirrosis y carcinoma hepatocelular teniendo altas tasas de mortalidad. La Organización Mundial de la Salud ha estimado que VHC es responsable del 27% de los casos de cirrosis y del adenocarcinoma hepático (CDC, 2013)
Una de las principales vías de transmisión es por vía sanguínea, siendo las transfusionales una de las principales causas de infección, el compartir agujas de drogas intravenosas y por vía sexual son las más comunes. La infección VHC es causante de enfermedad aguda y crónica. El periodo posterior al adquirir la infección se denomina fase aguda, comúnmente no genera síntomas, en algunos casos se presentan cuadros de astenia, ictericia en ojos y piel, orina oscura o simplemente ligeros dolores en hipocondrios superior derecho. Se han presentado en el 10 y 30% de los pacientes que son infectados con VHC en fase aguda muestran una recuperación completa o algunas veces no se percatan que fueron infectados debido a una fuerte respuesta inmune eficiente, pero el 70 al 90% de los pacientes infectados desarrollan infección crónica que generalmente no se percatan que se padece. La infección crónica genera un daño hepático prolongado a esta se le considera como una enfermedad silenciosa debido a que los síntomas se presentan de 20 a 30 años de la infección. El riesgo aumenta mientras el paciente no reciba tratamiento (Ministerio de Salud, 2010)
Para realizar el diagnostico de VHC es necesario realizar diversas pruebas principalmente se basa en la sospecha clínica en base a los signos y síntomas, posterior se analiza las posibles alteraciones bioquímicas en el funcionamiento hemático determinando la cantidad de enzimas hepáticas, bilirrubinas, proteínas etc. Para el diagnostico se utilizan diversos marcadores virales, siendo los antígenos virales o los anticuerpos en contra de los antígenos (Ministerio de Salud, 2010).
Principalmente se realiza una prueba serológica de tamizaje siendo la detección de IgG Anti-VHC ya sea mediante técnica de ELISA, cuandoes confirmada la presencia de anticuerpos es necesario realizar una prueba más específica debido a que puede indicar una infección resuelta ya que los títulos de anticuerpos van disminuyendo en un rango de 18 a 20 años. Algunos laboratorios detectan Ac. IgM Anti-VHC que consta de antígenos del core como son NS3 y NS4 estos antígenos son detectables incluso en infecciones crónicas. Para determinar la positividad de VHC se realiza prueba de qRT PCR para determinar la carga y replicación viral. En algunos casos se determina el genotipo y subtipo viral, su importancia recae en la aplicación de un tratamiento debido a la predicción del comportamiento viral (OMS, 2014)
 
Práctica 8. Diagnóstico serológico de Helicobacter pylori
La infección por Helicobacter pylori (H. pylori) se ve relacionado con el desarrollo de diversas patologías gástricas, siendo el desarrollo de gastritis crónica, ulcera gástrica y adenocarcinoma gástrico. H. pylori es un bacilo Gram negativo, ligeramente curvo, sus principales características bioquímicas son catalasa, oxidasa y ureasa positivas. En 1994 la OMS lo clasifico como un carcinógeno de tipo 1 para humanos (WHO/IARC 1994).
Datos epidemiológicos revelan una prevalencia del 70 al 80% en condiciones precarias. En México se estima una seroprevalencia del 67%, detectando anticuerpos Anti-H. pylori. A su vez en el estado de Guerrero se presento una prevalencia del 54% al 85.7%. La diversidad genética que presenta H. pylori se ve relacionado con la virulencia de este microrganismo y por consecuencia en la patogenicidad y el desarrollo de enfermedades gástricas. (Alvarado et al. 2014; Martínez et al. 2010)
Los principales factores de virulencia de este microrganismo son la citotoxina vacuolizante (VacA) encontrando variantes alélicas relacionado con la expresión de dicha proteína además de la capacidad que tiene generar grandes vacuolas en la célula hospedera. Otro importante factor de virulencia es la citotoxina asociada al gen A (CagA), está relacionado a un alto potencial oncogénico debido a que la internalización de esta proteína puede o no fosforilarse e inducir la progresión y replicación celular. Por ultimo tenemos a la presencia de la adhesina BabA2 el cual se relaciona con la adhesión de la bacteria con las células epiteliales garantizando la infección en el epitelio gástrico (Palframan et al. 2012; Smolka & Backert 2012).
Para el diagnostico de este microrganismo existen diversas formas la más común es parte de la serología detectando anticuerpos de clase IgG Anti-H. pylori por método de ELISA, otra es mediante la detección de antígenos de H. pylori en heces fecales por método de inmunoensayos cromatógraficos, otra forma es el aislamiento microbiológico a partir de biopsias gástricas, pero la técnica estándar de oro es observando de manera directa el bacilo en técnicas histopatológicas a partir de biopsias gástricas.
La importancia del diagnóstico de este bacilo radica en el tratamiento prematuro debido a que la infección crónica por este bacilo es causante principal de gastritis crónica debido a que este a largo plazo puede desarrollar una transformación celular maligna en el epitelio gástrico. Debido a que la infección generalmente es asintomática hasta que se causa un daño irreversible (Roesler 2014).
Práctica 8. Determinación del Factor Reumatoide
La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica autoinmune, que afecta principalmente las membranas sinoviales de múltiples articulaciones. La susceptibilidad para padecer AR se debe que es de etiología genética. La principal característica de esta es la inflamación de la membrana sinovial generando destrucción del cartílago y erosiones óseas y deformación articulares. Esta enfermedad suele presentar manifestaciones articulares y extra articulares, está ampliamente distribuido a nivel mundial y se estima que ocupa el 1% de la población mundial además de que se presenta con mayor prevalencia en mujeres y en menor grado a hombres.
Las principales manifestaciones clínicas son dolores crónicos de baja o intermedia intensidad, siendo estos de manera persistentes el dolor se asocia a otros síntomas como son rigidez, inflamación, perdida de movilidad y funcionalidad. Para el diagnóstico previo de este padecimiento no simplemente está basado en pruebas de laboratorio, ni signos o síntomas, para ello se han establecido diversos criterios para el diagnóstico de AR propuestos por el American College Rheumatology. 
1. Rigidez matutina
2. Dolor al moverse, sensibilidad dolorosa por lo menos en una articulación.
3. Hinchazón en una articulación.
4. Afección simultánea en la misma articulación de ambas partes del cuerpo.
5. Nódulos extra articular.
6. Positividad a la prueba de aglutinación de FR.
El factor reumatoide (FR) es un anticuerpo que reacciona en la región FC de la inmunoglobulina propia del organismo. El FR se detecta en pacientes con AR además de que es importante para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. Esta es una prueba que se utiliza para los criterios de diagnóstico de la AR, además de que se puede utilizar para el monitoreo de la progresión de la enfermedad.
Determinación de la Proteína C Reactiva 
La proteína C reactiva (CRP) ha sido usada por mucho tiempo como un marcador de inflamación inespecífico. La CRP es una proteína con estructura pentámerica compuesta por 5 subunidades idénticas con un peso molecular de 120 kDa. sintetizada en el hígado con una vida media de 19 hrs. Además puede sintetizarse con algunas citocinas como son Interleucina 1β, IL-6 y el Factor de Necrosis Tumoral α (TNF α). Generalmente es uno de los marcadores más empleados como reactantes de fase aguda, esta proteína la encontramos en bajas concentraciones en sangre periférica en condiciones normales, su nombre de la CRP proviene de la capacidad de reaccionar con el polisacárido C de S. pneumoniae.
Recientemente se ha determinado que la CRP tiene funciones en la adhesión de neutrófilos, activación endotelial, producción de citocinas y de óxido nítrico. Además se ha determinado que cuando la CRP se liga a una molécula de baja densidad como la fosfatidil colina modifica la membrana celular y genera complejos con C1q para la activación del sistema del complemento.
Las concentraciones séricas se utilizan como biomarcadores para el monitoreo de la enfermedades crónico inflamatorias, infecciosas entre otras. Los hallazgos clínicos muestran que la CRP es importante en la fisiopatología de los procesos inflamaciones, así como en la respuesta inmune innata. La CRP se ve aumentada en las primeras 4-6 hrs y en 8 hrs su valor aumenta el doble ante un proceso inflamatorio y a las 36 y 5 hrs alcanza su pico máximo, esto lo hace un marcador evolutivo eficaz.
Para la determinación de la CRP generalmente es utilizado los métodos cualitativos y cuantitativos que incluyen los reactivos de látex. En el método cualitativo se basa en la aglutinación positiva o negativa. En el método cuantitativo se basa en la realización de diluciones cuando la aglutinación en el método cualitativo es muy marcado. El reactivo de látex está compuesto por anticuerpos específicos contra CRP los cuales están adheridos con partículas que dan la característica grumosa cuando se forman los complejos antígenos-anticuerpos.
 
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