Práctica 5b-Determinación de calcio y hierro sérico (2)

Vista previa del material en texto

Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas
Primera Unidad
PRACTICA N° 05b
 - DETERMINACION DE CALCIO Y HIERRO SÉRICO --
DETERMINACIÓN DE CALCIO SÉRICO
INTRODUCCION:
El calcio es el catión más abundante del organismo: 1 a 2 Kg en un adulto. En su regulación intervienen las hormonas calcitriol, paratohormona (PTH) y la calcitonina. El calcitriol derivado de la vitamina D aumenta la absorción intestinal y la reabsorción renal del calcio. La PTH aumenta la resorción ósea y la liberación del calcio del hueso, y la reabsorción renal del calcio. El calcio plasmático constituye tan solo el 2 % del calcio total, mientras que el 98 % se encuentra en el esqueleto óseo.
En el plasma el calcio se encuentra en tres formas: libre o iónico en un 46 % (Ca++), unido a las proteínas en un 40 % y el resto formando complejos solubles con el bicarbonato, citrato, fosfato y sulfato. Cerca del 80 % del calcio proteico plasmático está unido a la albúmina y el restante a la globulina. Las funciones del calcio son múltiples: constituyente fundamental de la estructura ósea, es un segundo mensajero de varias hormonas, interviene en la coagulación sanguínea, en la excitabilidad neuromuscular y la transmisión nerviosa.
El calcio sérico puede disminuir (hipocalcemia) por hipoparatiroidismo hereditario o adquirido, pancreatitis aguda, etc. Puede aumentar (hipercalcemia) en el hiperparatiroidismo primario, la insuficiencia renal crónica, en neoplasia maligna, etc.
En la presente práctica, la técnica empleada en la determinación de calcio en sangre se fundamenta en que el calcio reacciona con la o-cresolftalein complexona (o-CPC) en pH alcalino dado por el aminometil propanol (AMP), generando un complejo de color magenta que se mide a 570 nm.
		 AMP (8-Hq)
o-CPC + 2 Ca++ ——————> o-CPC(Ca)2 (color magenta)
COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE:
Determina la concentración sérica de calcio, empleando de manera responsable el método de colorimetría directa.
MATERIAL Y EQUIPOS
Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.
Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc.
Equipos: centrífuga, micropipetas x 10 ul, baño maría, espectrofotómetro.
Muestra: Suero sanguíneo.
Solución Estándar: solución de calcio 10 mg/dl.
Reactivo Único: Mezclar partes iguales de reactivo A y reactivo B.
· Reactivo A: solución de o-cresolftalein complexona y 8-hidroxiquinolina (agente quelante).
· Reactivo B: solución de aminometil propanol (buffer).
PROCEDIMIENTO:
1) Obtención de la muestra:
Desinfectar la zona con alcohol y extraer de 3 a 5 mL de sangre de la vena de la flexura del codo utilizando una jeringa de 5ml y aguja hipodérmica N°21G x 1 ½, de un paciente en ayunas. Dejar en reposo por 10 minutos para la coagulación de la sangre y centrifugar a 2,500-3,000 rpm durante 10 minutos. Separar el suero con una pipeta serológica de plástico descartable.
Si la muestra a utilizar fuese plasma extraer la sangre con un anticoagulante común (heparina). Mezclar suavemente; dejar en reposo durante 5 minutos y luego proceder como en el caso anterior.
2) Sistema de incubación para la determinación de la calcemia: Preparar el siguiente sistema agregando lo que se indica:
	COMPONENTES
	TUBOS DE ENSAYO
	
	B
	S
	D
	Muestra (suero / µl)
	--
	--
	50
	Estándar (µl)
	--
	50
	--
	Reactivo único (ml)
	2
	2
	2
	Agua destilada (µl)
	50
	--
	--
	Mezclar suavemente e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). Retirar y leer en espectrofotómetro a 570 nm, llevando el aparato a cero con el blanco de reactivos (B), en el lapso de 30 minutos (tiempo en que el color de la reacción es estable). Anotar los resultados.
3) Valoración cuantitativa del calcio en sangre (calcemia):
Con los datos de absorbancia se procede a realizar los cálculos respectivos y expresar los resultados en términos de calcio por volumen de sangre: mg/dL. Interpretar en base a la competencia.
RESULTADOS:
1) Sistema de incubación para la determinación de la calcemia: Luego de la incubación del sistema, se observa lo siguiente:
D
St
2) Valoración cuantitativa de la glicemia:
· Expresión de los resultados: Los resultados se expresan en términos de miligramos de calcio por decilitro de sangre (mg/dL), lo cual se determina mediante la siguiente fórmula:
Calcio = (Factor) (Lectura de la muestra)
Factor para mg/dL = ..........................
Lectura St (Lectura de absorbancia del estándar de calcio): 0.555
· Tabulación/Registro de los resultados:
	Muestra
	Lectura de absorbancia
	Edad (años)
	Calcemia: [Calcio], mg/dL
	Paciente N° 1
	0.500
	
	
	Paciente N° 2
	0.394
	
	
Interpretar los resultados según los valores de referencia: 8.5 - 10.5 mg/dl (en suero).
DISCUSIÓN:
El estudiante discute o analiza los resultados. Para ello los interpreta comparándolos y verificándolos respecto al marco teórico (principios teórico-prácticos, teorías y leyes que existen para la temática de los resultados) que se encuentra principalmente en libros, y con respecto a los antecedentes (trabajos de investigación alusivos al tema) que se encuentran fundamentalmente en artículos publicados. El marco teórico y los antecedentes se encuentran en las referencias bibliográficas, las cuales deben ser citadas en la discusión.
CONCLUSIONES:
El estudiante, en base a lo realizado en la discusión, elabora conclusiones cortas y puntuales las cuales se enuncian según las competencias a alcanzar en la presente práctica.
Nota: Mínimo deben elaborarse 3 conclusiones por tema.
PREGUNTAS DE APLICACIÓN:
1) Identificar las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
2) ¿Cuáles son las hormonas que regulan a la concentración de calcio?
3) Elaborar una lista de 10 enfermedades que producen hipocalcemia e hipercalcemia.
4) Esquematizar y explique el metabolismo del calcio.
5) Elaborar un mapa conceptual explicando la relación entre calcio y osteoporosis.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta Edición, Editorial Omega, España, 2011
3) Huamán-Saavedra J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretacion, 2 edición Edit. Universitaria. Trujillo, 2018
Nota: Mínimo deben revisar y consignar 3 referencias bibliográficas, las cuales deben estar citadas en la discusión. Emplear las normas Vancouver.
DETERMINACIÓN DE HIERRO SÉRICO
INTRODUCCION:
El hierro es un metal muy importante en el organismo porque es componente esencial del núcleo heme de la hemoglobina que se encarga del transporte de oxígeno de los pulmones a los tejidos. También interviene como componente de otras hemoproteínas como los citocromos y los complejo Fe-S de la cadena respiratoria y la mioglobina.
El hierro de la dieta puede ser ligado al hemo o en forma inorgánica. El primero es más fácilmente absorbido y el segundo requiere estar como ión ferroso. La absorción de hierro ocurre principalmente en el duodeno como Fe2+ y es trasferido a la transferrina para su transporte sérico llegando a los tejidos para su uso y a los lugares de depósito donde se acumula como ferritina. Uno de los lugares de depósito es en la médula ósea donde es utilizado para la síntesis de hemoglobina.
El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado, que se encuentra dentro de las células; el hierro en uso, que se encuentra en la hemoglobina, enzimas y varios tipos de proteínas; y el circulante. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína, dado que no sólo es relativamente insoluble, sino que además es tóxico.
La deficiencia de hierro produce anemia ferropénica de tipo microcítica hipocrómica, es la causa más frecuente de anemia nutricional, en niños, mujeres y adultos mayores. Se reconocen diversos estadios de la deficiencia de hierro, donde: 0: normal
I: deficiencia de los depósitos de hierro lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica. II:se añade disminución de hierro sérico, aumento de la transferrina y la capacidad total de fijación del hierro y disminución de la saturación de la transferrina y III; anemia microcítica hipocrómica; siendo el III el de la anemia ferropénica propiamente dicha. La determinación del hierro sérico es parte del estudio de la anemia y disminuye en la fase II. El 90 % de anemia en las mujeres es por deficiencia de hierro.
La evaluación de la concentración de hierro sérico, por tanto, es de gran utilidad, dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos, defectos en el mecanismo de almacenaje, etc. De la misma manera, su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje, etc.
En la presente práctica, el método se fundamenta en lo siguiente: El hierro se libera del complejo de transferrina en medio ácido y se reduce a Fe (II) con ácido ascórbico. Seguidamente reacciona con el reactivo de color, ferene, dando un complejo color azul que se mide a 600 nm. La absorbancia obtenida es directamente proporcional a la concentración de hierro.
COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE:
Determina la concentración sérica de hierro, empleando de manera responsable el método colorimétrico directo.
MATERIAL Y EQUIPOS
Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.
Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc.
Equipos: centrífuga, micropipetas x 10 ul, baño maría, espectrofotómetro.
Muestra: Suero sanguíneo.
Estándar: solución de iones hierro (III) equivalente a 100 ug/dl.
Reactivo A: solución de ácido cítrico 200 mM, ácido ascórbico 34 mM, tiourea 100 mM y tensioactivo.
Reactivo B (color): solución estabilizada de ferene > 3 mM.
PROCEDIMIENTO:
1) Obtención de la muestra:
Desinfectar la zona con alcohol y extraer de 3 a 5 mL de sangre de la vena de la flexura del codo utilizando una jeringa de 5ml y aguja hipodérmica N°21G x 1 ½, de un paciente en ayunas. Dejar en reposo por 10 minutos para la coagulación de la sangre y centrifugar a 2,500-3,000 rpm durante 10 minutos. Separar el suero con una pipeta serológica de plástico descartable.
Si la muestra a utilizar fuese plasma extraer la sangre con un anticoagulante común (heparina).
2) Sistema de incubación para la determinación de hierro sérico: Preparar el siguiente sistema agregando lo que se indica en 2 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), y D (Desconocido o Problema).
	COMPONENTES
	TUBOS DE ENSAYO
	
	B
	S
	D
	Agua destilada (µl)
	100
	
	--
	Estándar (µl)
	--
	100
	--
	Muestra (suero / µl)
	--
	--
	100
	Reactivo A (ml)
	0.5
	0.5
	0.5
	Mezclar e incubar a temperatura ambiente (< 25°C) por 3 minutos. Leer la absorbancia del Tubo D (BD) en espectrofotómetro a 600 nm llevando a cero el aparato con agua destilada. Luego agregar:
	Reactivo B (µl)
	100
	100
	100
	Mezclar inmediatamente. Leer cada tubo a los 5 minutos, llevando el aparato a cero con agua destilada.
RESULTADOS:
1. Sistema de incubación para la determinación de hierro sérico: Luego de la incubación del sistema, se observa lo siguiente:
D
B
4) Valoración cuantitativa de hierro sérico:
· Corrección de las lecturas de absorbancia:
B (Lectura de absorbancia del blanco de reactivos): 0.020
St corregida (Lectura de absorbancia corregida del estándar de hierro): St ‒ B = 0.270 ‒ 0.020 = ...........................
D corregido (Lectura de absorbancia corregida del desconocido o problema) = D – (B + BD)
	Varón: D – (B + BD) = 0.170 ‒ (0.020 + 0.050) = .............................
Mujer: D – (B + BD) = 0.320 ‒ (0.020 + 0.060) = ..............................
· Expresión de los resultados: Los resultados se expresan en términos de microgramos de hierro por decilitro de sangre (µg/dL), lo cual se determina mediante la siguiente fórmula:
Hierro = (Factor) (Lectura del D corregido)
Factor para µg/dL = ..................................
· Tabulación/Registro de los resultados:
	Muestra
	Edad (años)
	Hb (g/dL)
	Lectura de absorbancia
	[Hierro], µg/dL
	
	
	
	BD
	D
	D corregido
	
	Paciente N° 1: Varón
	18
	10
	0.050
	0.170
	
	
	Paciente N° 2: Mujer
	65
	14
	0.060
	0.320
	
	
Interpretar los resultados según los valores de referencia en suero: 65 - 175 µg/dL (varones); 50 - 170 µg/dL (mujeres).
DISCUSIÓN:
El estudiante discute o analiza los resultados. Para ello los interpreta comparándolos y verificándolos respecto al marco teórico (principios teórico-prácticos, teorías y leyes que existen para la temática de los resultados) que se encuentra principalmente en libros, y con respecto a los antecedentes (trabajos de investigación alusivos al tema) que se encuentran fundamentalmente en artículos publicados. El marco teórico y los antecedentes se encuentran en las referencias bibliográficas, las cuales deben ser citadas en la discusión.
CONCLUSIONES:
El estudiante, en base a lo realizado en la discusión, elabora conclusiones cortas y puntuales las cuales se enuncian según las competencias a alcanzar en la presente práctica.
Nota: Mínimo deben elaborarse 3 conclusiones por tema.
PREGUNTAS DE APLICACIÓN:
1. Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
1. Defina que es la transferrina, ferritina y hemosiderosis.
1. ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro?
1. Elabore una lista de 10 causas de deficiencia e incremento de hierro.
1. Esquematice y explique el mecanismo de absorción del hierro hémico y no hémico.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1. Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
1. Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta Edición, Editorial Omega, España, 2011
1. Huamán-Saavedra J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretacion, 2 edición Edit. Universitaria. Trujillo, 2018
Nota: Mínimo deben revisar y consignar 3 referencias bibliográficas, las cuales deben estar citadas en la discusión. Emplear las normas Vancouver.