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PRACTICA Nº 1
EXAMEN EN FRESCO
EXAMEN COMPLETO ORINA
I. INTRODUCCION
Uno de los exámenes de identificación bacteriana es el examen en fresco donde se puede observar la motilidad de los microorganismos visibles por microscopia óptica; su limitación es poder definir las características micro morfológicas. El examen de sedimento urinario es un ejemplo característico de este tipo de pruebas, realizadas en el Laboratorio.
II. OBJETIVOS
· Realizar un examen completo de orina.
· Reconocer el material requerido para realizar el examen completo de orina.
· Observar las diferencias entre una muestra normal y una patológica en la orina.
· Identificar a los microorganismos, cilindros, cristales y células, presentes en los preparados hechos por los mismos estudiantes.
III. MATERIALES
· Probeta.
· Tubos de ensayo
· Guantes de procedimiento 
· Gradillas para tubos de ensayo.
· Tiras reactivas para el examen químico de orina. 
· Toalla absorbente de papel
· Muestra problema para realizar el examen químico semi–cuantitativo
· Muestra de orina reciente (mañana del día del práctico), traída por los integrantes del grupo
· Laminas portaobjetos.
· Laminas cubreobjetos.
· Microscopio óptico.
· Centrífuga.
IV. METODOLOGIA
A. Fase Pre-Analítica:
En esta fase se consideran las condiciones que debe tener en cuenta el paciente, las condiciones de la toma de muestra y las repercusiones que puede tener una mala conservación o manipulación de la muestra. 
B. Fase Analítica: El análisis de orina de rutina comprende:
1) Examen Físico: Es la forma más básica de estudiar la orina.
Los 3 aspectos principales en el examen físico son:
· Color: La orina normal es semi-transparente y de color amarillo claro. 
· Aspecto: La orina normal es limpia y transparente, la turbidez de la orina puede deberse a la presencia de sangre, moco o pus.
· Densidad: Se refiere a la densidad específica de la orina en relación con el agua. La variación normal va desde una orina francamente diluida con cifras alrededor de 1.008 al grado máximo de concentración urinaria que es de alrededor de 1.030. 
2) Examen bioquímico:.
Las tiras reactivas para uroanálisis son bases plásticas en las que hay adheridas diversas áreas reactivas para determinar Glucosa, Bilirrubina, Acetona, Densidad, Sangre, pH, Proteínas, Urobilinógeno, Nitritos y Leucocitos.
3) Preparación del Sedimento y uso del Microscópio
El examen microscópico debe hacerse en una muestra centrifugada (si el volumen de la muestra es demasiado pequeño como para centrifugarlo, por Ej. sólo unas pocas gotas, aquélla se examina directamente, pero se señala en el informe que los resultados se obtuvieron de una muestra sin centrifugar). Se mezcla la muestra y se colocan aproximadamente 10-15 mL de orina en un tubo de centrifugación, se centrífuga a 2000 r.p.m. durante 5 minutos. Se elimina el líquido sobrenadante (éste puede usarse para pruebas confirmatorias de proteínas), y se suspende el sedimento en la orina que baja por las caras del tubo (algunos laboratorios dejan exactamente 1 mil de sedimento y de sobrenadante en el tubo). Se dan golpecitos en la parte inferior del tubo para mezclar el sedimento, se coloca una gota de éste en un portaobjeto limpio o en una cámara de conteo, se cubre con un cubreobjeto y se examina inmediatamente.
La observación de cristales estará correlacionado con el pH de la orina, tal como se detalla en las siguientes figuras.
FIGURA 1. Cristales hallados en orinas ácidas
FUENTE: Graff SL, 1987.
FIGURA 2. Cristales hallados en orinas alcalinas.
FUENTE: Graff SL, 1987.
· Cilindros: Los cilindros son aglomeraciones de células o proteínas que se forman en los túbulos renales, y es por eso que tienen forma cilíndrica con márgenes regulares. 
· Bacterias: La presencia de bacterias en la muestra se debe principalmente a infección (ITU), a pesar que en numerosas veces se debe a contaminación, especialmente en muestras femeninas. Para identificar la (las) bacteria (s) de la infección se solicita el cultivo bacteriano llamado urocultivo.
· Leucocitos: Generalmente se ven neutrófilos en infecciones, donde el urocultivo generalmente es positivo. 
· Células Epiteliales: Son producto del barrido que hace la orina por el tracto urinario. 
· Eritrocitos: La hematuria, en este caso microscópica, se define como la presencia de más de 5 eritrocitos por campo microscópico de gran aumento. 
V. DISCUSION.
· El alumno reconocerá los distintos exámenes realizados en un examen completo de orina, correlacionando los resultados obtenidos.
VI. RESULTADOS:
1. Describir en que cosiste la fase pre-analítica en el examen completo de orina.
2. Definir los siguientes términos: disuria, poliaquiuria, piuria, cistitis, pielonefritis.
3. En la determinación de la esterasa leucocitaria que interferentes pueden intervenir para dar falsos positivos
4. En una muestra de orina con leucocituria y urocultivo negativo, que podría cocluir usted:
5. Dibuje paso a paso todo el procedimiento de análisis de un examen completo de orina, detallando los tres exámenes en cada muestra.
VII. BIBLIOGRAFIA
· Microbiología Médica. 9º Ed. Murray Rosenthal Pfaller. 2021
· Microbiología Médica. 28º Ed. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2020
· Análisis de Orina y Líquidos Corporales. 2º Ed. Graff. 2011
· Microbiología Basada en la Resolución de Problemas. 1º Ed. Swapan y Sanjay. 2007
PRÁCTICA Nº2
IDENTIFICACIÓN MICROBIANA.
I. INTRODUCCIÓN
Los métodos más utilizados para la identificación microbiana, los podemos clasificar en pruebas basadas en:
A. Características Morfológicas
Características Microscópicas:
1. cocos; 2. diplococo; 3. cocos en cadenas; 4. cocos en racimos; 5. cocos en tetradas; 6. cocobacilos; 7. bacilos; 8. bacilos bordes redondeados; 9. bacilos bordes rectos; 10. bacilos fusiformes; 11, 12. bacilos curvos; 13 al 15. espiroquetas
Métodos basados en tinción diferencial 
Características Macroscópicas:
Es importante también considerar la características de las colonias en lo referente tamaño, forma, bordes y superficie.
B. Características fisiológicas:
· Ver sus propiedades metabólicas:
· Uso de fuente de energía:
· Uso de fuente de carbono
· Según aceptor final de electrones.
C. Según su tolerancia:
· Temperatura:
· Concentración de hidrogeniones.
· Presión osmótica.
D. Pruebas inmunológicas
Los métodos serológicos, implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en muestras puras o en muestras biológicas. 
E. Pruebas de Biología Molecular.
Modernamente adquiere más importancia el uso de métodos basados en biología molecular donde, a través de procedimientos y reactivos, se pueden detectar determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente microbiano.
II. OBJETIVOS
· Identificar la morfología y las estructuras características de los microorganismos de importancia clínica, en preparados fijados y coloreados.
· Discutir la importancia de la identificación microbiana para el diagnóstico, tratamiento y prevención de enfermedades infecto contagiosas.
· Enumerar los métodos utilizados para la identificación microbiana.
· Discutir la importancia y dar ejemplos de las pruebas de utilización de sustratos y diagramas de flujo utilizados en la identificación de bacteria.
· Discutir la aplicación de los principales métodos convencionales utilizados en la identificación microbiana.
· Citar ejemplos de microorganismos que pueden identificarse por los métodos discutidos en la práctica.
III. MATERIALES
· Preparados de microorganismos en coloración Gram, azul de metileno y coloraciones específicas para identificación de estructuras bacterianas.
· Asas de Kolle
· Laminas portaobjetos
· Mechero de alcohol.
· Batería para coloración de Gram
· Hisopos estériles.
IV. DISCUSION.
· Observar los distintos preparados observando sus características micromorfológicas generales y específicas.
· En los preparados con coloración de Gram, diferenciar a los microrganismospor sus propiedades tintoriales.
· En las coloraciones especiales, identificar a las estructuras que caracterizan a cada genero bacteriano.
V. RESULTADOS:
1. ¿Cuál es el principio de la coloración de Gram?
2. ¿Qué es un mordiente?
3. ¿De qué color tiñen los bacilos alcohol acido resistentes y por qué?
4. ¿Por qué se caracterizan las bacterias fotolitotrofas?
5. ¿Por qué se caracterizan las bacterias quimioorganotrofas?
6. Defina bacterias auxotrofas:
7. Cuál es la clasificación de las bacterias según su tolerancia a la temperatura y defina cada una:
8. Informar el desarrollo de práctica:
VI. BIBLIOGRAFIA
· Microbiología Médica. 9º Ed. Murray Rosenthal Pfaller. 2021
· Microbiología Médica. 28º Ed. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2020
· Microbiología Basada en la Resolución de Problemas. 1º Ed. Swapan y Sanjay. 2007
PRACTICA Nº 3
ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
I. INTRODUCCION
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar o eliminar al microrganismo, con el fin de tener medios libres de los mismos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos.
A continuación tendremos la clasificación de los distintos agentes físicos y químicos: se deja para que mediante la explicación en clase, el alumno pueda investigar y responder los conceptos de cada una de estas formas de agentes físicos y químicos.
a) AGENTES FISICOS:
1. CALOR
1.1. CALOR HUMEDO
· VAPOR
· FLUENTE
· A PRESIÓN: AUTOCLAVE
· EBULLICIÓN
· TINDALIZACIÓN
· PASTEURIZACIÓN
1.2. CALOR SECO
· FLAMEADO
· INCINERACIÓN
· AIRE CALIENTE: ESTUFA MICROBIOLOGICA 
2. RADIACION
3. AGENTES MECANICOS
b) AGENTES QUIMICOS:
1. GASEOSOS
· OXIDO DE ETILENO
2. NO GASEOSOS
· ALDEHIDOS
· ACIDO PERACETICO
· PEROXIDO DE HIDROGENO
II. OBJETIVOS
· Conocer los distintos procesos de esterilización y desinfección.
· Comprender la utilidad de la esterilización y desinfección, en la preparación de medios de cultivo.
· Preparar medios de cultivo líquidos y sólidos.
· Determinar el uso de esos medios para aislar e identificar a los microorganismos.
III. MATERIALES.
· Placas Petri.
· Tubos de Ensayo.
· Mecheros de Bunsen.
· Autoclave.
· Matraces.
· Pinzas de madera.
· Baño maría.
· Trípodes
· Rejillas de asbesto.
· Medios de cultivo a prepararse.
IV. METODOLOGIA
La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercialización de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo sólo necesario la adición de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio líquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada.
A continuación, el caldo se envasa en los recipientes adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizándolos. La preparación de un medio sólido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y añadir Agar al 1,5% o bien utilizar un medio sólido comercial. Independientemente de la forma elegida para hacerlo, la preparación de los medios de cultivo sólidos requiere procedimientos especiales, ya que el Agar es insoluble en agua. Por ello, una vez añadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta 100°C, para permitir que el Agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes disueltos. El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan.
Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra. Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verterá en placas vacías en un ambiente aséptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estéril en tubos, que se fundirán al baño María cuando se vayan a preparar las placas.
Si se han de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante. La conservación de los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es preferible conservarlos a 4°C para retrasar su deshidratación.
V. DISCUSIÓN
El alumno comprenderá la importancia de la preparación de los medios de cultivo, ya que de los mismos dependerá que se realice un adecuado aislamiento de los microrganismos en las muestras biológicas.
VI. RESULTADOS
1. ¿Cuáles son los objetivos de la nutrición microbiana?
2. ¿Qué información aportan los medios diferenciales?
3. ¿Cómo se denomina el producto que se añade a los medios de cultivo para solidificarlos?
4. ¿Cuáles son los compuestos nutritivos básicos?
5. ¿Qué compuestos podemos incorporar al medio de cultivo que le sirva a la bacteria como fuente de nitrógeno?
6. ¿Qué compuesto nutritivo aporta el carbono que le sirve a la bacteria para obtener energía?
7. Explique como usted realiza la pesada de un medio de cultivo deshidratado.
8. Describa como se hidrata el medio de cultivo una vez pesado.
9. ¿De cuantas maneras se puede ajustar el pH del medio de cultivo?
10. ¿Cómo se distribuye el medio de cultivo antes de su esterilización?
11. ¿Cómo se conservan los diferentes medios una vez elaborados?
12. ¿Cómo se comprueba la esterilidad de los medios de cultivo recién elaborados?
13. ¿Qué proceder debe seguirse cuando se va a realizar la siembra en un medio que está conservado en refrigeración?
14. Realice su informe de todos los procedimientos observados en la práctica.
VII. BIBLIOGRAFIA
· Microbiología Médica. 9º Ed. Murray Rosenthal Pfaller. 2021
· Microbiología Médica. 28º Ed. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2020
· Microbiología Basada en la Resolución de Problemas. 1º Ed. Swapan y Sanjay. 2007
PRACTICA Nº 4
SIEMBRA Y AISLAMIENTO
I. INTRODUCCION
Sembrar es inocular los microorganismos en medios de cultivo apropiados para que se desarrollen o reproduzcan en condiciones óptimas. Tiene por finalidad conservar la vitalidad del germen para posteriormente determinar sus propiedades bioquímicas.
Para realizar la siembra es necesaria una amplia superficie de medio nutritivo, éste se logra en las placas petri, para que los microorganismos formen colonias aisladas y en menor medida en el agar inclinado en tubos.
En un medio de cultivo se ofrecen un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos:
Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de agua o la esterilización. Los medios de cultivo pueden clasificarse:
a) POR SU CONSISTENCIA:
1. Medios Líquidos o Caldos.
2. Medios Sólidos: 
3. Medios Semisólidos.
b) POR SU ORIGEN
1. Medios naturales.
2. Medios sintéticos.
3. Medios semisintéticos: 
c) POR SU COMPOSICIÓN:
1. Medios Enriquecidos:.
2. Medios de Enriquecimiento:.
3. Medios Selectivos:.
4. Medios Diferenciales: 
II. OBJETIVO.· Determinar el uso de los medios para aislar e identificar a los microorganismos.
· Realizar toma de muestra y siembra en medios de cultivo.
· Efectuar extendido y coloración de Gram de muestra biológica.
· Correlacionar los resultados obtenidos con la coloración de Gram y la siembra en los medios de cultivo.
III. MATERIAL.
· Muestras de secreción faríngea y nasal.
· Solución de hipoclorito de sodio al 5%.
· Hisopos.
· Bajalenguas.
· Mechero de Bunsen.
· Estufa a 37°C.
· Placas Petri.
· Asas de Kolle.
· Medios de Cultivo.
IV. METODOLOGÍA.
· Se empleará dos tipos de siembra:
· Por Trasplante.
· Esterilizar el asa en el mechero y dejar enfriar.
· Tomar el tubo de ensayo con la mano izquierda, inclinando levemente. En la mano derecha sostener el asa y con el dedo meñique sacar el tapón del tubo, flamear la boca o introducir el asa sin tocar las paredes, tomar el inoculo, retirar el asa, flamear la boca del tubo, poner el tapón y colocar el tubo en la gradilla.
· Luego de tomar el tubo para siembra con la mano izquierda, destapar, flamear la boca, introducir el asa al fondo, suavemente sin romper el agar, hacer estrías, sacar el asa, flamear asa y tubo, tapar, incubar a 37°C por 24 horas.
· Por Aislamiento.
Puede ser:
· Por Agotamiento.
· Colocar el inóculo en un extremo de la placa para la siembra.
· A partir de este punto puede hacer estrías paralelas en toda la superficie de la placa hasta agotar la muestra. Incubar a 37°C. por 24 horas.
· Por Dispersión.
· Tomar el inoculo y hacer estrías juntas en un cuarto de la placa, esterilizar el asa, girar la placa 45° y sin tomar nueva muestra hacer estrías hasta la mitad de la placa, proceder de la misma manera para la otra mitad. Incubar a 37°C por 24 horas.
· Lectura de la Siembra.
· Entre las 18 y 24 horas aparecen las colonias.
· En las colonias se estudia forma, tamaño, contorno, coloración, emulsionabilidad, grado de opacidad, superficie y consistencia.
· En los medios líquidos se observa el grado de turbidez, película, sedimento y otros caracteres.
· En medios especiales se estudia las acciones bioquímicas del germen sobre los diversos componentes del medio.
· Uno de los caracteres fundamentales en una colonia es el referente a su contorno y superficie. Las Colonias de contorno regular y superficie lisa se llaman colonias "S" (suave, liso). Las de contorno y superficie irregulares se llaman colonias "R" (rugoso). Estos aspectos tienen relación con la virulencia de algunos gérmenes.
V. DISCUSION
El alumno realizará la siembra en los medios de cultivos pertinentes para el aislamiento microbiano, con la realización del extendido y coloración de Gram de dicha muestra.
Posteriormente correlacionará lo encontrado en su coloración Gram, con el desarrollo bacteriano obtenido de su siembra.
Analizará el comportamiento tintorial de los microrganismos, en la coloración Gram.
VI. RESULTADOS
1. ¿Es posible aislar gérmenes en medios líquidos?
2. ¿Qué importancia tiene el aspecto de una colonia? 
3. Anotar los caracteres culturales de las colonias 
4. Esquematice lo observado en la práctica, asi como las características de las colonias encontradas en su siembra y lo observado en su coloración Gram.
VII. BIBLIOGRAFIA
· Microbiología Médica. 9º Ed. Murray Rosenthal Pfaller. 2021
· Microbiología Médica. 28º Ed. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2020
· Microbiología Basada en la Resolución de Problemas. 1º Ed. Swapan y Sanjay. 2007
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Microbiología Médica – Facultad de Medicina Humana - UCSM