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23/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

ESTUDIO DE LA ENANTIOSELECTIVIDAD HIDROLÍTICA
DE LA LIPASA DE Bacillus pumilus.

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO DE ALIMENTOS

PRESENTA
HUGO CÉSAR SANTILLÁN URIBE

MÉXICO, D.F. AÑO 2012

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
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respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: RAÚL GENARO AGUILAR CABALLERO
VOCAL: Profesor: MIREYA RODRÍGUEZ PENAGOS
SECRETARIO: Profesor: ISMAEL BUSTOS JAIMES
1er. SUPLENTE: Profesor: AMELIA MARÍA DE GUADALUPE FARRES GONZÁLEZ SARAVIA
2° SUPLENTE: Profesor: EUCLIDES ÁVILA CHÁVEZ

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO DE FISICOQUÍMICA E INGENIERÍA DE
PROTEÍNAS. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, FACULTAD DE MEDICINA UNAM.

ASESOR DEL TEMA:
ISMAEL BUSTOS JAIMES

SUSTENTANTE (S):
HUGO CÉSAR SANTILLÁN URIBE

ESTE TRABAJO CONTÓ CON RECURSOS DEL PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS DE
INVESTIGACIÓN E INNOVACIÓN TECNOLÓGICA (PAPIIT), UNAM, (IN212607 E IN202710).
IGUALMENTE CONTAMOS CON APOYO DEL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
(PROYECTO 53710).

Dedicado a:

Mi abuelo Rafael, a quien le agradezco por ser un ejemplo y enseñarme a distinguir el camino
recto.
Mi madre, por su esfuerzo y empeño para que siempre exista en mi un motivo.
Mi padre, por darle forma a mi criterio, aún sin importar que creaen que existieron mejores
formas.
Mi hermano, por ser mucho más de lo que imaginé cuando tuve seis años y por contribuír cada
día a enriquecer mi entendimiento.
Esa conjunción de personas cercanas que yo llamo familia (abuela María, tía Silvia, tía Nancy, tío
Rafael), es gracias a ustedes que he aprendido a ponderar.
A ti, por tener la capacidad de hacer tuyo parte del conocimientoy por tener la capacidad de decir
no lo sé. Por ser un gran sujeto al que le gusta aprender y ejercer el poder para hacer a través de lo
que ha aprendido. A quien no sólo es un misántropo seudoexistencialista que padece de distimia y
que se encuentra melancólicamente asido a su patética, absurda y decadente condición humana.
A ti, por ser muchas otras cosas más… como lo describe Sergio Pitol: <<Uno, es los libros que ha
leído, la pintura que ha visto, la música escuchada y olvidada, las calles recorridas. Uno es su
niñez, su familia, unos cuantos amigos, algunos amores, bastantes fastidios. Uno es una suma
mermada por infinitas restas. Uno está conformado por tiempos, aficiones y credos
diferentes>>.

Agradecimientos

Al Dr. Ismael Bustos por brindarme la oportunidad y el privilegio de trabajar bajo su tutela. En
verdad muchas gracias Ismael por tu paciencia, tu conocimiento y el aprendizaje que en muchos
sentidos adquirí a través de tu generosidad. Gracias también por ese sarcasmo que sólo poseen y
apreciamos los espíritus nobles.
A todas las personas que constituyen ese increíble lugar llamado Laboratorio de Fisicoquímica e
Ingeniería de Proteínas.
A la profesora Mireya Penagos y al profesor Raúl Aguilar por sus observaciones, contribuciones y
consejos.
A la Q.F.B. Julieta Sandoval por todo el conocimiento y la riqueza que adquirí bajo su mando.
Al profesor Gustavo Garduño por propiciar que yo venciera el miedo a asumir el continuo
cuestionemiento como forma de vida.
A todas y todos los profesores, a los buenos y a los no tan buenos. Aún me resulta difícil distinguir
con cuales aprendí más.
A esas personas especiales que han estado conmigo en la licenciatura:
Julio, gracias por tolerarme y aceptarme (empresa nada sencilla). Creo en que uno no elige a sus
amigos, los verdaderos amigos lo eligen a uno. Gracias por elegirme.
Belem, hay tantas cosas que aún no comprendo de ti, quizá no me alcance la vida para hacerlo.
Sin embargo, lo que sé y comprendo son las razones por la cuales fuiste muchas cucharaditas de
mi felicidad. <<Hay quienes no pueden liberarse de sus propias cadenas, y sin embargo pueden
redimir a sus amigos>> Nietzsche. Gracias por redimir a tu amigo.
Luis, Arturo, Fany, Axel, Sandra, Manuel y Mauricio, gracias por compartirme de su tiempo, hay
muchos recuerdos gratos asociados a ustedes.
Blanca, creo yo en que la gratitud es la mejor y la mayor muestra de aprecio. Gracias por los
buenos momentos, recuerdo que los hubo.

Liliana, querida amiga, yo sé que tu también lo eres. Piensa en mí y cuando lo hagas, piensa en lo
que sípasó. Pretendo hacer para que nos pase por mucho tiempo más. Tú lo entiendes…
Sandra, Rocío, Elisa, Jacky, Daniela, Marcos; gracias por enseñarme el valor de trabajar en
equipo. Su presencia le ha brindado a mi vida gratas sorpresas, por favor, piensen en mí como
alguien que tiene interés por ser su amigo.
Diana, sabes lo que representas para mí y por ello es que te agradezco. Tal vez, algún día decidas
despojarte de la absurda misandria que cargas contigo. Para ello, procura ejercer la
imparcialidad, la objetividad, el estudio minucioso de las circunstancias y la equidad. Si adquieres
estos hábitos podrás perfeccionar tu juicio, permitiendo así que asumas lo patético que resulta tu
misoneísmo <<No hay que tener miedo>> Sartre. Entiende que la ceguera es una condición que
trasciende más alla de los fenómenos ópticos y que ese marasmo intelectual que a veces te
caracteriza impedirá tu crecimiento. Cambia tu carácter mezquino y tu mal corazón. Asume tus
desgracias, agradece tu fortuna y continúa. Ya deja de ser una víctima de la procrastinación,
comienza a tener ideas y a creer <<Las ideas se tienen, las creencias se son>> Ortega. ¡Crece! Si
yo lo intento, si yo tengo ideas y creencias a partir de ti ¿Tú por qué no? Ya no vivas sola,
completamente sola. Habla con alguien; recibe algo, da algo, no debes tener miedo...
Anaíd, Lorena, Héctor, Paty, Yareth, Rogelio, Jorge, Alejandro, Diana; ustedes han sido unos
excelentes compañeros durante mi estancia. Gracias.

<<El camino recto, el motivo recto, el entendimiento recto y el recto criterio y
ponderación, dan a cada cosa su peso… por que por el conocimiento se rigen, conducen
y llegan a su perfección todas las cosas>>
Paracelso

Índice

Resumen 1
Abreviaturas usadas 2
Capítulo 1 Lipasas 3
 Introducción 3
 Clasificación 5
 Estructura 12
 Mecanismo catalítico 14
 Aplicaciones industriales 16
 Lipasas del género Bacillus 17
Capítulo 2 Lipasa de Bacillus pumilus GMA1 19
 Introducción 19
 Bacillus pumilus GMA1 19
 Lipasa de Bacillus pumilus GMA1 20
 Similitud con otras lipasas del género Bacillus 22
 Propiedades bioquímicas 22
 Parámetros cinéticos y estabilidad térmica de BplAr-6H y BplAr-6H-G28S 23
Capítulo 3 25
 Introducción 25
 Reseña histórica de la estereoquímica 26
 Nomenclatura 27
 La quiralidad en los sistemas biológicos 28
 La industria de la quiralidad 32
Capítulo 4 Hipótesis y Objetivos 36
Capítulo 5 Materiales yMétodos 37
 Esquema general de trabajo 37
 Materiales 38
 Métodos 40
Capítulo 6 Resultados y Discusión 51
 Reactivación de las cepas de E. coli 51
 Expresión de las proteínas recombinantes BplAr-6H y BplAr-6H-G28S 51
 Purificación de las proteínas recombinantes 52
 Determinación de la concentración y grado de pureza de las lipasas 54
 Determinación de las constantes de inactivación enzimática (ki) 55
 Caracterización cinética (kcat y Km) 59
 Análisis cromatográfico de las reacciones de hidrólisis del (R,S)-1-feniletil acetato 62
 Análisis cromatográfico de las reacciones de hidrólisis del rac-naproxenato de metilo 73
Capítulo 7 Conclusiones y Perspectivas 79

Bibliografía 81
Anexo 1 86
Anexo 2 87
Anexo 3 88
Anexo 4 89

Resumen

En las últimas dos décadas, las lipasas (triacilglicerol éster hidrolasas EC 3.1.1.3) se han
convertido en los catalizadores cuyo estudio e interés industrial se ha
incrementado.Éstas enzimas se caracterizan por su capacidad para catalizar tanto la
hidrólisis como la síntesis de ésteres, reacciones que en algunos casos ocurren con gran
regio- y enantioselectividad. Las lipasas son enzimas que se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza, sin embargo, las lipasas microbianas han sido objeto de
mayor investigación como consecuencia de la facilidad con que se producen y del gran
potencial biotecnológico que poseen.
Bacillus pumilus cepa GMA1 produce una lipasa (BplA) que posee propiedades
estructurales y catalíticas que resultan interesantes. El trabajo que se muestra a
continuación se centra en el estudio de la enantioselectividad hidrolítica que presentan
las lipasas recombinantes de B. pumilus (BplAr-6H) y la mutante Gly28Ser (BplA-6H-
G28S); ésta última, una proteína que presenta una mutación en el residuo del
aminoácido Gly28 por Ser y que es más activa que su forma silvestre [Mora, 2008].
La purificación de las lipasas recombinantes se llevó a cabo mediante cromatografía de
afinidad, para ello, se emplearon dos columnas empacadas con resina que posee
afinidad por etiquetas de Histidina (Protino™ Ni-TED). La evaluación de la estabilidad
térmica se efectuó mediante el cálculo de la constante cinética de inactivación térmica
(ki). La caracterización cinética (kcat y Km) se llevó a cabo mediante el seguimiento
espectrofotométrico del progreso de la reacción de hidrólisis del 4-nitrofenil acetato.
Por otro lado, el estudio de la enantioselectividad para ambas lipasas se efectuó por
análisis cromatográfico de reacciones de hidrólisis del rac-1-feniletil acetato. Los
resultados muestran que bajo las condiciones que se emplearon, ambas lipasas tienen
preferencia hacia el enantiómero (R) y que el valor de exceso enantiomérico que se
obtiene a partir de BplAr-6H fue apenas superior al obtenido por BplAr-6H-G28S.
Abreviaturas usadas

Abreviaturas usadas

4-NF 4-nitrofenol.
4-NFA 4-nitrofenil acetato.
BCA Ácido Bicinconínico.
BplAr-6H Lipasa A recombinante de Bacillus pumilus.
BplAr-6H-
G28S
Lipasa A recombinante de Bacillus pumilus con mutación en el residuo
28.
BSA Albúmina Sérica Bovina.
c.c.f. Cromatografía en capa fina.
CalB Lipasa B de Candida antarctica.
DO600 Densidad Óptica determinada a 600nm de longitud de onda.
E.I. Estándar interno.
ee Exceso enantiomérico.
FDA Administración de alimentos y fármacos.
FID Detector de ionización de flama.
HSL Lipasa sensible a hormonas.
LB Medio Luria Bertani.
LBamp Medio Luria Bertani con Ampicilina (50 µg/ml).
Lip Lipasa.
NaCl Cloruro de Sodio
NSAID Fármaco antiinflamatorio no esteroideo.
pHopt Valor de pH óptimo.
r.p.m. Revoluciones por minuto.
rac- Racemato.
Topt Temperatura óptima.
tr Tiempo de retención.
UV254 Revelado con luz ultra violeta.

Capítulo 1. Lipasas

Capítulo 1.Lipasas

1.1 Introducción
Las lipasas (triacilglicerol éster hidrolasas EC 3.1.1.3.) son enzimas que catalizan la
reacción de hidrólisis de los enlaces éster que se encuentran presentes en los
triacilglicéridos. Los productos de esta reacción son ácidos grasos libres y glicerol
[Figura 1.1]. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza de la lipasa y de sus
condiciones de actividad, también pueden obtenerse como productos mono ó
diglicéridos con diferencias en las posiciones finales de esterificación [Godtfredsen,
1990].
En ausencia de agua las lipasas también pueden catalizar reacciones de esterificación,
transesterificación (alcohólisis), interesterificación y acidólisis a partir de alcoholes,
ésteres y ácidos; además de la síntesis de amidas (aminólisis) y tioésteres partiendo de
ácidos, aminas y tioles [Kumar y Gross, 2000] [Figura 1.2].

Figura 1.1. Reacción de hidrólisis catalizada por las lipasas en presencia de agua.

Capítulo 1. Lipasas

Figura 1.2. Reacciones catalizadas por las lipasas en medios con cantidades mínimas de
agua. A) Reacción de esterificación; B) Reacción de transesterificación o alcohólisis de ésteres;
C) Reacción de interesterificación; D) Reacción de tiólisis de ésteres.

La actividad lipolítica que presentan las lipasas depende del área que posee la interfase
lípido-agua por unidad de volumen. A esta relación se le ha denominado “concentración
de interfase” y es una forma de determinar la concentración de sustrato disponible para
la catálisis. La concentración de interfase refleja la acción de la enzima en ésta región y
está estrechamente relacionada con que la lipasa requiera de permanecer en la fase
acuosa para posteriormente adsorberse en la interfase y así interactuar con el sustrato.

Capítulo 1. Lipasas

En algunas ocasiones, la actividad lipolítica está mediada por efectores, tales como
iones de metales alcalinos o alcalinotérreos; en el caso de la lipasa pancreática porcina,
también intervienen sales biliares y otros componentes no proteicos [O’Connor y Bailey,
1988].
La diferencia entre lipasas y esterasas siempre ha sido causal de debate, hasta hace
poco, el criterio para definir a una enzima como “lipasa verdadera” se basaba
principalmente en dos propiedades:
(a) La presencia del fenómeno llamado “activación interfacial”, que es descrito como
un incremento dramático de la actividad lipolítica en presencia de una interfase
lípido-agua [Sarda y Desnuelle, 1958].
(b) La presencia de una “tapa” cubriendo el sitio catalítico de la enzima [Brzozowsky
y col., 1991; Derewenda y col., 1992; van Tilbeurgh, y col., 1993].
La activación interfacial y la presencia de una tapa que cubra al sitio activo suelen estar
asociados, aunque se conocen varias lipasas que no cumplen con alguna o ambas
propiedades. La tapa del sitio activo de las lipasas está constituida por un giro
[Grochulski y col., 1994] ó por una y hasta dos hélices α [Brzozowsky y col., 1991;
Derewenda y col., 1992; Kim yo col., 1997; Schrag, y col., 1997]. El motivo estructural
que forma la tapa se mantiene en una configuración “abierta” en presencia de sustancias
hidrófobas, exponiendo el sitio catalítico y una superficie importante de la proteína que
también es hidrófoba. Se presume que esta porción de la superficie de la proteína
interactúa con la interfase lípido-agua. Actualmente se sabe que la presencia de una
tapa en la estructura de las lipasas no necesariamente está relacionada con el fenómeno
de activación interfacial [Verger, 1997]. Lipasas como la de P. aeruginosa, B. glumae y
C. antartica no muestran activación interfacial a pesar de contar con una tapa anfipática
que cubre sus sitios catalíticos [Jaeger y Reetz, 1998]. Por otro lado, algunas lipasas ni
siquiera presentan esta tapa, como ejemplo de ello, están la lipasa pancreática de cerdo
[Hjort y col., 1993], la cutinasa de F. solani o la lipasa de 19 kDa de B.subtilis [van
Pouderoyen ycol., 2001].
Capítulo 1. Lipasas

Las lipasas actúan en la interfase agua-lípido a diferencia de las esterasas que
hidrolizan el mismo tipo de enlace químico pero requieren que el sustrato sea soluble en
fase acuosa [Derewenda y Sharp, 1993]. Estudios de la especificidad de sustrato y
comportamiento cinético de algunas carboxilesterasas de diferente origen, tamaño y
estructura, permiten discriminar entre esterasas (carboxilesterasas no lipolíticas) y
lipasas (carboxilesterasas lipolíticas). Tal distinción se puede llevar a cabo cuando estas
enzimas se encuentran frente a vinil-ésteres de cadena corta, mediana y larga; triacil-
gliceroles; y p-nitrofenil butirato en solución y emulsión [Chahinian y Sarda, 2009].
Compuestos insolubles en agua y ésteres de cadena larga como el vinil-laurato, la
trioctanoína y el aceite de olivo son hidrolizados por lipasas, pero no así, por esterasas.
En contraste, ésteres de cadena corta que se caracterizan por ser parcialmente solubles
en agua, como el p-nitrofenil butirato, vinil acetato, vinil-propionato, vinil-butirato,
triacetina, tripropionina y tributirina, son hidrolizados con diferentes rendimientos tanto
por esterasas, como por lipasas [Chahinian y Sarda, 2009].
También existe una diferencia pronunciada en las propiedades cinéticas que estos dos
grupos de enzimas presentan frente a sus sustratos. Las esterasas, presentan actividad
máxima cuando la concentración del éster que se encuentra en solución está por debajo
de la concentración micelar crítica.Por otro lado, las lipasas muestran su actividad
máxima al encontrarse frente a emulsiones formadas cuando la concentración del éster
excede el punto de saturación [Chahinian y Sarda, 2009].

1.2 Clasificación
La distribución de las enzimas lipolíticas en la naturaleza es extensa, quizás como
consecuencia de que este tipo de enzimas presentan actividades que resultan
esenciales para muchos organismos. Las lipasas se encuentran presentes en animales,
plantas y microorganismos. Sin embargo, las lipasas de origen microbiano son las más
utilizadas en aplicaciones biotecnológicas y en la síntesis orgánica, principalmente
aquellas que son obtenidas a partir de levaduras y bacterias [Detry y col., 2006].
Capítulo 1. Lipasas

Todo lo anterior hace de las lipasas un grupo de enzimas con gran potencial industrial y
objeto de un intenso estudio [Bustos, 1995; Kynclova y col., 1995; Toida y col., 1998;
Woolley y Petersen, 1994; Alberghina y Lotti, 1998; Jaeger y Reetz, 1998; Kazlauskas,
R. J. and Bornscheuer, U. T. 1998; Namboodiri y Chattopadhaya, 2000].
Una porción importante de las lipasas se encuentra clasificada en cuatro grupos. Esta
clasificación se basa en el tipo de selectividad que presentan estas enzimas:
(a) Las lipasas de este grupocatalizan reacciones con regio-selectividad por las
posiciones externas de los triacilglicéridos (sn-1,3). Por ejemplo, están las lipasas
de Aspergillus niger y de Rhizopus delemar[Lanser y col., 2002].
(b) Este grupo de lipasas presentan regio-selectividad por la posición 2 del glicerol
(sn-2). Por ejemplo, la lipasa A de Candida antarctica[Lanser y col., 2002].
(c) En este grupo se encuentran enzimas que carecen de regio-selectividad, por
tanto, actúan en cualquiera de las tres posiciones (sn-1, 2, 3) [Bustos, 1998].
(d) Aquí están clasificadas las lipasas que presentan mayor selectividad por
triacilglicéridos que por glicéridos parciales (mono y diglicéridos), así como por
ciertos ácidos grasos que difieren en cuanto a la longitud de su cadena de acilo
[Bustos, 1998].
Por otra parte, también existe una clasificación específica para las enzimas lipolíticas de
origen microbiano. Ésta clasificación se fundamenta en la comparación de las
secuencias de aminoácidos y de algunas propiedades biológicas fundamentales [Tabla
1.1] [Arpigny y Jaeger, 1999]. La versión original de ésta clasificación comprende el
análisis de 53 enzimas que se encuentran distribuidas en 8 familias. A pesar de que la
clasificación propuesta por Arpigny y Jaeger, [1999] es relativamente antigua, aún
continúa vigente, debido a que la definición inicial de las familias se ha conservado.
 Familia I: Comprende a 22 miembros que están agrupados en 6 subfamilias, aquí
se incluyen aquellas lipasas provenientes del género Pseudomonas, organismos
Gram-positivos, entre otros:
Capítulo 1. Lipasas

 Subfamilia I.1; lipasas cuyo peso molecular aproximado es de 30 – 32 kDa.
Estas lipasas son secretadas por la vía tipo II (requieren de un transportador
externo).
 Subfamilia I.2; estas lipasas presentan un peso molecular aproximado de 33
kDa como consecuencia de la inserción de una secuencia de aminoácidos que
forma una doble hoja β-antiparalela en la superficie de la proteína.
 Subfamilia I.3; la lipasas de esta subfamilia se caracterizan por poseer un peso
molecular mayor al de las subfamilias I.1 y I.2, (Pseudomonas fluorescens, 50
kDa; Serratia marcescens, 65 kDa). También carecen de un péptido señal y de
residuos de cisteína. La secreción de este tipo de enzimas ocurre en un solo
paso a través de la vía tipo I.
 Subfamilia I.4; aquí se localizan algunas lipasas del género Bacillus, tienen en
común que en el pentapéptido consenso, el primer residuo de Gly es
remplazado por un residuo de Alanina (Ala-X1-Ser-X2-Gly), con un peso
molecular aproximado de 20 kDa son las lipasas más pequeñas conocidas
hasta el momento.
Comparten poca similitud en su secuencia de aminoácidos respecto a las otras
lipasas de la familia I (14 – 16 %). La lipasa de Bacillus pumilus, se encuentra
clasificada al interior de ésta subfamilia [Arpigny y Jaeger, 1999].
 Subfamilia I.5; en esta subfamilia se encuentran clasificadas algunas lipasas
del género Bacillus y del género Staphylococcus. Bacillus thermocatenulatus y
Bacillus stearothermophilus producen lipasas con características similares,
la masa molecular de estas enzimas se aproxima a 45 kDa y muestran
actividad máxima a un valor de pH 9.0 y temperatura de 65 °C. Por otro lado
con una masa molecular aproximada a 75 kDa, las lipasas de Staphylococcus
presentan gran similitud entre sus secuencias de aminoácidos. Resulta
interesante que la lipasa de Staphylococcus hyicus es la única que presenta
una actividad de fosfolipasa.

Capítulo 1. Lipasas

 Subfamilia 1.6; estas enzimas presentan una identidad del 39 % respecto a
otras familias y una similitud aproximada al 50 % al interior de esta subfamilia.
La región central de estas lipasas es idéntica hasta en un 50 %, a la que posee
la lipasas de Bacillus subtilis y a las encontradas en la subfamilia I.2.
 Familia II (GDSL): Las enzimas que constituyen a esta familia no presentan el
pentapéptido convencional Gly-X1-Ser-X2-Gly, en su lugar muestran una
secuencia Gly-Asp-Ser-(Leu) [GDS (L)], motivo que contiene el residuo de serina
perteneciente al sitio catalítico. En estas enzimas, el residuo catalítico yace
mucho más cerca del N-terminal que en otras enzimas lipolíticas.
 Familia III: Las enzimas de esta familia exhiben el plegamiento canónico de α / β
hidrolasa y contienen una triada catalítica típica.
 Familia IV (HSL): Está integrada por lipasas bacterianas que muestran una
similitud sorprendente en su secuencia de aminoácidos respecto a la lipasa
sensible a hormonasque se encuentra presente en los mamíferos. Las lipasas de
ésta familia poseen una elevada actividad relativa a temperaturas menores de 15
° C.
 Familia V: Son enzimas que proceden de bacterias mesófilas (Pseudomonas
oleovorans, Haemophilus influenzae, Acetobacter pasteurianus), psicrófilas
(Moraxella sp., Psychrobacter immobilis) y termófilas (Sulfolobus acidocaldarius).
Estas proteínas comparten una similitud de secuencia significativa (20 – 25 %)
con enzimas no lipolíticas como epóxido hidrolasas,deshalogenasas y
haloperoxidasas, las cuales poseen la típica estructura α/β hidrolasa así como
una triada catalítica similar a la de estas enzimas hidrolíticas.
 Familia VI: Las enzimas de esta familia son las esterasas más pequeñas que se
conocen actualmente, poseen una masa molecular aproximada de 23 – 26 kDa.
La forma activa de estas enzimas es un dímero y poseen en cada subunidad la
clásica conformación α/β hidrolasa y una triada catalítica. También exhiben una
similitud en la secuencia de aminoácidos cercana al 40% con las lisofosfolipasas
eucarióticas (fosfolipasas A2 independientes de Ca
2+).
Capítulo 1. Lipasas

 Familia VII: Aquí se agrupan esterasas bacterianas con un peso molecular
aproximado a 55 kDa. Comparten un 40% de similitud y un 30% de identidad en
la secuencia de aminoácidos con acetilcolina esterasas eucarióticas y
carboxilesterasas de hígado e intestino. Se encontró que la esterasa de Bacillus
subtilis hidroliza de manera muy eficiente ésteres p-nitrobencilo, este grupo de
moléculas son empleadas como grupos protectores en la síntesis de antibióticos
β-lactámicos.
 Familia VIII: Esta familia está constituida por enzimas de aproximadamente 380
residuos y muestran una considerable similitud con varias β-Iactamasas clase C.
El sitio activo de estas esterasas involucra un motivo conservado de Ser-X1-X2-
Lys en la parte N-terminal. Sin embargo, se ha sugerido que en el sitio activo se
presenta una secuencia Gly-X1-X2-Gly, por lo que es necesaria más información
estructural para describir claramente el mecanismo catalítico de esta familia de
esterasas.
Tabla 1.1. Familias de enzimas lipolíticas de origen microbiano.
Familia Subfamilia Cepa productora
No. de
acceso
Similitud (%)
Propiedades
Familia Subfamilia
I
1
Pseudomonas aeruginosa* D50587 100
Lipasas
verdaderas
Pseudomonas fluorescens C9 AF031226 95
Vibrio cholerae X16945 57
Acinetobacter calcoaceticus X80800 43
Pseudomonas fragi X14033 40
Pseudomonas wisconsinensis U88907 39
Proteus vulgaris U33845 38
2
Burkholderia glumae* X70354 35 100
Chromobacterium viscosum* Q05489 35 100
Burkholderia cepacia* M58494 33 78
Pseudomonas luteola AF050153 33 77
3
Pseudomonas fluorescens SIK W1 D11455 14 100
Serratia marcescens D13253 15 51
4
Bacillus subtilis M74010 16 100
Bacillus pumilus A34992 13 80
5
Bacillus stearothermophilus U78785 15 100
Bacillus thermocatenulatus X95309 14 94
Staphylococcus hyicus X02844 15 29 Fosfolipasa
Staphylococcus aureus M12715 14 28 Lipasas
verdaderas Staphylococcus epidermidis AF090142 13 26
Capítulo 1. Lipasas

Tabla 1.1. Familias de enzimas lipolíticas de origen microbiano. (Continuación)
Familia Subfamilia Cepa productora
No. de
acceso
Similitud (%)
Propiedades
Familia Subfamilia
I 6
Propionibacterium acnes X99255 14 100 Lipasas
verdaderas Streptoimyces cinnamoneus U80063 14 50
II
(GDSL)
α

Aeromonas hydrophila P10480 100 Aciltransferasa
a

Streptomyces scabies* M57297 36 Esterasa
a

Pseudomonas aeruginosa AF005091 35 Esterasa
b

Salmonella typhimurium AF047014 28 Esterasa
b

Photorhabdus luminescens X66379 28 Esterasa
a

III
Streptomyces exfoliatus* M86351 100 Lipasas
extracelulares Streptomyces albus U03114 82
Moraxella sp. X53053 33
Esterasa
extracelular 1
IV
(HSL)
β

Alicyclobacillus acidocaldarius X62835 100 Esterasa

Pseudomonas sp. B11-1 AF034088 54 Lipasa
Archaeoglobus fulgidus AE000985 48 Carboxilesterasa
Alcaligenes eutrophus L36817 40 Lipasa putativa
Escherichia coli AE000153 36 Carboxilesterasa
Moraxella sp. X53868 25
Esterasa
extracelular 2
V
Pseudomonas oleovorans M58445 100
PHA-
despolimerasa
c

Haemophilus influenzae U32704 41 Esterasa putativa
Psychrobacter immobilis X67712 34
Esterasa
extracelular
Moraxella sp. X53869 34
Esterasa
extracelular 3
Sulfolobus acidocaldarius AF071233 32 Esterasa
Acetobacter pasteurianus AB013096 20 Esterasa
VI
Synechocystis sp. D90904 100 Carboxilesterasas
Spirulina platensis S70419 50
Carbamato
Hidrolasa
Pseudomonas fluorescens* S79600 24
Rickettsia prowazekii Y11778 20
Chlamydia trachomatis AE001287 16
VII

Arthrobacter oxydans Q01470 100
p-
nitrobencilesterasa

Bacillus subtilis P37967 48
Streptomyces coelicolor CAA22794 45
Carboxilesterasa
putativa

Capítulo 1. Lipasas

Tabla 1.1. Familias de enzimas lipolíticas de origen microbiano. (Continuación)
Familia Subfamilia Cepa productora
No. de
acceso
Similitud (%)
Propiedades
Familia Subfamilia
VIII

Arthrobacter globiformis AAA99492 100
Esterasa
estereoselectiva
Streptomyces chrysomallus CAA78842 43
Esterasa unida a
célula.
Pseudomonas fluorescens SIK W1 AAC60471 40 Esterasa III
a
secretada;
b
unida a membrana externa;
c
polihidroxialcanoato;
α
motivo [Gly-Asp-Ser-(Leu)];
β
lipasa sensible a hormonas; *enzimas
lipolíticas con estructura tridimensional conocida.

1.3 Estructura
El patrón común de plegamiento de todas las lipasas es una estructura α/β hidrolasa
[Ollis y col., 1992]. Éste patrón consta de una hoja β central que típicamente cuenta con
8 hebras paralelas, excepto la segunda que es anti paralela. Las secciones β3 a β8
están conectadas por hélices α que se encuentran unidas a cada lado de la hoja β
central [Figura 1.3].
En las familias de las lipasas bacterianas cuya estructura se encuentra descrita, se ha
encontrado el mismo patrón de plegamiento, pero también se sabe que existen algunas
diferencias características de cada familia en cuanto a la longitud y arquitectura de la
cadena polipeptídica [Arpigny y Jaeger, 1999; Jaeger y Reetz, 1998].

Figura 1.3. Patrón de plegamiento de las lipasas. A) Plegamiento canónico α/β hidrolasa; B)
Topología de estructura secundaria. La posición de los residuos catalíticos se muestra con círculos sólidos. La
línea punteada indica que se trata de asas con longitud variable.
Capítulo 1. Lipasas

Con base en estudios por cristalografía de rayos X, se sabe que el sitio catalítico se
localiza en el carboxilo terminal de la hoja β central. Los tres residuos de aminoácidos
que lo constituyen conservan de forma invariable el siguiente orden: Un residuo
nucleófilo (Ser, Cys o Asp); un residuo ácido (Asp o Glu); y un residuo de histidina.
Generalmente el residuo de serina se encuentra localizado al interior de un pentapéptido
altamente conservado (Gly-X1-Ser-X2-Gly), sin embargo, también ocurre que en las
lipasas provenientes del genero Bacillus (subfamilia 1.4), la secuencia cambia por Ala-
X1-Ser-X2-Gly [Jaeger y Reetz, 1998; Jaeger y col., 1999; Derewenda y col., 1992]. La
secuencia de aminoácidos altamente conservada está ubicada dentro de un motivo
estructural nombrado β-εSer-α [Derewenda y Sharp, 1993]. Dicho motivo consta de tres
elementos estructurales: Una hebra β seguida de un giro rígido que contiene al residuo
de serina y, a continuación, una hélice α. Las características estructurales de este
motivo, colocan al residuo nucleófilo en la superficie del sitio activo, esto permite el
acceso del residuo de histidina por uno costado y la entrada del sustrato por el lado
restante.
El segundo residuo catalítico (Asp) se encuentra localizado en el asa que conecta a la
hebra β7 con la hélice αE; por último, el tercer residuo catalítico que es la histidina está
ubicado en un asa que sigue a la hebra β8 de la hoja central [Figura 1.3].
Otra característica estructural encontrada en varias lipasas es el dominio que
corresponde a la tapa del sitio activo.Generalmente este dominio consiste en una hélice
corta de carácter anfipático. La mayoría de lipasas bacterianas presentan un dominio
similar que cubre sus sitios catalíticos [Jaeger y col., 1999], algunos ejemplos de este
tipo son las lipasas que generanalgunas especies de Staphylococcus [Rosenstein y
Gotz, 2000] y Pseudomonas [Noble y col., 1994; Kim y col., 1997; Schrag y col. 1997].

Capítulo 1. Lipasas

En el caso de la lipasa de Mucor miehei, este dominio se encuentra en una configuración
abierta cuando la enzima está en contacto con una interfase lípido – agua, exponiendo
así, a la triada catalítica y a una gran superficie de la proteína con carácter hidrófobo de
aproximadamente 750 Å2 [Brockman y col., 1973], en la que participan principalmente 12
residuos de aminoácidos: Ile85, Trp88, Ile89, Leu92, Phe94, Val205, Leu208, Phe213,
Val254, Leu255, Leu 258 y Leu267 [Brzozowsky y col., 1991; Derewenda y col., 1992].
Estos aminoácidos se encuentran altamente conservados de acuerdo con la
comparación de las secuencias de otras lipasas conocidas, hecho que confirma su
importancia funcional en la interacción con la fase lipídica.
1.4 Mecanismo catalítico
Las lipasas poseen la capacidad de catalizar reacciones de hidrólisis sobre los enlaces
éster presentes en los acilgliceroles. En sistemas acuosos, cuando la hidrólisis del
sustrato ocurre por completo, se liberan ácidos grasos y glicerol como productos. Sin
embargo, ocurre que cuando el medio de reacción es de carácter orgánico las
reacciones que se ven favorecidas son las de esterificación, alcohólisis, aminólisis y
tiólisis [Kumar y Gross, 2000].
El mecanismo químico que describe la reacción de hidrólisis de lípidos por la acción de
las lipasas ya está establecido [Jaeger y Reetz, 1998; Jaeger y col., 1999]. El primer
paso que ocurre para la hidrólisis del sustrato es el ataque nucleofílico al carbono del
grupo carbonilo que se encuentra formando el enlace éster, dicho ataque ocurre por
parte del átomo de oxígeno procedente del grupo hidroxilo que está presente en el
residuo de serina; este paso induce la formación de un intermediario tetraédrico que se
caracteriza por poseer una carga negativa en el átomo de oxígeno y por estar
estabilizado mediante interacciones con un macrodipolo generado por la hélice αC y por
puentes de hidrógeno establecidos con un par de grupos NH (amida del enlace
peptídico)[Jaeger y Reetz, 1998; Jaeger y col., 1999].

Capítulo 1. Lipasas

A la configuración estructural que adoptan estos grupos en relación al oxianión se le
conoce como “cavidad oxianiónica”. Uno de los grupos NH con los que se establecen los
puentes de hidrógeno proviene de un residuo que está localizado por detrás de la serina
nucleofílica, el otro residuo que estabiliza al intermediario mediante un grupo NH está
colocado en la porción final de la hoja β3. El ataque nucleofílico por parte de la serina es
favorecido por la participación del residuo de histidina; ésta participación consiste en
recibir el protón proveniente del grupo hidroxilo presente en la serina; dicha transferencia
es facilitada por la presencia de un ácido que orienta el anillo imidazol de la histidina y
neutraliza de manera parcial la carga recién generada en él, a continuación, éste protón
es cedido al oxígeno del enlace éster para formar un alcohol; En este punto del
mecanismo, el componente ácido del sustrato es esterificado por la serina nucleofílica
(intermediario que está unido covalentemente), mientras que el alcohol es liberado. La
reacción continúa con un paso de desacilación, en el cual una molécula de agua
participa hidrolizando al intermediario covalente; La histidina catalítica activa a ésta
molécula de agua quitándole un protón, el ión OH- resultante ataca al carbono carbonilo
del grupo acilo que se encuentra unido covalentemente a la serina. Posteriormente, la
histidina cede un protón al oxígeno del residuo activo de serina; de esta forma, es
liberado el componente acilo para formar un ácido carboxílico. Después de la difusión de
éste ácido carboxílico, la enzima se encuentra disponible para un nuevo ciclo catalítico
[Figura 1.4] [Jaeger y Reetz, 1998; Jaeger y col., 1999].

Capítulo 1. Lipasas

1.4 Aplicaciones industriales
Las lipasas microbianas constituyen un importante grupo de enzimas con valiosas
aplicaciones biotecnológicas. La versatilidad de sus propiedades enzimáticas y la
facilidad de producción a gran escala, son sólo algunas de las causas que las hacen
sumamente atractivas para aplicaciones industriales [Tabla 1.2].

Figura 1.4. Mecanismo de reacción de las lipasas. 1) Activación del residuo nucleófilo de
serina y ataque nucleofílico al carbono carbonilo del enlace éster. 2) Formación del
intermediario tetraédrico, reorganización electrónica previa a la liberación del motivo
alcohólico del éster y formación del intermediario covalente (“acil-enzima”). 3) La molécula
de agua entrante es activada por el residuo de histidina que se encuentra próximo, el ión
hidroxilo resultante ataca al átomo de carbono carbonilo del intermediario covalente
ocurriendo así la liberación del alcohol (producto 1). 4) El residuo de histidina dona un protón
al átomo de oxígeno del residuo activo de serina, el enlace éster entre la serina y el
componente acilo se rompe para liberar al componente acilo (producto 2) y para que la
enzima se encuentre disponible para un nuevo ciclo catalítico.
Capítulo 1. Lipasas

Tabla 1.2. Aplicaciones industriales de las lipasas.
Industria Aplicación
De las grasas y Oleoquímica.
Elaboración de grasas de “diseño” ó “estructuradas” (Betapol®); obtención
de productos substitutos como grasa de cacao, mantequillas, margarinas;
producción de biodisel.
De los polímeros.
Elaboración de poliésteres aromáticos, poliésteres biodegradables y
aditivos para combustibles (1-butil oleato).
Textil
Para la remoción de algunos lubricantes incorporados a las telas; mejora de
los procesos de deslavado de la mezclilla; modificación enzimática de fibras
sintéticas.
De los detergentes
Adición a detergentes para mejorar su eficacia, permitiendo una reducción
del gasto energético y la carga ambiental.
Farmacéutica, Cosméticos y Médica
Síntesis de precursores y resolución de mezclas racémicas; fabricación de
ingredientes emolientes (isopropil miristato, isopropil palmitato, 2-etilhexil
palmitato) y retinoides; como herramientas de diagnóstico y biosensores.
Alimentos
Como aditivos para modificar o generar compuestos que imparten el sabor
y aroma (síntesis de ésteres a partir de ácidos grasos de cadena corta y
alcoholes).
Papel y celulosa.
La adición de lipasas permite la obtención de un mayor rendimiento, mejora
la blancura del papel, incrementa la vida útil de la maquinaria y reduce los
residuos contaminantes

Otros factores que hacen de las lipasas un conjunto de valiosos catalizadores, es que
actúan en condiciones de reacción suaves, muestran alta estabilidad en solventes
orgánicos, elevada especificidad de sustrato y generalmente exhiben gran regio- y/o
estéreo-selectividad [Hasan y col., 2006].
1.5 Lipasas del género Bacillus
Existen dos grupos de lipasas del género Bacillus; las lipasas de alto peso molecular de
la subfamilia I.5 y las lipasas de menor peso molecular agrupadas en la subfamilia I.4.
En las lipasas de este último grupo, la secuencia característica Gly-X1-Ser-X2-Gly del
pentapéptido que contiene al residuo catalítico de serina se modifica a una secuencia de
Ala-X1-Ser-X2-Gly. Además, las secuencias en derredor de los sitios catalíticos Asp e His
son por completo diferentes en comparación con las presentes en las otras familias
[Jaeger y col., 1999].
Capítulo 1. Lipasas

Las lipasas de la subfamilia I.4 son las lipasas más pequeñas conocidas con un peso
molecular de 19-20 kDa. Hasta el año 1999 sólo tres enzimas estaban clasificadas en
esta subfamilia; dos lipasas de Bacillus subtilis (BslA y BslB) y una lipasa de Bacillus
pumilus (Bpl). Ésta última comparte un 80% de identidad de secuenciacon respecto a
LipA de B. subtilis. Actualmente, se han incorporado a esta subfamilia lipasas
provenientes de B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus DBRL-191, B. sp. B26 y B.
circulans. Todas estas enzimas presentan una identidad marginal de secuencia (15%
aproximadamente) con las lipasas provenientes del género Bacillus que forman parte de
la subfamilia I.5 y con otras lipasas aún más grandes[Arpigny y Jaeger, 1999].
Dentro de las lipasas del género Bacillus pertenecientes a la subfamilia I.4, la BslA es la
más estudiada. Se han desarrollado estudios muy completos de la estructura del gen,
mecanismo de secreción, caracterización bioquímica de la proteína y aplicaciones
biotecnológicas [Dartois y col., 1992; Lesuisse y col., 1993; Dartois y col., 1994; Detry y
col., 2006]. Además, es la única enzima de la subfamilia I.4 de la que se ha reportado su
cristalización y elucidado su estructura tridimensional [van Pouderoyen y col, 2001]. Por
otro lado, el resto de las lipasas de la subfamilia I.4 no han sido estudiadas
exhaustivamente. Muestra de ello es que una porción importante de éstas no han sido
cristalizadas y que existen pocos estudios de sus propiedades cinéticas[Bustos y col.,
2010], a pesar de que muchas de estas enzimas han sido expresadas y purificadas a
partir de E. coli.

Capítulo 2. Lipasas

Capítulo 2.Lipasa de Bacillus pumilus GMA1

2.1 Introducción
El género Bacillus pertenece a la familia Bacillaceae, que a su vez pertenece al orden de
las bacterias con bajo contenido de G+C que está comprendido en la clase de los
Firmicutes (Gram positivas) del phylum de las Eubacterias. Éste género presenta un
gran número de especies debido a la existencia de cierta ambigüedad en su clasificación
original. Los únicos requisitos taxonómicos para pertenecer a este género solían ser: Ser
un bacilo largo, formar endosporas, reacción positiva a la tinción de Gram y reacción
catalasa positiva [Berkeley y col., 1984].
El interés en el género Bacillus surge como consecuencia del estudio de las
características que le permiten colonizar distintos ambientes, inclusive, bajo condiciones
de temperatura y pH relativamente extremos. Las bacterias de éste género poseen
esporas que pueden presentar termo-resistencia. También tienen la capacidad de
metabolizar una gran variedad de sustratos gracias a sus enzimas hidrolíticas [Berkeley
y col., 1984]. Lo anterior hace del género Bacillus un agente contaminante en potencia,
pero a la vez también una fuente importante de enzimas con aplicaciones
biotecnológicas [Harwood, 1992; Sietske y col., 1994].
2.2Bacillus pumilus GMA1
Bacillus pumilus GMA1 [Figura 2.1] es un microorganismo que fue aislado en Los
Azufres, Michoacán, México. Esta cepa produce una lipasa que muestra preferencia por
los ácidos grasos de cadena corta como sustrato [Bustos, 1998].

Capítulo 2. Lipasas

La actividad catalítica de esta enzima ha sido caracterizada frente a distintas
condiciones fisicoquímicas, encontrándose valores óptimos de temperatura y pH
interesantes para su uso en aplicaciones industriales [Wong, 2001].

Figura 2.1.Bacillus pumilus GMA1a 10,000x. La línea de
escala representa 5 µM. [Wong, 2001]

2.3 Lipasa de Bacillus pumilus GMA1
La lipasa de B. pumilus GMA1 (BplA) es homóloga a LipA de B. subtilis [Bustos, 1998].
Esta última se sintetiza como pro-enzima, presentando un péptido señal de 31
aminoácidos que se pierde durante la secreción al medio extracelular [Dartois y col.,
1992]. En su forma madura estas lipasas poseen 181 residuos de aminoácidos y tienen
un peso aproximado de 19.5 kDa.
A partir de que fueron publicados los datos cristalográficos para la LipA de B. subtilis
[van Pouderoyen y col., 2001] se ha modelado la estructura de BplA por homología
[Figura 2.2]. Para ello se ha considerado el alto porcentaje de similitud que existe entre
ambas proteínas (80%) [Bustos, 1995].
Capítulo 2. Lipasas

La estructura se muestra como una molécula globular con un plegamiento clásico α/β
hidrolasa con 6 hebras-β paralelas flanqueadas por 5 hélices-α.
La triada catalítica está constituida por los residuos de Ser77, Asp133 e His156. Los
grupos amida de los residuos Ile12 y Met78 forman la cavidad oxianiónica y están en
posiciones muy similares a las encontradas en otras lipasas cuya estructura es
conocida. El dominio correspondiente a la tapa del sitio activo no se encuentra presente,
por lo que los residuos catalíticos se encuentran expuestos al disolvente.

Figura 2.1. Modelo estructural de BplA. Se resaltan los residuos catalíticos
Ser77, Asp 133 e His 156.

Capítulo 2. Lipasas

2.3.1 Similitud con otras lipasas de género Bacillus
El porcentaje de homología que guarda la secuencia de aminoácidos de la lipasa A de B.
pumilus frente a las de otras lipasas del género Bacillus es elevado. En la subfamilia I.4,
donde se encuentra clasificada, parte de un 80%. En lo que respecta al pentapéptido
consenso característico de estas enzimas, en él se aprecia un cambio en la primera
posición. La secuencia resultante del cambio de Gly por Ala es: A-X1-S-X2-G. El resto de
los aminoácidos se encuentra altamente conservado (A-H-S-M-G)[Arpigny y Jaeger,
1999].
Los residuos que constituyen la cavidad oxianiónica (Ile12 y Met78) también están
conservados, excepto en el caso de la lipasa de B. pumilus B26 donde existe un cambio
de la Ile por Met en la posición 12. Sin embargo, ésta diferencia podría no tener
consecuencias catalíticas importantes, ya que es el átomo de Hidrógeno que está unido
al Nitrógeno de la amida perteneciente al enlace peptídico el que interactúa con el
oxianión [Hyung y col., 2002].
2.3.2 Propiedades bioquímicas
La actividad catalítica de la BplA ha sido caracterizada a partir de extractos parcialmente
purificados. Esta caracterización se llevó a cabo estudiando la reacción de hidrólisis de
una emulsión de tributirina a distintos valores de pH y temperatura. Los resultados
obtenidos de este estudio muestran que los valores de temperatura (Topt) y pH (pHopt)
óptimos son 50°C y 10, respectivamente [Wong, 2001]. Por otro lado, también se sabe
que ésta lipasa presenta preferencia por ácidos grasos de cadena corta como sustratos
[Bustos, 1998].
En la actualidad, varias decenas de enzimas lipolíticas de la familia I.4 han sido
identificadas y caracterizadas a partir de especies del género Bacillus. Entre éstas se
encuentran lipasas y esterasas de microorganismos mesófilos ó termófilos. En la tabla
2.1 se muestran las propiedades bioquímicas de algunas de estas enzimas en donde se
pueden apreciar la existencia de algunas diferencias importantes entre ellas.
Capítulo 2. Lipasas

Tabla 2.1. Características bioquímicas de algunas lipasas producidas por microorganismos
del género Bacillus.
Microorganismo de
procedencia
pH de máxima
actividad
Temperatura de
máxima actividad
(°C)
Peso molecular
(kDa)
Referencia
B. pumilus DSM5776 9.5 30 19.3 [Möller y col., 1991]
B. pumilus B26 8.5 35 19.2 [Kim y col., 2002]
B. subtilis 168, Lip A 10.0 37 19.3 [Lesuisse y col., 1993]
B. pumilus GMA1* 10.5 50 19.5 [Bustos, 1998]
B. licheniformis 10.0-11.5 50-60 19.2 [Nthangeni y col., 2001]
Bacillus sp. THL027 6.4 60 22.0 [Dharmsthiti y Luchai, 1999]
*valores obtenidos a partir de extractos parcialmente purificados de B. pumilus GMA1.

Dentro del grupo destacan las lipasas de B. licheniformis y B. pumilus GMA1 como las
enzimas con actividad a valores de temperatura más elevados. Los valores de Topt para
éste par de enzimas oscilan entre 50 y 60°C. En un análisis de la secuencia de éstas
dos enzimas se destaca un aminoácido en común (Glicina 28) que no se encuentra
presente en el resto de las lipasas cuya Topt es inferior. Esto sugería que la mutación
Gly28:Ser tendría repercusionesen la termoactividad de la enzima. Se clonó la enzima
silvestre en un vector de expresión y se le adicionó una etiqueta de His (BplA-6H) en el
extremo C-terminal. Sobre esta construcción se realizó la mutanción Gly28:Ser (BplA-
6H-G28S). Ambos genes se expresaron en E. coli, las proteínas se purificaron y sus
propiedades catalíticas fueron estudiadas dentro del grupo de trabajo del Dr. Bustos
[Mora, 2008; Bustos-Jaimes y col., 2010].
2.3.3 Parámetros cinéticos y estabilidad térmica de BplAr-6H y BplAr-6H-
G28S
La estabilidad térmica y los parámetros cinéticos de la lipasa recombinante de B.
pumilus GMA1 (BplAr-6H) y de algunas mutantes fueron estudiados por Mora [2008]. En
la tabla 2.2 se muestran algunos de los resultados obtenidos.

Capítulo 2. Lipasas

En ellos se percibe que al incrementar la temperatura ocurre una disminución importante
en laKm mientras que la kcat no cambió considerablemente. Esta tendencia se traduce en
un incremento de la especificidad con que la enzima se une al sustrato debida al cambio
en la temperatura. Por otra parte, la estabilidad térmica disminuyó en proporción inversa
con el aumento de la temperatura.
Tabla 2.2. Parámetros cinéticos y termoestabildad de las lipasas BplAr-6H y BplAr-6H-
G28S[Mora, 2008].
Enzima
Propiedades catalíticas* Estabilidad*
Temperatura Km kcat kcat/Km kie t1/2
(°C) (µM) (min
-1
)
x10
2

(µM
-1
min
-1
)
x10
5
(min
-1
)
(min)
BplAr-6H
20 726.48 86.28 11.88 0.76 9120.4
25 400.67 51.10 12.75 61.74 112.3
30 245.28 44.50 18.14 152.50 45.5
35 97.56 45.51 46.65 291.40 23.8
40 108.46 66.28 61.11 898.10 7.7
BplAr-6H-G28S
20 101.18 247.16 24.69 0.30 23104.9
25 662.27 229.14 34.60 2.44 2840.8
30 383.41 208.42 54.36 112.20 61.8
35 250.30 228.13 91.14 169.10 41.0
40 195.24 259.20 132.76 1198.0 5.8
*valores obtenidos a pH 7.5 y Tritón X-100 1% v/v.

En otros estudios se ha determinado que la lipasa A de B. subtilis realiza hidrólisis
enantioselectivas [Funke y col., 2003; Boersma y col., 2008; Bustos-Jaimes y col., 2009].
Además existen reportes de que la lipasa de B. pumilus DBRL-191, también homóloga a
la lipasa A de B. subtilis, posee gran enantioselectividad hidrolítica [Rasool y col., 2005].
Estos estudios sugieren que la lipasa de B. pumilus GMA1 podría ser un catalizador
enantioselectivo. Sin embargo, un trabajo previo dentro de nuestro grupo, en el cual la
lipasa BplAr-6H se inmovilizó en un material a base de silicatos, demostró que esta
enzima no presenta enantioselectividad en la síntesis de ésteres de 1-feniletanol en
medio orgánico [Cruz-Martínez, comunicación personal]. Por estas razones, en este
trabajo se estudió la enantioselectividad hidrolítica de la BplAr-6H.
Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

Capítulo 3.Relevancia de los compuestos
enantiopuros

3.1 Introducción
La cantidad de compuestos orgánicos que se conocen a la fecha es inmensa. Una
porción importante de estos compuestos son el resultado de un fenómeno que es
llamado isomería. Los isómeros químicos son compuestos que poseen idénticas
fórmulas moleculares pero que presentan diferencias en la forma en que se encuentran
unidos sus átomos y/o en la distribución espacial que estos átomos guardan [Ai y col.,
2006].
Existen dos tipos principales de isómeros: los isómeros constitucionales y los
estereoisómeros [Figura 3.1]. Al interior del grupo de los estereoisómeros se encuentran
clasificados aquellos compuestos que ostentan la singularidad de poseer por lo menos
un átomo de carbono asimétrico. Un átomo de carbono es asimétrico cuando propicia
alguna de tres situaciones al interior de una molécula:
(e) La obtención de enantiómeros (estereoisómeros que son imágenes especulares
uno del otro) y de diastereómeros o diastereoisómeros (estereoisómeros que no
son imágenes especulares uno del otro). La obtención de éstos últimos sólo es
posible cuando existen dos o más átomos de carbono asimétricos en la misma
molécula.
(f) La generación de isómeros geométricos. Éste grupo de isómeros se encuentra
clasificado al interior del conjunto de los diastereómeros.
Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

(g) La formación de los compuestos meso. Ésta clase de compuestos carecen de
actividad óptica a pesar de poseer átomos de carbono asimétricos.

Figura 3.1. Clasificación de los isómeros químicos. [Wade, 2004]

3.2 Reseña histórica de la estereoquímica
El origen de la estereoquímica se suscitó en el periodo de 1848 a 1853, cuando Louis
Pasteur logró discernir y separar los dos isómeros del ácido tartárico. La resolución de
ésta mezcla racémica sólo fue el comienzo de una serie de experimentos. En ellos,
Pasteur observó que las soluciones preparadas a partir de cada uno de los isómeros
tenían la capacidadpara desviar al plano de la luz polarizada en direcciones opuestas.
Con base en éstas observaciones, el químico y biólogo francés concluyó que el
fenómeno óptico debía ser generado por un conjunto de átomos asimétricos que
constituyen a las moléculas [Leffingwell y col., 2003; Ai y col., 2006].
Algunos años después, tras el descubrimiento hecho por Kekulé en 1858 de que el
átomo de carbono tiene una valencia de cuatro, los científicos J.H. Van’t Hoff y J.L. Le
Bel en el año de 1874 elucidaron de manera independiente y bajo esta premisa, que
cuando cuatro átomos ó grupos sustituyentes distintos se encuentran dispuestos en los
vértices de un tetraedro y éstos se hayan unidos a un átomo central de carbono, se
genera un arreglo geométrico cuyas dos posibles distribuciones espaciales, son
completamente diferentes [Leffingwell y col., 2003].
Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

La concepción de los términos quiral y quiralidad se consolidó hasta la década de 1870,
hecho que favoreció su empleo formal en la Química. Aparentemente, ambos términos
derivados de la palabra griega kéir que significa “mano”, fueron acuñados por Lord
Kelvin en sus lecciones de Baltimore sobre la dinámica molecular y la teoría ondulatoria
de la luz [Leffingwell y col., 2003].
3.2.1 Nomenclatura
A menudo los químicos asignaban nombres triviales para diferenciar entre isómeros. Sin
embargo, esto resultó insuficiente, dando paso a una nomenclatura general y más
simple, donde los enantiómeros eran clasificados por medio de los prefijos d- ó (+) para
dextrorotatorio y l- ó (-) en caso de que su comportamiento óptico resultase levorotatorio
[Patočka y Dvořák, 2004; Wade, 2004]. Éste sistema ha sido usado en la Química por un
largo periodo de tiempo. Empero, en la actualidad se sabe que la rotación del plano de la
luz polarizada no es una propiedad que dependa únicamente de los compuestos en
solución. También depende de factores como la naturaleza del solvente empleado para
la preparación de las mismas. Un ejemplo de éste hecho, es lo que ocurre con el
fármaco Cloramfenicol. En solución alcohólica, el estereoisómero que posee la actividad
farmacológica presenta un comportamiento dextrorotatorio, mientras que en acetato de
etilo el resultado es levorotatorio [Hutt y Tan, 1996].
El segundo mecanismo implementado para la nomenclatura de los enantiómeros fue el
sistema D/L. Aunque el uso de este mecanismo aún es amplio, en la actualidad se
reserva para nombrar a los isómeros de los carbohidratos y de los aminoácidos [Patočka
y Dvořák, 2004].
Finalmente, en el año de 1956 Canh, Ingold y Prelog desarrollaron el conjunto de reglas
que aún se mantiene vigente. En ellas se estipula que para determinar la configuración
absoluta de la molécula es necesario atender a las siguientes operaciones:
a) Identificar la presencia de centros estereogénicos y con base en ello representar
la estructura de la molécula bajo la proyección de Fisher.
Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros28

b) Asignar prioridad a los átomos que se encuentran unidos al centro estereogénico
con base en la masa atómica que posee cada uno de ellos [Figura 3.2]. A cada
átomo ó grupo sustituyente le será asignado un número acorde con la prioridad
que les haya sido asignada. El de mayor prioridad será el número 1 y el de menor
prioridad será el número 4.
c) Es necesario rotar la proyección de la molécula de tal forma que el grupo
sustituyente de menor prioridad se encuentre dispuesto en la parte posterior del
plano espacial de referencia.
d) Determinar alguna de las dos posibles configuraciones empleando como
referencia el sentido en el que giran las manecillas del reloj. El primer punto de
referencia será el átomo o grupo sustituyente con mayor prioridad y el último el de
menor prioridad. En caso de que la configuración corresponda con el sentido
natural en que las manecillas del reloj giran, la configuración absoluta será (R)-
(por rectus) ó si es el caso de que sea en el sentido opuesto se asignará la
configuración (S)- (por sinister) [Wade, 2004].

Figura 3.2. Prioridad para átomos unidos a un centro estereogénico. [Wade, 2004].

3.2La quiralidad en los sistemas biológicos
La quiralidad es una propiedad intrínseca de los aminoácidos y azúcares. Por lo tanto,
las consecuencias que se generan a partir de esta característica también se suscitan al
interior de los péptidos, proteínas y polisacáridos. Éstos tres grupos de moléculas
cuentan con una distribución muy amplia en la naturaleza, por consiguiente, la quiralidad
persiste en ella como una propiedad ubicua [Maier y col., 2001; Ramesh, 2007].

Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

La estereoselectividad es a menudo un rasgo que caracteriza a las reacciones
enzimáticas, interacciones mensajero-receptor y a ciertos procesos metabólicos y
regulatorios. Este hecho, es quizás la principal causa de que la estereoquímica deba ser
considerada como una propiedad de suma importancia en el desarrollo y estudio de
agentes xenobióticos [Maier y col., 2001].
3.2.1 Actividad biológica de los compuestos quirales
Muchas de las sustancias químicas que poseen actividad biológica son obtenidas en
forma de mezclas racémicas. Generalmente sólo uno de los dos enantiómeros
(eutómero) es capaz de generar el efecto deseado en el organismo objetivo. Por otro
lado, es común que el enantiómero restante (distómero) carezca de actividad. Aunque
también existe la posibilidad de que éste genere un efecto antagonista ó algún otro que
resulte indeseable [Ai y col., 2006].
En la actualidad, muchos de los científicos que trabajan en la industria de los cosméticos
están familiarizados con el rol de la quiralidad en la percepción de las fragancias [Brenna
y col., 2003].Son numerosos los ejemplos donde los pares enantiómericos de las
sustancias aromáticas exhiben diferentes fragancias ó intensidades de las mismas.
[Leffingwell y col., 2003]. Un ejemplo de los 285 pares de enantiómeros que exhiben
esta peculiaridad es el caso de los isómeros de la carvona. Mientras que el enantiómero
(4S)-(+)-carvona posee olor de alcaravea, el isómero (4R)-(-)-carvona se percibe como
un olor característico a menta [Figura 3.3] [Leffingwell y col., 2003].

Figura 3.3. Enantiómeros de la molécula de carvona.

Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

La industria de los agroquímicos participa activamente en la investigación que se
desarrolla con la finalidad de comprender la relación que guardan la estereoquímica y la
bioactividad. Muchos de los pesticidas y herbicidas más importantes contienen centros
estereogénicos. Dicha característica impacta severamente en la actividad ó inactividad
que esta clase de sustancias puedan presentar. Por ejemplo, el enantiómero (R)-(+)-
dicloroprop es el enantiómero que posee la actividad para eliminar la maleza, mientras
que el (S)-(-)-dicloroprop carece de actividad como herbicida [Figura 3.4] [Leffingwell y
col., 2003].

Figura 3.4. Enantiómeros del herbicida Dicloroprop.

3.2.2 Implicaciones farmacológicas
La acción de un fármaco es el resultado de los procesos farmacodinámicos y
farmacocinéticos. Es decir, el conjunto de eventos que ocurren a partir de que una
sustancia activa entra, interactúa y sale de un sistema biológico [Goodman y Gilman,
2008]. Muchos de estos eventos farmacológicamente relevantes están regulados por
reacciones e interacciones que poseen una exquisita estereoselectividad. De ahí que el
descubrimiento ó diseño y el desarrollo de nuevos fármacos, están influenciados en gran
medida por una nueva comprensión del reconocimiento molecular que ocurre al interior
de estos eventos [Ramesh, 2007].

Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

Existen diversos ejemplos donde los parámetros estereoquímicos desempeñan un papel
crucial para la acción y disposición de las sustancias activas [Maier y col., 2001]. En el
año de 1900, Cushny estableció uno de los primeros antecedentes al respecto. En su
trabajo empleó dos alcaloides que se caracterizan por ser antagonistas de los receptores
muscarínicos. Estos receptores participan en los procesos de vasodilatación, regulación
de los latidos del corazón y en la secreción de diversas sustancias [Goodman y Gilman,
2008]. Cushny describió la diferencia en el efecto midriático que se percibe cuando de
manera independiente es administrada la (-)-Hiosciamina (Hyoscyamus niger) y su forma
racémica conocida como Atropina (Atropa belladona). Los resultados de su trabajo
demostraron que la potencia del efecto que tiene la (-)-Hiosciaminaes casi del doble que
la generada por la administración del racemato [Maier y col., 2001; Collins y col., 2006].
Otro ejemplo de éste fenómeno ocurre con el β-bloqueador Propranolol y el agente
cardiotónico Verapamilo. Los racematos de ambos fármacos desarrollan efectos
diferentes al ser administrados por vía intravenosa u oral. La razón de éste evento se
suscita durante el primer paso del metabolismo donde ocurre una reacción
estereoselectiva para el enantiómero más activo del Verapamilo y para el menos activo
del Propanolol [Ramesh, 2007].
En la tabla 3.1 se describen otros ejemplos de sustancias cuyo efecto farmacológico
depende de la estereoquímica en sus moléculas [Leffingwell y col., 2003].
Tabla 3.1. Sustancias quirales que poseen actividad farmacológica.
Sustancia Descripción del efecto

La Talidomida es un eficaz agente sedante e hipnótico.
En el caso de ésta mezcla racémica el eutómero es el
isómero (R)-. Sin embargo, durante los procesos
metabólicos ocurre una reacción de epimerización en
este isómero. El producto de la reacción tiene severos
efectos neurotóxicos y teratogénicos que también están
asociados al enantiómero (S)-. Actualmente éste fármaco
es empleado en el tratamiento de los síntomas asociados
al SIDA, enfermedad de Behchet, lupus, síndrome de
Sjogren, artritis reumatoide, enfermedad de Bowel,
degeneración macular y algunos tipos de cáncer
[Leffingwell y col., 2003].

Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

Tabla 3.1. Sustancias quirales que poseen actividad farmacológica.
Sustancia Descripción del efecto

El Albuterol es un fármaco comercializado en forma de
racemato, cuyo efecto broncodilatador reside en el
enantiómero (R)-. Por otro lado, el isómero (S)- no es
inerte ya que tiene un efecto antagónico sobre el
eutómero. Hace algunos años la FDA aprobó la
comercialización del fármaco enantiopuro Levalbuterol (l-
albuterol). Sin embrago, estudios clínicos demuestran
que a pesar de tratarse de un producto más seguro, es
mucho más costoso y presenta la misma actividad
farmacológica que una dosis equivalente de su forma
racémica [Asmus y Hendeles, 2000; Nowak, 2003].

El Omeprazol es un potente inhibidorde la secreción de
ácido gástrico. Por su efecto prolongado, la forma
racémica de éste fármaco ofrece beneficios superiores
respecto a los tratamientos previos aplicados a pacientes
que padecen de reflujo gastroesofágico y de úlceras
pépticas. El diseño y comercialización del Esomeprazol
((S)-(-)-omeprazol) ocurrió como consecuencia de que el
Omeprazol exhibe un metabolismo polimórfico en el 3%
de la población caucásica y en el 15 a 20% de la
población oriental [Leffingwell y col., 2003].

La clase más numerosa de antiinflamatorios no
esteroideos que se encuentran en uso, corresponde a los
derivados del ácido-2-arilpropiónico. Estos fármacos son
empleados en el tratamiento de padecimientos como la
artritis reumatoide, la hiperuricemia y en ocasiones como
agentes analgésicos y antipiréticos. Las reacciones
adversas asociadas al enantiómero (R)- afectan diversos
órganos y tejidos. Entre ellos, el hígado, los riñones, el
tracto gastrointestinal, el sistema respiratorio y la médula
ósea. Actualmente, en el mercado sólo se encuentran
disponibles medicamentos que poseen una elevada
pureza enantiomérica (enantiómero (S)-) [Goodman y
Gilman, 2008].

3.3 La industria de la quiralidad
El auge en la demanda de productos químicos de la más diversa índole ha propiciado el
crecimiento de la industria química. En este contexto, dicha industria desempeña un
papel clave en el soporte de la economía mundial y en el desarrollo de las tecnologías
del futuro [Maier y col, 2001].
Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

A menudo, la presencia de quiralidad en una molécula es una característica que redunda
en la posesión o carencia de la actividad que se busca. En este sentido, resulta natural
que la preocupación en lo que respecta a la pureza enantiomérica se haya
incrementado. El sector de la industria química fina está encargado, entre otras cosas,
de la producción de sustancias y tecnologías con un enfoque quiral. Para ello despliega
una importante cantidad de recursos económicos por medio de otras industrias que
poseen una elevada especialización. Ejemplos representativos de éste hecho son la
industria farmacéutica, alimentaria, cosmética, agroquímica, por mencionar sólo algunas.
Todas ellas comparten algunas características únicas en comparación con otros
sectores dedicados a la obtención de productos químicos básicos y especiales [Pearson,
1991].
3.3.1 Importancia económica
Los fármacos, agroquímicos, aditivos alimentarios y fragancias representan un grupo de
compuestos con elevado valor económico y creciente potencial científico. Ambas
características constituyen las principales fuerzas motrices en el desarrollo de sustancias
y tecnologías quirales. En este sentido, la industria farmacéutica posee los ejemplos más
representativos de la importancia económica que ostentan los compuestos enantiopuros
[Maier y col., 2001].
La investigación de nuevos fármacos está orientada hacia la búsqueda de tratamientos
más efectivos que permitan paliar las enfermedades crónico-degenerativas. Del total de
los medicamentos que son prescritos actualmente cerca del 56% poseen características
quirales y el 88% de éstos últimos son distribuidos bajo su forma racémica [Ai y col.,
2006].Por otra parte, un número importante de los fármacos que pertenecen a la lista de
los quinientos más vendidos, son comercializados como enantiómeros aislados [Figura
3.5].

Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

Figura 3.5. Proporción de los enantiómeros aislados dentro
de los 500 fármacos más vendidos [Maier y col., 2001].

3.3.2 Obtención de compuestos enantiopuros
La demanda de compuestos con elevada pureza enantiomérica se ha incrementado.
Algunos de los factores que impulsan ésta tendencia están relacionados con la
sensibilización y preocupación que genera la exposición del hombre y su entorno a un
creciente número de productos químicos [Pearson, 1991].
Hay tres estrategias principales para la obtención de compuestos enantioméricamente
puros. La primera, es empleando como productos de partida compuestos quirales
enantiopuros obtenidos de la naturaleza. La segunda aproximación es mediante la
resolución cinética de racematos. Por último, la síntesis asimétrica que permite la
preparación de compuestos enantioméricamente puros a partir de sustratos proquirales
empleando un catalizador homoquiral. Las dos primeras estrategias sufren de
importantes limitaciones. Por ejemplo, en la primera existe una elevada dificultad para
encontrar un producto natural que sea enantiopuro y que pueda ser transformado
eficazmente en el producto deseado mediante pocas etapas sintéticas. En la resolución
cinética, la limitante consiste en la obtención de un rendimiento máximo del 50% [Martín,
2006].

Capítulo 3. Relevancia de los compuestos enantiopuros

Por el contario, la síntesis asimétrica presenta grandes ventajas frente a las otras dos
aproximaciones, ya que una molécula enantioméricamente pura (catalizador) es capaz
de transformar una gran cantidad de moléculas proquirales en productos quirales con
una elevada pureza enantiomérica [Martín, 2006]. En la mayoría de los casos la elección
del método y la técnica depende de los requerimientos y la capacidad operacional con
que se cuenta [Figura 3.5]. En este contexto, la Biotransformación ó Biocatálisis resulta
una excelente opción por los beneficios que ofrece. A diferencia de la síntesis química,
las reacciones catalizadas por las enzimas son a menudo regio- y enantio-selectivas y
se llevan a cabo a temperatura ambiente y presión atmosférica. Estas características
hacen innecesario el uso de condiciones más extremas que podrían causar problemas
de isomerización, racemización, epimerización y reordenamiento molecular. Además, las
enzimas obtenidas a partir de microorganismos pueden sobre expresarse e inmovilizarse
para su uso durante varios ciclos de producción. Todos estos beneficios redundan en la
disminución de los costos de producción [Ramesh, 2007].

Figura 3.5. Técnicas para la separación de enantiómeros [Maier y col., 2001].
Capítulo 4. Hipótesis y Objetivos

Capítulo 4.Hipótesis y Objetivos

Hipótesis
 Si la lipasa A de Bacillus subtilis (BslA) cataliza reacciones de hidrólisis con un
exceso enantiomérico> 95%, es plausible que un homólogo estructural, comoes la
lipasa A de Bacillus pumilusGMA1 (BplA) o sus mutantes, también presenten una
elevada enantioselectividad.
Objetivo general
 Analizar la enantio-selectividad que las enzimas recombinantes BplAr-6H y BplAr-
6H-G28S presentan en reacciones de hidrólisis frente a sustratos modelo.
Objetivos particulares
 Producir y purificar las enzimas recombinantes BplAr-6H y BplAr-6H-G28S.
 Caracterizar los parámetros cinéticos kcat y Km de las enzimas recombinantes
purificadas.
 Evaluar la estabilidad térmica mediante la obtención de la constante de
inactivación térmica (ki).
 Efectuar y caracterizar la cinética de la reacción de hidrólisis del rac-1-feniletil
acetato.
 Efectuar y caracterizar la cinética de la reacción de hidrólisis de una mezcla
racémica de naproxenato de metilo.
Capítulo 5. Materiales y Métodos

Capítulo 5.Materiales y Métodos

5.1 Esquema general de trabajo

Reactivación de las
células de E. coli
Expresión de las proteínas recombinantes
BplAr-6H y BplAr-6H-G28S
Purificación de las proteínas recombinantes
mediante cromatografía de afinidad
Determinación de las constantes de
inactivación (ki) de las enzimas recombinantes
Caracterización cinética (kcat y Km) de las
lipasas BplAr-6H y BplAr-6H-G28S
Reacciones de hidrólisis
del (R,S)-1-feniletil
Análisis cromatográfico de
las reacciones de hidrólisis
del(R,S)-1-feniletilacetato
Reacciones de hidrólisis del
rac-naproxenato de metilo
Análisis cromatográfico de las
reacciones de hidrólisis
delrac-naproxenato de metilo
Capítulo 5. Materiales y Métodos

5.2 Materiales
5.2.1Reactivos químicos
Reactivo Marca
Acetato de etilo Sigma-Aldrich
Ácido acético glacial Sigma
Ácido bicinconínico (BCA) Sigma-Aldrich
Ácido clorhídrico Sigma
Ácido etilendiamino tetracético (EDTA) Sigma
Agar LB (Luria Bertani) Difco
Ampicilina Sigma-Aldrich
Azul brillante Sigma
Cloruro de Sodio (NaCl) Sigma
Dodecilsulfato de Sodio (SDS) Sigma
Etanol Sigma
Fosfato de Potasio monobásico (KH2PO4) Sigma
Glicerol Gibco BRL
Hexano Sigma-Aldrich
Hidróxido de Sodio (NaOH) Sigma
Imidazol Fluka
Isopropil-1-tio--D-galactopiranósido (IPTG) Sigma
Medio LB (Luria-Bertani) Sigma
Metanol Química Delta
Membrana para diálisis Sigma
Naproxén ™ Fluka
n-tetradecano Sigma
Poli-etilenglicol Fluka
Placas para c.c.f. con indicador fluorescente UV254 Macherey-Nagel
Placas quirales para c.c.f. Sigma-Aldrich
Resina para cromatografía de afinidad Protino™ Ni-TED
Sulfato de Cobre (CuSO4) Sigma-Aldrich
Sulfato de Níquel (NiSO4) Sigma-Aldrich
Tris Sigma
Tritón X-100 Sigma
Capítulo 5. Materiales y Métodos

Reactivo Marca
Yodo Sigma-Aldrich
2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich
4-nitrofenil acetato (4-NFA) Sigma-Aldrich
4-nitrofenol (4-NF) Fluka
(R,S)-naproxén Fluka
(R)-1-feniletanol Fluka
(R,S)-1-feniletanol Fluka
(R,S)-1-feniletil acetato SAFC
(S)-naproxén Fluka
rac-naproxenato de metilo Fluka

5.2.2Instrumentos y equipos
Instrumento ó equipo Marca
Balanza analítica Sartorius
Centrífuga superveloz refrigerada RC-5B Sorvall
Centrífuga universal 30RF Hettich
Columna capilar (30m x 0.25 mm x 0.12 µm) Astec CHIRALDEX™ B-DM
Cromatógrafo de gases 8610C,
equipado con FID
SRI Instruments
Espectrofotómetro CARY 400 Varian
Microcentrífuga refrigerada 5417R Eppendorf
Micro pipetas (5, 20, 100, 200, 1000 µl) Eppendorf / Gilson
Potenciómetro 713 Metrohm Brinkmann
Sonicador CV26 Cole Parmer
Trans-iluminador UV
Termomixer confort No.5355 36122 Eppendorf
Vortex

Capítulo 5. Materiales y Métodos

5.2.3Cepa utilizada
Cepa Genotipo Fuente y referencia
E. coli BL21 (DE3)
F-ompT hsdSB(rb
-mb-) gal dcm
(λcIts857 ind Sam7 nin5 lacUV5-T7
gene1)
Novagen
[Studier y Moffatt, 1986]

5.2.4 Enzimas utilizadas.
Enzima Fuente / referencia
BplAr-6H Lipasa recombinante / [Mora, 2008]
BplAr-6H-G28S Lipasa recombinante / [Mora, 2008]
CalB Novozim™

5.3 Métodos
5.3.1Reactivación de las cepas de E. coli
Para la reactivación de las células transformantes de E. coli BL21 (DE3) que permitió la
posterior obtención de las lipasas BplAr-6H y BplAr-6H-G28S se empleó el siguiente
protocolo:
Protocolo
1.

Se extraen del congelador que se encuentra a -70°C los tubos que contienen cada una de las cepas
requeridas y se colocan en baño de hielo para favorecer que la descongelación sea lenta.
2.

Se procede a inocular10 ml de medio LBamp con 100 µl de cada una de las cepas, posteriormente se
incuban a 37°C y con agitación orbital a 220 r.p.m. durante 12 horas.
3.

Sembrar dos placas con agar LBamp empleando el medio con crecimiento celular obtenido
previamente (cada placa con 50 µl de cada una de las cepas) e incubar a 37°C durante 24 horas.
4.

Revisar las placas, elegir en cada caso una colonia que se encuentre aislada y transferirla a 10 ml de
medio LBamp. Incubar a 37 °C y con agitación orbital a 220 r.p.m. durante 12 horas.
5.

Preparar nuevos inóculos a partir del medio con crecimiento recién obtenido. Las células se deben
mantener en glicerol (50% v/v) a -70°C.

Capítulo 5. Materiales y Métodos

5.3.2 Expresión de las proteínas recombinantes BplAr-6H y BplAr-6H-G28S
Las condiciones requeridas para favorecer la expresión de las proteínas recombinantes
fueron descritas por Mora, [2008]. Sin embargo, el protocolo empleado en este trabajo
contiene pequeñas modificaciones que fueron necesarias para compensar las
diferencias existentes entre ambos esquemas de trabajo.
Protocolo
1.

Preparar un preinóculo (10 ml de medio LBamp) a partir de 100 µl de las células que se
encuentran en glicerol (50% v/v) a -70°C. Incubar a 37°C y con agitación a 220 r.p.m. durante
toda la noche.
2.

Inocular un matraz con capacidad de 1 litro que contenga 400 ml de medio LBamp, para ello
se adicionan los 10 ml de preinóculo obtenidos previamente. Se incuba durante 4 horas a
37°C y con agitación orbital a 220 r.p.m.
3.

Para escalar la generación de biomasa se inocula un matraz con capacidad de 2 litros que
contenga 1 litro de medio LBamp con los 410 ml de medio de cultivo obtenidos previamente y
se incuba a 37°C y con agitación orbital a 220 r.p.m.
4.

Al inicio de la fase exponencial (DO600de 0.6 a 0.8) se añaden 1410 µl de una solución de
IPTG 0.5 M, la concentración final de agente inductor debe ser de 0.5 mM. Se mantienen las
condiciones de incubación durante 3 horas más.
5. Obtener la biomasa por centrifugación a 5000 r.p.m. por 20 minutos a 10°C.
6.

Resuspender la biomasa obtenida a partir de 300 ml de medio de cultivo en 20 ml de solución
amortiguadora para lisis/lavados (fosfato de potasio 35 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, pH
6.3).
7.

Tomar una alícuota de 20 µl y correr geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes
(PAGE-SDS).
8.

Dividir las células que fueron resuspendidas en fracciones de 10 ml y mantenerlas a -70°C
para su posterior purificación.

5.3.3 Purificación de las proteínas recombinantes
Las lipasas recombinantes BplAr-6H y BplAr-6H-G28S están provistas de una etiqueta
constituida por seis residuos de Histidina, ésta característica permite su purificación
mediante cromatografía de afinidad. Las columnas empleadas para dicho propósito
fueron empacadas con una resina que en su matriz posee iones de Níquel, éste metal
presenta afinidad por los residuos de Histidina presentes en las proteínas.

Capítulo 5. Materiales y Métodos

El protocolo que se muestra a continuación se desarrolló por analogía con el sistema de
Mora [2008] y a partir de la información provista por el fabricante de la resina.
Protocolo
1.

Para evitar el riesgo de contaminación entre lipasas es conveniente empacar dos columnas y
desarrollar el proceso de manera independiente. Cada columna con que se cuenta tiene la
capacidad para contener 20 ml de agua, sin embargo bastan 6 g de la resina Protino™ Ni-
TED para ocupar dicho volumen.
2.

Equilibrar cada columna con 30 ml de la solución amortiguadora para “lisis/lavado” (fosfato de
potasio 35 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, pH 6.3).
3.

Descongelar las fracciones de 10 ml que contienen la biomasa. Es conveniente que siempre
se mantengan en hielo para que el cambio de temperatura sea paulatino.
4.

Colocar una fracción que contiene la biomasa en un vaso de precipitados de 50 ml y adicionar
14 ml de solución amortiguadora de “lisis/lavado”. Es necesario mantener el vaso en baño de
hielo.
5.

Someter cada fracción de biomasa a 2 ciclos de 5 pulsos en el sonicador, cada pulso con
duración de 15 segundos y una potencia de 40-50 W. Entre cada ciclo es necesario esperar 5
minutos y mantener el extracto a 5°C.
6.

Centrifugar el extracto obtenido a 15000 r.p.m. durante 20 minutos y conservar el
sobrenadante (fracción soluble) a 10°C.
7.

Una vez obtenido el sobrenadante, es posible introducir a la columna de afinidad un volumen
de 10 a 14 ml de la fracción soluble. Es recomendable que todas las soluciones
amortiguadoras (Anexo 1) se mantengan a 5°C durante el proceso de purificación.
8.

Comenzar a colectar el “volumen muerto” de la columna en cuanto comienza la adición del
extracto a la columna.