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• Sonia Uribe Luna • Patricia Heredia Chávez • Sergio Sánchez Enríquez • Pedro Garzón de la Mora pH y amortiguadores 3 Práctica Introducción Agua La molécula de agua tiene una capacidad limitada para disociarse en un ion hidrógeno (H+), al que también se le llama protón, y un ion hidroxilo (OH−). H2O (l) H+ + OH− Agua Protón Ion hidroxilo En solución acuosa, un protón se combina de inme- diato con una molécula de agua para formar el ion hidro- nio o hidrogenión (H3O+). H+ + H2O (l) H3O+ Protón Agua Hidronio Sin embargo, por convención, en las reacciones de ionización del agua se utiliza la representación del protón en lugar del ion hidronio. Las concentraciones de protones y iones hidroxilo, en agua pura, son de 10−7 M para cada uno, como muestra la siguiente expresión: [H+] = [OH−] = 10−7 M Las concentraciones de ambos iones exponen una re- lación recíproca: cuando H+ aumenta, OH− disminuye, y viceversa. El producto de sus concentraciones es una constante conocida como producto iónico del agua (Kw), que tiene un valor de 1 × 10−14 M. Kw = [H+] × [OH−] = 1 × 10−14 M Con el fi n de facilitar los cálculos para determinar H+, además de su interpretación, en 1909 el químico da- nés Sørensen defi nió el potencial hidrógeno (pH) como el logaritmo negativo de la concentración de iones hi- drógeno. pH = –log10 [H+] Más adelante, en 1923 Johannes Brønsted y Thomas Lowry propusieron, en forma independiente, los concep- tos de ácido, como la capacidad de las sustancias para ceder protones en una solución acuosa, y de base, como la de aceptar protones. En la práctica, las disoluciones acuosas se clasifi can en ácidas, si presentan un pH menor a 7.0; básicas, si el pH es mayor a 7.0, y neutras, si el pH es igual a 7.0. Por otra parte, no todos los ácidos se disocian con la misma facilidad. A los que lo hacen por completo en una solución acuosa, se les considera ácidos fuertes; los que se disocian en parte, son ácidos débiles. Algunos ácidos o bases débiles tienen importancia biológica porque evitan cambios bruscos de pH cuando se les agrega pequeñas cantidades de ácidos o bases. A esta propiedad se le de- nomina capacidad amortiguadora. El fi n de los amorti- guadores es mantener el pH estable en un intervalo muy estrecho (p. ej., en la sangre va de 7.35 a 7.45). El pK es el pH necesario para que un ácido esté 50% no disociado y 50% disociado (es decir, la razón o propor- ción de ácido disociado y no disociado es 1). Cuando la solución presenta un pH cercano a su pK (± 1.0) posee su mayor capacidad amortiguadora. Los ácidos o las bases producidas por el catabolis- mo de carbohidratos, lípidos y aminoácidos dan lugar a una gran cantidad de compuestos con potencial para modifi car el pH fi siológico. Sin embargo, existen sistemas amortiguadores que evitan cambios bruscos del pH. Un ejemplo es el sistema bicarbonato�ácido carbónico, que mantiene el pH de los líquidos intercelulares en valores cercanos a 7.4. En éste, la combustión completa de carbo- hidratos y lípidos genera bióxido de carbono y agua, que 04_Chapter 03_Sánchez_3R.indd 21 05/04/14 19:49 22 Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica se combinan para producir ácido carbónico en el nivel tisular. El ácido carbónico en solución acuosa se disocia para formar su base conjugada (el bicarbonato), lo que genera un sistema amortiguador (fi gura 3-1). Si aumenta la concentración de protones en el me- dio, debido a cualquier proceso químico, el equilibrio se desplaza a la izquierda y el exceso de CO2 producido se elimina a través de los pulmones. Por el contrario, si disminuye la concentración de protones, el equilibrio se desplaza a la derecha. Las proteínas (en forma específi ca, las enzimas) son sensibles a los cambios bruscos de pH. Por tanto, el pH sanguíneo debe conservarse en un intervalo de 7.35 a 7.45, con el fi n de mantener la homeostasis. Además de los sistemas amortiguadores de pH, el sistema nervioso (centro respiratorio), el aparato respi- ratorio y los riñones contribuyen a mantener en nuestros órganos y tejidos el pH en los rangos apropiados. Objetivo general • Analizar las propiedades de soluciones ácidas y bá- sicas. Objetivos específi cos • Medir el pH de diferentes sustancias. • Evaluar la capacidad amortiguadora de líquidos bio- lógicos. • Determinar los valores de pK de un ácido poliprótico. Materiales y equipo • Materiales y equipo • Bureta • Matraz Erlenmeyer de 250 ml • Probeta de 100 ml • Pipetas de 1, 5 y 10 ml • Vasos de precipitado de 100 y 250 ml • Tubos de ensayo 13 × 100 • Soporte universal • Pinzas en mariposa para bureta • Gradilla • Potenciómetro • Tiras reactivas para pH • Agitador magnético • Pipetores Soluciones y reactivos Soluciones Muestras* H3PO4 a 0.1 M NaOH a 0.1 M NaOH a 0.01 N HCl a 0.01 N (3.8%) NaHCO3 con pH 7.4 Reactivo de Yamada Solución amortiguadora de referencia a pH 4.0 Solución amortiguadora de referencia a pH 7.0 Saliva Orina Sudor Leche Refresco oscuro Refresco claro Jugo de naranja Yogurt Agua * El alumno debe proporcionar las muestras. Desarrollo experimental Experimento 1 Medición del pH con tiras reactivas Una forma rápida de medir el pH consiste en utilizar tiras reactivas diseñadas para ese fi n. Fundamento Las tiras reactivas contienen diferentes compuestos, a los que se les denomina indicadores de pH, que cambian de color de acuerdo con el pH en que se encuentran. A estas mediciones se les considera semicuantitativas, porque no indican el valor exacto del pH. La coloración que presen- ta la tira se compara con la gama de colores de referencia incluida en el recipiente de las tiras. Procedimiento 1. Sumergir la tira reactiva en el líquido problema y mantenerla por 10 segundos. 2. Retirar la tira y quitar el exceso de líquido. 3. Comparar los cambios de color obtenidos con la gama de colores existentes en el contenedor de las tiras. 4. Registrar los valores de pH obtenidos de las solucio- nes incluidas en el cuadro 3-1. CO2 + H2O H2CO3 HCO3− + H+ Bióxido Agua AC Ácido Bicarbonato Protón de carbono carbónico AC = anhidrasa carbónica pKa = 6.1 Figura 3-1. Reacción de disociación del ácido carbónico. A la izquierda del ácido carbónico se muestra la disociación media- da por la anhidrasa carbónica y a la derecha la disociación espontánea (sin enzima). 04_Chapter 03_Sánchez_3R.indd 22 05/04/14 19:49 Práctica 3. pH y amortiguadores 23 Procedimiento a) Preparar una serie de tubos numerados de acuer- do con el cuadro 3-3. Realizar las diluciones del hi- dróxido de aluminio y magnesio (Melox) y el subsa- licilato de bismuto (Peptobismol). El volumen total debe ser 2.5 ml; de ellos, 0.5 ml corresponden a Melox o Peptobismol, mezclados con 2 ml de agua destilada. b) Agregar la base (NaOH) a la dilución de los tubos nones y el ácido (HCl) a la de los tubos pares. c) Mezclar bien. d) Medir el pH de cada solución, empleando tiras reac- tivas. Experimento 4 Curva de titulación del ácido fosfórico (H3PO4) Fundamento El ácido fosfórico, H3PO4, es un ácido poliprótico (tiene tres protones, que pueden disociarse). Mediante titula- ción, es posible determinar los tres valores de pKa de este compuesto. Para titular un ácido débil se agregan cantidades pe- queñas de una base fuerte que permite desplazar el equi- librio hacia la formación de su base conjugada. Después de cada adición de la base, se determina el pH, mediante Experimento 2 Sistemas amortiguadores Fundamento El objetivo de este experimento es comparar diferentes líquidos que contienen amortiguadores y ver cuál es más efi caz para evitar cambios importantes de pH ante la ex- posición a un ácido o una base. Se tiene un control que no es amortiguador (agua). Desarrollo a) Preparar una serie de tubos numerados de acuerdo con el cuadro 3-2. b) Medir el pH de cada solución, empleando tiras reac- tivas. c) Registrar el pH fi nal. d) Analizarlos cambios observados. Experimento 3 Capacidad antiácida del hidróxido de aluminio y magnesio y del subsalicilato de bismuto Fundamento El propósito de este experimento es observar el compor- tamiento de dos fármacos utilizados como antiácidos, cuando se exponen a soluciones básicas y ácidas. Como control, se tiene agua destilada. Cuadro 3-1. Resultados de la medición de pH de distintas soluciones. Solución pH obtenido Saliva Orina Sudor Leche Refresco oscuro Refresco claro Jugo Yogurt Solución de jabón Solución de sosa cáustica Agua Cuadro 3-2. Resultados obtenidos para el pH de diferentes soluciones, antes y después de la exposición a un ácido y a una base. Tubos Muestra (2.5 ml) pH inicial NaOH 0.01N HCl 0.01N pH fi nal 1 Orina 0.5 ml — 2 Orina — 0.5 ml 3 Suero 0.5 ml — 4 Suero — 0.5 ml 5 NaHCO3 a 0.1 N y pH 7.0 0.5 ml — 6 NaHCO3 a 0.1 N y pH 7.0 — 0.5 ml 7 Agua destilada 0.5 ml — 8 Agua destilada — 0.5 ml 04_Chapter 03_Sánchez_3R.indd 23 05/04/14 19:49 24 Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica potenciometría, y su valor se registra en una gráfi ca para determinar el comportamiento del ácido débil. De la mis- ma forma, se puede titular una base débil empleando un ácido fuerte. En el proceso de titulación se modifi ca el pH (en este caso, de valores ácidos a otros cada vez más básicos). Esto se puede determinar a partir de cambios de color, si se agrega a la reacción una mezcla de indicadores de pH, como el reactivo de Yamada. Potenciómetro Se trata de un aparato que mide el pH y que funciona por medio de electrodos. El electrodo es un dispositivo que contiene una solución amortiguadora; al ponerse en con- tacto con la solución problema, mide la concentración de los hidrogeniones. El uso del potenciómetro depende del modelo. Sin embargo, en forma general se deben tener los siguientes cuidados: • Antes de medir el pH, debe mezclarse la solución que se desea analizar empleando el agitador magnético. Se recomienda evitar el uso de varillas de vidrio como agitadores, porque se corre el riesgo de romper los electrodos, que son frágiles. • Los electrodos deben enjuagarse con agua destilada antes y después de utilizarse, y no se deben tocar con la mano. • Antes de utilizar el potenciómetro, debe calibrarse con una solución de referencia (pH 4, pH 7 o pH 10). • Los electrodos deben mantenerse en agua destilada cuando no estén en uso, evitando que se sequen. Si esto ocurre, deben sumergirse en agua y calibrarse varias veces antes de hacer las mediciones. En la fi gura 3-2 se muestra una fotografía de un modelo de potenciómetro portátil, junto con sus adi- tamentos. Procedimiento 1. En un vaso de precipitado de 250 ml, depositar 25 ml de una solución de H3PO4 a 0.1 M. 2. Agregar 4 gotas del reactivo de Yamada (mezcla de indicadores de pH). 3. Medir el pH con un potenciómetro. El potencióme- tro debe calibrarse de antemano con amortiguadores de referencia, a pH 4.0 y pH 7.0. 4. Preparar una bureta con 50 ml de una solución de NaOH a 0.1 M. 5. Agregar al H3PO4 alícuotas de 3.0 ml de NaOH a 0.1 M. Mezclar con el agitador magnético y medir el pH después de cada adición, hasta completar 75 ml de la base NaOH. 6. Grafi car en papel milimétrico el volumen de NaOH gastado contra el pH. 7. Determinar los valores de pKa1, pKa2 y pKa3 para el H3PO4. Actividades de aprendizaje 1. Investigar la composición promedio de las siguientes soluciones y cuál de esos compuestos contribuye más al pH de la solución. Figura 3-2. Potenciómetro portátil con electrodo de vidrio. Cuadro 3-3. Resultados obtenidos para el pH de hidróxido de aluminio y magnesio (Melox), subsalicilato de bismuto (Peptobismol) y agua, antes y después de exponerlos a una base y a un ácido. Tubos Muestra (2.5 ml) pH inicial NaOH a 0.01 N HCl a 0.01 N pH fi nal 1 Hidróxido de aluminio y magnesio (1:5) 0.5 ml — 2 Hidróxido de aluminio y magnesio (1:5) — 0.5 ml 3 Subsalici- lato de bismuto (1:5) 0.5 ml — 4 Subsalici- lato de bismuto (1:5) — 0.5 ml 5 Agua destilada 0.5 ml — 6 Agua destilada — 0.5 ml 04_Chapter 03_Sánchez_3R.indd 24 05/04/14 19:49 Práctica 3. pH y amortiguadores 25 04_Chapter 03_Sánchez_3R.indd 25 05/04/14 19:49 26 Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica 9. Investigar la utilidad práctica de los siguientes com- puestos y marcarlos en el siguiente cuadro: Antiácido Amortiguador Efecto sistémico Bicarbonato de sodio Hidróxido de mag- nesio Hidróxido de aluminio Subsalici- lato de bismuto 10. Explicar la diferencia entre un sistema amortiguador y el de una sustancia con propiedad antiácida. Discusión Conclusiones Solución Compuesto Saliva Orina Sudor Leche Refresco oscuro Refresco claro Jugo Yogurt Solución de jabón Agua 2. ¿Qué pH tiene la mayor parte de las sustancias estu- diadas en este experimento? 3. De acuerdo con los resultados obtenidos en el experi- mento 2, investigar qué sistema o sistemas de amorti- guadores se encuentran en cada una de las soluciones utilizadas. Muestra Descripción del sistema amortiguador Orina Suero NaHCO3 a 0.1 N y pH 7.0 Agua destilada 4. ¿Cuál de estos amortiguadores es el mejor? 5. ¿Cuál de los antiácidos utilizados en el experimento 3 es mejor? 6. ¿Cuál de los pKa del ácido fosfórico es mejor amor- tiguador a pH fi siológico? 7. Investigar cuáles enfermedades tienen relación con el pH 8. Completar la información del siguiente cuadro: Indicadores del reactivo de Yamada ColorIntervalos de pH Azul de timol Rojo de metilo Azul de bromotimol Fenolftaleína 04_Chapter 03_Sánchez_3R.indd 26 05/04/14 19:49 Práctica 3. pH y amortiguadores 27 Bibliografía Garzón de la Mora P. Manual de prácticas de bioquímica. Pro- yecto IV de pH y Buffers, 2002:85-93. McKee T. Bioquímica, 3a ed. Cap 3. El agua: el medio de la vida. McGraw-Hill, 2003:65-91. Roskoski R Jr. Bioquímica. Cap 3. Aminoácidos y proteínas. McGraw-Hill, 1998:65-91. http:��www.uclm.es. Equilibrio ácido-base. [Revisado el 16 de septiembre de 2013.] Preparación de reactivos H3PO4 0.1 M NaOH 0.1 M HCl 0.01 N NaOH 0.01 N Solución NaHCO3 a 0.1N: ajustar el pH a 7.0 Reactivo de Yamada: Azul de timol 5.0 mg Rojo de metilo 12.5 mg Azul de bromotimol 50.0 mg Fenolftaleína 100.0 mg Disolver en 200 ml de alcohol etílico a 50% 04_Chapter 03_Sánchez_3R.indd 27 05/04/14 19:49
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