Sequenciamento do genoma de uma cepa de Bdellovibrio bacteriovorus

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Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 9(21): 39 - 46 2018 
Memoria en extenso. XVII Congreso Internacional XXIII Congreso Nacional de Ciencias Ambientales 
 
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Secuenciación del genoma de una cepa de Bdellovibrio bacteriovorus aislada de agua 
residual en Tamaulipas. 
 
Secuencing the genome of a strain of Bdellovibrio bacteriovorus isolated from sewage 
in Tamaulipas. 
 
1Temidayo Oluyomy Elufisan, 2Alejandro Sánchez Varela, 3Isabel Cristina Rodríguez Luna, 
4Omotayo Opemipo Oyedara, 5Leonardo Iván Aranda Vivas y 6Xianwu Guo. 
Laboratorio de Biotecnología Genómica, Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico 
Nacional, Boulevard del Maestro, con Elías Piña, Col. Narciso Mendoza, s/n, CP. 88710, Tel: 
924327, Ext: 87760, asanchezv@ipn.mx, Reynosa Tamaulipas, México. 
 
RESUMEN. Bdellovibrio spp pertenece a un grupo de bacterias depredadoras que tienen 
diversas formas de ataque y dependen de una presa para su supervivencia, crecimiento y 
reproducción, las cuales han demostrado que tienen una capacidad diferente para la 
depredación de diversas bacterias patógenas Gram negativas y también han demostrado 
ciertos potenciales para inhibir el crecimiento de algunas bacterias Gram-positivas y 
biopelículas bacterianas adherentes. La importancia de las especies de Bdellovibrio en el 
control de la resistencia de las bacterias patógenas ha estimulado un mayor interés en su 
estudio. En este estudio aislamos una cepa de Bdellovibrio (B. bacteriovorus) de un canal 
de aguas residuales en Reynosa utilizando la técnica de enriquecimiento de cultivos. 
Extrajimos el ADN genómico y llevamos a cabo la secuenciación genómica completa de su 
genoma con el objetivo de comprender la ecología función de esta cepa y su nivel de 
diversidad. El aislado se identificó molecularmente al amplificar 16s rRNA de su genoma 
en una reacción en cadena de la polimerasa y análisis de amplicón por electroforesis. La 
secuencia completa del genoma de la cepa bacteriolítica de Bdellovibrio aislada kdesi 
mostró que el genoma tiene aproximadamente 3.5mb de tamaño y tiene un contenido de 
guanina-citosina (GC) del 48.55%. El genoma tiene 3363 secuencias de codificación. Los 
análisis de secuenciación del genoma completo revelaron que el aislado posee 
características específicas que son exclusivas de las bacterias depredadoras. La información 
de toda la secuenciación del genoma de esta cepa puede proporcionar más información 
sobre sus potenciales depredadores. 
 
 
Palabras claves: Bdellovibrio, Bacteria, Depredadoras, Secuenciación, Genoma. 
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INTRODUCCIÓN 
 
La tasa de resistencia microbiana a los agentes antimicrobianos ha seguido aumentando 
mientras que el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos ha ido disminuyendo. El 
aumento de la incidencia de bacterias multirresistentes ha resultado en una alta tasa de 
mortalidad debido a la ineficacia de los agentes antimicrobianos para el tratamiento de 
casos causados por tales bacterias. Se proyecta que para 2050, si no se controla, la 
resistencia microbiana al fármaco representará más muertes que el cáncer a nivel mundial 
(O'Neill, 2014). El aumento de las bacterias resistentes a múltiples fármacos (MDR) ha 
hecho que los científicos piensen en algún medio alternativo para reducir las especies 
bacterianas multirresistentes con el objetivo de reducir el efecto exacerbador de la MDR en 
el sistema sanitario. Entre estas alternativas se encuentra el uso de bacteriófagos y bacterias 
depredadoras para el control de MDR y recientemente el uso de bacterias que pueden 
aprovecharse de otras bacterias ha recibido más reconocimiento. El aumento en el interés 
de usar bacterias depredadoras para el control de la MDR se debe a su modo de vida no 
patogénico y al potencial de explotar bacterias patógenas Gram negativas que son 
principalmente MDR. Las bacterias predatorias que se han estudiado incluyen Bdellovibrio, 
Micavibrio, Chlorflexi, Myxococcus xanthus, Micavibrio admirantus, Cytophaga spp 
(Velicer y Mendes-Soares, 2009). La facilidad de recuperación de especies de Bdellovibrio 
a partir de muestras ambientales los ha convertido en el grupo de bacterias depredadoras 
más estudiado, varios estudios han informado del aislamiento de Bdellovibrio spp y su uso 
para el control de bacterias patógenas (Dashiff & Kadouri, 2009; Davidov & Jurkevitch, 
2004; Kadouri y O'Toole, 2005; Negus et al., 2017; Oyedara et al., 2016; Stolp y Starr, 
1963; Velicer & Mendes-Soares, 2009). Bdellovibrio es un género de delta-proteobacteria 
depredadora intracelular Gram positiva obligada (Oyedara et al., 2016). 
La evidencia de varios estudios reveló la existencia de una alta forma de variación entre el 
Bdellovibrio particularmente con respecto a su modo de ataque y rango de presa. 
Bdellovibrio se puede agrupar en dos grupos principales según el mecanismo que utilizan 
para atacar a su huésped: B. exovorus que crece externamente en la célula de la presa y B. 
bacteriovorus que vive o crece en el periplasma de la célula presa durante su ataque, 
(Medrano-Soto et al., 2017). La diversidad del género Bdellovibrio ha llevado a varios 
estudios con el objetivo de comprender la peculiaridad del género utilizando diferentes 
métodos genómicos, como la transcriptómica y la secuenciación completa del genoma. La 
facilidad de acceso Las técnicas de secuenciación de próxima generación han hecho que sea 
fácil emplear el análisis de la secuencia del genoma completo en la comprensión de muchas 
características desconocidas de las bacterias. El análisis de la secuenciación completa del 
genoma se ha utilizado para comprender la función de las especies de Bdellovibrio (Gophna 
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et al., 2006; Rendulic et al., 2004). Aunque, algunos estudios genómicos han dado una idea 
de las funciones de Bdellovibro spp, la escasez de datos genómicos ha limitado la 
comprensión del nivel de diversidad en el género. Por lo tanto, la secuenciación genómica 
completa continua sigue siendo una tarea esencial para Bdellovibrio spp. En este estudio 
aislamos una cepa de especies de Bdellovibrio de aguas residuales de Reynosa Tamaulipas 
utilizando la técnica de enriquecimiento de cultivos según lo descrito por Jurkevitch, 
(2006). El aislado se identificó molecularmente amplificando y secuenciando el fragmento 
16S rRNA del genoma del aislado. También secuenciamos el genoma completo del aislado 
usando la técnica de secuenciación de próxima generación con el objetivo de usar la 
secuencia del genoma completo para estudios analíticos adicionales en Bdellovibrio. 
 
 
METODOLOGÍA 
 
Aislamiento de bacterias 
La muestra de aguas residuales se recogió asépticamente de un canal en Reynosa, 
Tamaulipas y se transfirió en un contenedor estéril al Laboratorio Biotecnología Genómica 
(LBG), Centro de Biotecnología Genómica (CBG), Instituto Politécnico Nacional de 
México (IPN) para su posterior análisis. La muestra fue tratada de acuerdo a Jurkevitch, 
(2006) y la bacteria se aisló utilizando la técnica de enriquecimiento en la que se agregaron 
muestras de aguas residuales a bacterias presas lavadas (Klebseilla pneumoniae) y la 
mezcla se incubó a 30 ° C hasta que se observó lisis. La cepa aislada se purificó mediante 
subcultivo utilizando la técnica de doble capa de cultivo en placa de agar descrita por 
Jurkevitch, (2006). El aislado purificado se utilizó para la extracción de ADN genómico 
para el estudio de identificación. 
 
Identificación de aislamientos 
Laidentificación microscópica de los aislados se realizó utilizando el microscopio 
compuesto Olympus. El ADN genómico de la cepa de bacterias aisladas se extrajo 
utilizando el kit de extracción de ADN genómico Promega según lo descrito por el 
fabricante. El ADN genómico extraído se amplificó en una reacción en cadena de la 
polimerasa (PCR) utilizando un conjunto de pares de cebadores diseñados en nuestro 
laboratorio steno1 (21F) (5 'AGG GAA ACT TAC GCT AAT ACC-3') y steno2 (1200R) (5 
' CTC TGT CCC TAC CAT TGT AG-3 ') y el fragmento amplificado se secuenció. El 
fragmento de secuencia fue explosivo contra la base de datos NCBI para la identificación 
de la bacteria. 
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Secuenciación del genoma completo 
El ADN genómico se envió a Omega (EE. UU.) Para la secuenciación completa del 
genoma de los aislados. El genoma completo se secuenció utilizando la tecnología de 
secuenciación Illumina Miseq Next Generation. Las lecturas obtenidas del genoma 
completamente secuenciado se recortaron para eliminar los adaptadores y se verificó la 
calidad de la lectura con Trim-galore y Fast-QC, respectivamente. Las lecturas se 
ensamblaron utilizando las Espadas 3.1.11 (Bankevich et al., 2012) y los contigs 
ensamblados se reordenaron con Medusa utilizando Bdellovibrio bacteriovorus HD100 
como referencia. El genoma fue anotado con Prokka 2.1 (Seemann, 2014). La isla 
genómica se predijo utilizando Genomic Island viewer4 (Bertelli et al., 2017). 
 
 
RESULTADOS 
 
La capacidad del aislado para lisar las células huésped después de 24 horas de cultivo se 
utilizó como criterio para su selección. La naturaleza de consistencia de este 
comportamiento en los métodos de aislamiento de doble capa de cultivo de placas confirmó 
que es una bacteria depredadora. La microscopía reveló aislado como una pequeña bacteria 
de rápido movimiento. El aislado fue capaz de iniciar la lisis de su célula huésped después 
de 24 h de incubación tanto en placa como en cultivo líquido. Mantiene esta característica 
para el período de incubación de 7 días. Aislamos una cepa del depredador Bdellovibrio 
Kdesi según lo revelado por el resultado del análisis de búsqueda de onda expansiva del 
fragmento 16S rRNA secuenciado del genoma. La identificación molecular del aislado 
mostró que el aislado compartía un 99% de similitud con Bdellovibrio bacteriovorus 
SSB218315. La secuencia del genoma completo se realizó usando la técnica de 
secuenciación Illumina Miseq. Los datos de secuencia consisten en 16, 664, 856 pb de 
secuencia de ADN con un par de bases promedio de 101 lecturas de longitud. Un total de 
366 contigs se ensamblaron de novo utilizando el ensamblador de nodos 3.1.11 de novo 
Figura 1. Los contigs N50 fueron 20170.0 y los contigs más grandes fueron 76, entonces 
699bp. El genoma fue ordenado y orientado en cuatro contigs utilizando el software de la 
medusa Andamio en línea basado (Bosi et al., 2015). La longitud promedio del andamio 
más largo es de 3473632 pb. El borrador del genoma consiste en un cromosoma circular de 
3471216 pb y un contenido de GC de 48.85%. El genoma se anotó utilizando Prokka 
versión 2.1.1 (Seemann, 2014). El genoma contiene 33 ARNt, que codifica para todos los 
aminoácidos y 3393 gen de codificación predicho, en consonancia con otros Bdellovibrio 
spp (Tajabadi et al., 2017). Encontramos que algunos de los genes que se han reportado son 
esenciales para las actividades predatorias de Bdellovibrio en el genoma de Bdellovibrio 
bacteriovorus kdesi, (Tabla 1). En el genoma están presentes dos copias de la proteína de 
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biogénesis y competencia de Pilus tipo IV que se sabe que son esenciales para la 
depredación. Otros presentes incluyen copias de serina proteasa que están ampliamente 
distribuidas en el genoma, dos copias del gen que codifica el factor de von Willebrand y 
una copia del gen que codifica la proteína implicada en el mevalonato. La información de la 
secuencia de Bdellovibrio bacteriovorus kdesi contribuirá a la comprensión de la diversidad 
del miembro del género Bdellovibrio. 
 
 
Figura 1. Anotación completa del genoma en el RAST de Bdellovibrio kdesi 
 
 
Tabla 1. Características del genoma de Bdellovibrio kdesi, mostrando sus secuencias 
codificantes. 
Características del Genoma de Bdellovibrio kdesi 
contigs: 4 
bases: 3473632 
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rRNA: 3 
genes: 3440 
tmRNA: 1 
misc_RNA: 10 
mRNA: 3440 
tRNA: 33 
CDS: 3393 
contigs: 4 
 
 
CONCLUSIONES 
 
La cepa aislada de Bdellovibrio sp fue capaz de lisar las células huésped después de 24 
horas de cultivo, tanto en placa como en cultivo líquido y mantuvo esta característica por 7 
días de incubación. La microscopía reveló un aislado como una bacteria pequeña de rápido 
movimiento. La naturaleza de consistencia de este comportamiento en los métodos de 
aislamiento de doble capa de cultivo de placas confirmó que es una bacteria depredadora. 
La cepa asilada fue identificada como Bdellovibrio bacteriuvorus Kdesi, según lo revelado 
por el análisis de secuenciación completa del genoma a partir del fragmento del 16 S rRNA. 
En el genoma están presentes dos copias de la proteína de biogénesis y competencia de 
Pilus tipo IV que se sabe que son esenciales para la depredación. La información de la 
secuencia de Bdellovibrio bacteriovorus kdesi contribuirá a la comprensión de la diversidad 
del miembro del género Bdellovibrio. 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al Instituto Politécnico Nacional, a la Secretaria de Investigación y Posgrado del Instituto 
Politécnico Nacional y a la Comisión de Operación y Fomento de Actividades Académicas, 
así como por la Beca BEIFI otorgada. 
 
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