19avo teo TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS CELULAS 2

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ADN RECOMBINANTE → cualquier molécula de ADN 
obtenida in vitro por la combinación de 
fragmentos de ADN de distintos orígenes. 
VECTOR DE CLONACIÓN (amarillo en esquema) → 
es una molécula de ADN de doble cadena con 
capacidad de albergar un fragmento de ADN 
exógeno (o sea, de otro origen). 
El fragmento de ADN rojo será incorporado a un vector de clonación → será unido a 
través de una ADN ligasa. 
Existen distintos vectores de clonación → en general se trabaja con VECTORES PLASMÍDICOS 
→ son vectores cuya estructura deriva de los plásmidos bacterianos → que son ADN 
circular de ADN cadena extracromosómicos. Tienen la capacidad de replicarse en forma 
independiente al cromosoma, pueden ser transferidos de una célula a otra y permiten 
clonar fragmentos de ADN de hasta 30mil pares de bases. 
Un VECTOR DE CLONACIÓN 
PLASMÍDICO tiene que tener, en 
su estructura, 3 secuencias 
principales: 
 UN ORI → permite que el 
vector se replique dentro 
de la bacteria que lo 
contiene en forma 
independiente al ADN cromosómico. 
 
 UNA SECUENCIA DENOMINADA POLILIGADOR, PLICONECTOR O POLILINKER → es una sucesión 
de sitios de restricción para diferentes tipos de enzima; permiten seleccionar con que 
enzima se cortará el vector y el ADN a clonar → para generar, en ambos fragmentos, 
extremos cohesivos. 
 
 UNA SECUENCIA DE SELECCIÓN → la cual codifica la expresión de una enzima que sea 
capaz de degradar el antibiótico que se encuentra en el medio de incubación. 
 
 
19° T E O R I C O 
TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 
 
SE NECESITAN ENZIMAS QUE PERMITAN CORTAR AL SITIO POLILIGADOR Y AL ADN QUE SE DESEA 
CLONAR. Se tiene al vector con las enzimas y se generan cortes en el vector, en el sitio 
poliligador, y se generan cortes en el fragmento de ADN que se quiere clonar de manera 
tal de generar extremos cohesivos tanto en el vector de clonación como en el fragmento 
de ADN a clonar. Luego se incuba la mezcla con la enzima ADN ligasa que generará las 
uniones covalentes entre los extremos que se aparean por complementariedad 
molecular. 
UNA VEZ OBTENIDO EL ADN RECOMBINANTE (cuando ya se hizo la ligación entre el fragmento 
de ADN a clonar y el vector plasmídico) → el producto que se obtiene se llama PLÁSMIDO 
RECOMBINANTE o ADN RECOMBINANTE → se lo debe introducir dentro de bacterias, para que 
cuando estas se dupliquen, dupliquen a su vez al plásmido que se introdujo en ellas. 
El proceso de introducción del plásmido recombinante dentro de la célula bacteriana → 
se lo denomina TRANSFORMACIÓN BACTERIANA (paso 3). Se debe incubar a la bacteria en 
presencia de un agente que induzca competencia (que las bacterias sean competentes 
quiere decir que están en condiciones de captar al plásmido con el cual se las incuba); se 
debe agregar al medio de reacción los plásmidos recombinantes y una vez que la 
bacteria captó al plásmido → se las incuba en el medio de cultivo bacteriano (que tiene 
sales, aminoácidos y cofactores enzimáticos). 
LAS BACTERIAS CRECEN EN EL MEDIO DE 
CULTIVO → Y CADA VEZ QUE LAS BACTERIAS SE 
DIVIDAN, SE DIVIDIRÁN TAMBIÉN LOS 
PLÁSMIDOS QUE CONTIENEN → y a su vez, 
estos plásmidos pueden dividirse dentro 
de la bacteria en forma independiente a 
la división del cromosoma bacteriano. 
El medio de cultivo que se utiliza para cultivar bacterias se denomina LURIA BERTANI → 
medio líquido de color ámbar → al medio, además de adicionar las bacterias 
transformadas se les adiciona ampicilina. 
Las bacterias transformadas dentro de ese medio de cultivo se dividirán → cada vez que 
la bacteria se divida, se divide el plásmido (AUNQUE LA DIVISIÓN DEL PLÁSMIDO PUEDE SER 
INDEPENDIENTE A LA MULTIPLICACIÓN DE LA BACTERIA) → luego de una determinada cantidad 
de tiempo, la multiplicación bacteriana será grande → por lo tanto, a partir de una sola 
bacteria se obtienen un gran número de bacterias que contienen en su interior por lo 
menos un plásmido replicado. DE ESTA MANERA SE LOGRA AMPLIFICAR, A PARITR DE UNA 
BACTERIA MUCHAS VECES EL ADN RECOMBINANTE QUE SE INTRODUJO EN LA MISMA. 
SE AGREGA AMPICILINA EN EL MEDIO DE CULTIVO PARA SELECCIONAR QUE SOLAMENTE CREZCAN 
AQUELLAS BACTERIAS QUE CAPTARON EL PLÁSMIDO → O SEA, QUE HAN SIDO TRANSFORMADAS. 
 
SI LAS BACTERIAS FUERON TRANSFORMADAS → estas expresarán la enzima que degrada el 
antibiótico (la ampicilina del medio); y las bacterias van a poder crecer sin ser muertas. 
Una vez que termina la incubación → se toma una alícuota y se siembra una placa con 
Agar + Ampicilina → en esta placa se obtiene una COLONIA DE BACTERIA TRANSFORMADAS 
(aquellas que incorporaron el plásmido). 
A partir de las bacterias transformadas se hace una extracción del plásmido 
recombinante → se extrae el plásmido recombinante para poder utilizar el ADN que se 
clonó exitosamente dentro de las bacterias. 
 
 
 
 
Aquellas bacterias que no 
incorporaron el plásmido → 
no van a expresar la 
enzima que degrada el 
antibiótico y no van a 
sobrevivir. 
EXTRACCIÓN DEL 
PLÁSMIDO 
RECOMBINANTE 
Entonces → se puede tener ADN genómico y este puede ser cortado por enzimas de 
restricción; a partir del genoma de un organismo se pueden obtener muchísimos 
fragmentos de restricción (fragmentos que han sido cortados por las enzimas de 
restricción) → y cada uno de estos fragmentos de restricción puede ser incorporado 
dentro de un vector plasmídico para obtener plásmidos recombinantes. 
Si lo que se incuba con los vectores plasmídicos son los fragmentos que provienen de todo 
el genoma de un organismo → se obtiene fragmentos de ADN que contienen toda la 
información que estaba presente en el genoma del organismo. 
Por otro lado → se puede obtener todo el ARN de una muestra y se podría hacer una 
retrotranscripción obteniendo los ADN que corresponden a todos los ARN expresados en 
esa muestra (células, tejidos u órganos). Los cADN pueden ser también incorporados 
dentro de vectores plasmídicos → obteniendo un conjunto de vectores plasmídicos que 
contendrían toda la información que se expresaba en ese tejido al momento de la 
extracción del ARN. 
Ya sean los plásmidos recombinantes que provengan de la obtención del cADN como los 
plásmidos que se obtienen por recombinación de ADN d un organismo entero y los 
vectores plasmídicos → se puede transformar bacterias en ambos casos: 
 si las bacterias en las placas de colonias contienen plásmidos recombinantes, que en 
su conjunto contendrán a todo el genoma del organismo → en este caso se obtiene 
una biblioteca de ADN genómico. 
 
 si lo que contienen las bacterias transformadas son plásmidos recombinantes que 
incorporaron los cADN que provienen de la retrotranscripción de todo el ARN que se 
expresa en una muestra → se obtiene una biblioteca de cADN. 
 
 
Entonces → se podrá guardar, dentro de placas que contengan un medio selectivo con 
ampicilina, bacterias que tendrán en su interior a los plásmidos que brinden información 
sobre todo un organismo en cuanto a su genoma; o la información de toda la expresión 
del genoma de un organismo (en el caso de hacer una retrotranscripción y una obtención 
de cADN a partir de todo el ARN que contenga el organismo). 
 
 
Para la producción de proteínas se necesita: 
1. la secuencia de la proteína que se quiere producir. 
2. un vector que albergue la secuencia de la proteína que se quiere expresar. 
3. un sistema de expresión. 
La secuencia de ADN de la proteína que se quiere expresar puede provenir de un gen 
obtenido por PCR o de un cADN obtenido por rt-PCR a partir de un ARNm. En general, lo 
más utilizado es un cADN. 
VECTOR → molécula de ADN de doble cadena capaz de albergar un fragmento de ADN 
exógeno (de otro origen). En este caso, el vector que se necesita no es un vector de 
clonación (plasmídico) → SINO QUE SE NECESITA UN VECTOR DE EXPRESIÓN → tiene los mismos 
fragmentos que tiene un ADN de clonación: 
 tiene un ORI. 
 tiene una secuencia queexpresará una proteína que degrade antibiótico. 
 tiene un poliligador → sucesión de sitios de restricción que permiten elegir las enzimas 
de restricción con las cuales se cortaran los fragmentos de ADN y el vector para 
introducir el fragmento allí. 
 sin embargo, a diferencia del vector de clonación → el vector de expresión debe 
tener un PROMOTOR → para favorecer la interacción con el ADN de la ARNpol. SI NO SE 
TIENE AL PROMOTOR, NO SE PODRÁ EXPRESAR EL ADN UBICADO DENTRO DEL VECTOR. 
Además de tener al VECTOR DE EXPRESIÓN, se necesita un SISTEMA DE EXPRESIÓN → será un 
sistema celular, y puede ser: 
 UN SISTEMA CELULAR PROCARIONTE → generalmente se utilizan bacterias. 
 UN SISTEMA CELULAR EUCARIONTE → generalmente se utilizan células de levadura, de 
mamíferos, insectos o gusanos. 
 
 
 
 
 
 
 
Si se tiene la SECUENCIA DE LA PROTEÍNA A EXPRESAR y el 
VECTOR adecuado que albergue la secuencia de la 
proteína a expresar y que contenga la secuencia 
promotora para que se pueda transcribir correctamente el 
ADN de la proteína; y se tiene un SISTEMA DE EXPRESIÓN → el 
fragmento de ADN que contenga la secuencia de la 
proteína será incorporado dentro del vector en la dirección 
correcta (para que se pueda copiar en dirección 5’ → 3’); y 
una vez que ocurra la ligazón → la ARNpol interaccionará 
con el promotor y se activará la transcripción del ADN que 
se introdujo en el vector de expresión. 
SI SE TIENE UNA TRANSCRIPCIÓN CONTINUA SE PODRÁ OBTENER 
UNA GRAN CANTIDAD DE ARN CORRESPONDIENTE A LA PROTEÍNA 
→ el ARN sobreexpresado será traducido a proteína y se 
obtendrá una gran cantidad de la proteína que se 
deseaba expresar. 
 
SISTEMA DE EXPRESIÓN 
Cuando se utiliza como SISTEMAS DE EXPRESIÓN (3) a las bacterias → se puede favorecer la 
expresión de la proteína utilizando como estrategia al OPERÓN LACTOSA → el cual contiene 
una región reguladora que tiene un promotor seguida de una región operadora; esta 
región promotora y operadora tendrá unida a una proteína represora cuando la bacteria 
se encuentre en un medio de cultivo en el cual dispone de glucosa; si la bacteria no 
contiene glucosa en el medio, sino lactosa → la lactosa se unirá a la proteína represora 
cambiándole la conformación, y así la proteína represora abandonará su unión a la 
región promotora/operadora → y una vez liberada la proteína, SE PODRÁ UNIR LA ARNPOL Y 
PODRÁ COPIAR LOS GENES DEL OPERÓN LACTOSA. 
La estrategia fue realizar una construcción que tuviese el promotor del operón lac y se 
reemplazó la zona de los genes lac z (los 3 genes que constituyen el operón lac) por el 
ADN de la proteína que se desea expresar. A TRAVÉS DE TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE SE 
ELIMINA LA ZONA DE LOS GENES LAC Z Y SE INTRODUCE EL ADN DE LA PROTEÍNA A EXPRESAR. 
Una vez realizada la construcción e introducido el cADN → se 
incuban las bacterias en presencia de lactosa o en presencia 
de IPTG (análogo de la lactosa → solo que no se degrada en 
galactosa+glucosa); el IPTG siempre estará presente en el 
medio y siempre se unirá al represor liberándose la zona del 
operador/promotor, con lo cual se unirá la ARNpol y se 
copiara con alta eficiencia al cADN que se introdujo a 
continuación de la región reguladora lac z. DE ESTA MANERA SE 
PUEDEN OBTENER, POR TECNOLOGIA DE ADN RECOMBINANTE, 
GRANDES CANTIDADES DE LAS PROTEÍNAS A EXPRESAR. 
No se puede producir una glucoproteína dentro de una 
bacteria ya que la bacteria no contiene el sistema de 
endomembranas que permite la síntesis y glicosilación y 
secreción de las glucoproteínas → con lo que se debe cambiar el sistema de expresión y 
comenzar a utilizar células eucariontes. 
 
SE UTILIZAN CÉLULAS EUCARIONTES PARA PRODUCIR GLUCOPROTEÍNAS EN GRAN CANTIDAD. Se 
necesita el vector de expresión → el cual debe tener su ORI, un gen de selección y un 
promotor a continuación del cual se introduce el cADN por técnicas de ADN 
recombinante. El vector recombinante será introducido dentro de células eucariontes, se 
cultivan y se deberá generar PERTURBACIONES TRANSITORIAS EN LAS MEMBRANAS PLASMÁTICAS 
DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO para lograr que el plásmido recombinante ingrese a la célula → 
una vez que ingresa, el plásmido recombinante debe ingresar al núcleo celular, una vez 
allí, el promotor del plásmido será susceptible de ser reconocido por una ARNpol que 
transcribirá y luego ese ARN será transportado al citoplasma donde se traducirá la 
proteína de interés. 
NO TODAS LAS CÉLULAS INCORPORAN EL PLÁSMIDO RECOMBINANTE → por lo tanto la eficiencia 
no es muy alta. Y el hecho de que el plásmido recombinante no se incorpore al genoma 
hace que luego de un determinado periodo de tiempo, la célula se deshaga de ese ADN 
extraño degradándolo → con lo cual, se debería volver a transfectar las células 
constantemente durante distintos periodos de tiempo. EL PROCESO DE INCORPORACIÓN DE 
UN PLASMIDO RECOMBINANTE A UNA CELULA EUCARIONTE SE DENOMINA TRANSFECCIÓN → LA 
TRANSFECCIÓN ES TRANSITORIA. 
Como este sistema no es muy eficiente; se desarrolló otro (lado derecho) en el cual se 
tiene los mismos elementos dentro del vector de expresión (promotor, cADN, ORI) pero se 
introduce un nuevo elemento de selección → EL ANTIBIÓTICO NEOMICINA → si la célula no lo 
degrada, se muere ya que es altamente tóxico para las células eucariontes. 
Se toma al cultivo de células, se introduce el plásmido recombinante dentro del cultivo 
celular y LUEGO SE CULTIVA A LAS CÉLULAS EN PRESENCIA DEL ANTIBIÓTICO NEOMICINA. AQUELLAS 
El plásmido 
recombinante ingresa 
al núcleo pero no se 
incorpora al genoma. 
CÉLULAS QUE HAYAN INCORPORADO EL PLÁSMIDO SOBREVIVIRÁN A LA NEOMICINA; Y LAS QUE NO 
LO HAYAN INCORPORADO SE MORIRÁN. 
El ADN correspondiente al vector se va a incorporar al genoma → esta será la condición 
para que se exprese la enzima que degrade al antibiótico. ENTONCES SOLO AQUELLAS 
CÉLULAS QUE INCORPORARON EL VECTOR DE EXPRESIÓN Y ESTE SE INCORPORÓ AL GENOMA → 
PODRÁN EXPRESAR LA ENZIMA QUE DEGRADA NEOMICINA Y PODRÁN SOBREVIVIR EN EL CULTIVO. 
SE TENDRA EL GEN QUE SE DESEA EXPRESAR INCORPORADO EN EL GENOMA Y PODRÁ SER EXPRESADO 
POR LA CÉLULA DE MANERA CONSTANTE → TRANSFECCIÓN ESTABLE → la célula no expulsará al 
plásmido luego de determinado momento, la inserción es permanente y heredable → 
cada vez que la célula se divida va a heredar la transformación en su genoma a las 
células hijas. También se denomina transformación celular ya que la célula incorpora un 
nuevo gen que antes no tenía en su genoma. 
ENTONCES → en el sisrema de expresión eucarionte hay 2 tipos de transfección: 
 TRANSFECCIÓN TRANSITORIA → dura un corto periodo de tiempo; el plásmido 
recombinante de expresión no se integra al genoma y es expulsado de la célula. 
 
 TRANSFECCIÓN ESTABLE O TRANSFORMACIÓN → el plásmido se integra al genoma y se 
podrá obtener de manera heredable y de forma constante la expresión de las 
proteínas deseadas. 
 
VECTOR 
A veces e busca clonar un ADN a través de una transformación bacteriana para obtener 
gran cantidad de ADN dentro de las bacterias que se replicaron; y luego se querrá 
expresar ese ADN → CON LO CUAL UN VECTOR DE CLONACIÓN NO SIRVE YA QUE FALTA EL 
PROMOTOR → habitualmente se saca el cADN del vector de clonación y se lo inserta en un 
vector de expresión. 
Para evitar este paso → se utiliza un VECTOR LANZADERA O 
SHUTTLE → vector que puede ser utilizado para evitar el uso 
de dos tipos de vectores. Este vector contiene un GEN DE 
SELECCIÓN PARA TRANSFORMACIÓN BACTERIANA, un 
POLILIGADOR, un ORI, un PROMOTOR y un GEN MARCADOR DE 
SELECCIÓN PARA NEOMICINA. 
Este vector tiene la capacidad de funcionar como vector 
de clonación si se lo introduce dentro de bacterias; y luego 
se lo puede extraer la gran cantidad de este vector 
clonado dentro de las bacterias y se puede transfectar células en un sistema de expresión 
eucarionte; SE PUEDE A PARTIR DE ESTE VECTOR, SINTENER QUE CAMBIAR DE VECTOR → EXPRESAR 
LA PROTEÍNA DE INTERÉS. 
GENES REPORTEROS 
Un gen reportero es un GEN CUYO PRODUCTO SERÁ FÁCILMENTE DETECTABLE EN UNA CÉLULA y 
por lo tanto puede usarse como: 
 indicador de alguna función (ya sea de una actividad celular o una localización). 
 indicador de una proteína celular. 
 indicador de si la transfección fue exitosa. 
PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (gfp) 
La proteína fluorescente verde permite estudiar la actividad, la localización de una 
proteína celular. Si se quisiera seguir los movimientos o la ubicación de una proteína 
dentro de la célula luego de que esta fue estimulada para dividirse → si se lo quiere 
observar en una célula viva, no se podrán utilizar las técnicas de microscopia clásica que 
implican la fijación celular → entonces se desarrolló una estrategia que es la generación 
de una PROTEÍNA DE FUSIÓN → dos proteínas se transcriben y se traducen unidas de 
manera tal que forman un solo polipéptido; PARA LOGRAR ESTO SE DEBE FUSIONAR EL ADN 
QUE CODIFICA UNA DE LAS PROTEÍNAS CON EL ADN QUE CODIFICA LA OTRA. 
 
Por ejemplo → si se quisiese estudiar la ubicación de la proteína MAPquinasa → el ADN 
de la proteína MAPquinasa denominado ERK se debería fusionar con la proteína 
fluorescente verde GFP → PROTEÍNA DE FUSIÓN GFP-ERK. SE DEBE TENER LOS DOS CADN → EL 
CADN DE LA PROTEÍNA ERK Y EL DE LA PROTEÍNA GFP → Y LOGRAR CONSTRUIR UN CADN QUE 
CONTENGA A AMBOS UNO A CONTINUACIÓN DEL OTRO → cuando este cADN se transcriba se 
obtendrá una proteína que tendrá dos dominios → el dominio de la proteína de interés 
(ERK) y un dominio que estará formado por la proteína fluorescente verde (que será la 
que se podrá seguir en el microscopio). 
Una vez que se tiene el cADN que contiene los dos cADN (proteína ERK y GFP) → SE LO 
INSERTA EN UN VECTOR DE EXPRESIÓN DONDE ESTÉ BAJO CONTROL DE UN PROMOTOR ADECUADO; 
luego se transfecta a las células y se tratará de generar una transfeccion estable a través 
de un marcador de selección usando neomicina → induciendo que el plásmido se 
incorpore al genoma de la célula → luego, una vez que las células incorporaron esto en 
su genoma celular, podrán expresar la ERK que contiene unida a la proteína fluorescente 
verde. 
ESTA TÉCNICA QUE UTILIZA LA PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE ES MUY ÚTIL PARA ESTUDIAR 
PROCESOS EN CÉLULAS VIVAS. El GFP un gen reportero → ya que reporta donde se 
encuentra la proteína ERK en una célula control o en una célula que fue tratada con un 
mitógeno. En la célula control se observa como la 
fluorescencia correspondiente a la proteína de fusión 
con la ERK se encuentra en el citoplasma; cuando las 
células son tratadas con mitógenos, la fluorescencia 
rápidamente transloca al núcleo (donde la proteína 
fosforilará factores de transcripción para activar el 
proceso de división celular). 
PROTEÍNA FLUORESCENTE roja (Rfp) 
De la misma manera que se creó un cADN fusionando el cADN de la ERK y el de la 
proteína fluorescente GFP → se lo puede hacer para cualquier otra proteína con 
cualquier otro cADN de proteína fluorescente. 
 
SE PODRÍA FUSIONAR EL CADN DE RFP CON LA ACTINA → y se 
podría visualizar como se disponen los filamentos de 
actina en una célula que fue transfectada en forma 
estable con este plásmido de expresión; se podría 
visualizar la localización celular de la actina si es que se 
tiene a la actina unida a la proteína fluorescente roja. 
LA PROTEÍNA FLUORESCENTE ROJA ES UN GEN REPORTERO ya 
que reporta como se distribuye la actina en células que 
fueron transformadas en forma estable con esta 
construcción. 
 
LUCIFERASA 
La luciferasa es una ENZIMA; cuando se transfecte células con esta construcción → si se 
expresa la luciferasa, será capaz de convertir un sustrato incoloro en un sustrato con 
fluorescencia → y se podrá medir la transformación en un fluorómetro o en un 
luminómetro. LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA LUCIFERASA REPORTA ALGUNA ACTIVIDAD QUE SE 
BUSQUE ESTUDIAR. 
Se tiene una construcción con: 
 la LUCIFERASA. 
 corriente arriba está el PROMOTOR para que se pueda expresar la luciferasa. 
 corriente arriba del promotor hay una SECUENCIA ER → es el ELEMENTO DE RESPUESTA de 
una región reguladora → es una secuencia de ADN a donde se unirán factores de 
transcripción. 
 
ESTE GEN REPORTERO SIRVE EN PARTICULAR PARA ESTUDIAR LA ACTIVIDAD DE FACTORES DE 
TRANSCRIPCIÓN; si el factor de transcripción está activo y se une al elemento de respuesta 
→ esto induce a que la ARNpol se una al promotor y transcriba la luciferesa → una vez 
transcripta y traducida podrá convertir un sustrato incoloro en un sustrato con 
luminiscencia y se lo podrá detectar. Por lo tanto → si se detecta luminiscencia quiere 
decir que se tiene luciferasa y que esta se transcribió debido a que el factor de 
transcripción en estudio fue capaz de unirse al elemento de respuesta que se 
encontraba en el vector. 
ESTE VECTOR DE EXPRESIÓN ES UTILIZADO PARA ESTUDIAR FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN. La 
luciferasa estará reportando la activación del factor de transcripción. 
 
Una vez unido al elemento de 
respuesta favorecerá la unión de la 
ARNpol en la región promotora y 
favorecerá la transcripción de la 
luciferasa → que luego será traducida 
en el citoplasma y podrá convertir un 
sustrato incoloro en un sustrato que 
emita luz. 
Ligando azul es capaz de unirse a la 
molécula verde (factor de 
transcripción) → una vez unidos, se 
activa el factor de transcripción, 
transloca al núcleo y es capaz de 
unirse al elemento de respuesta. 
 
OGM = ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS; PUEDEN SER PLURICELULARES O 
UNICELULARES. Un organismo transgénico o genéticamente modificado es aquella célula, 
planta o animal que incorporo en forma estable uno o más genes de otro organismo → ya 
sea por inserción, deleción o reemplazo de genes y que puede ser heredado en las 
generaciones sucesivas. 
Las transfecciones estables para la 
producción de proteínas son ORGANISMOS 
UNICELULARES GENÉTICAMENTE MODIFICADAS 
ya que incorporaron el cADN de la 
proteína que se quiere expresar y ese ADN 
que expresa la proteína será heredado a 
sus células hijas. 
TRANSGEN → gen modificado que se agrega cuando se crea un organismo 
genéticamente modificado. 
SE PUEDE ADICIONAR UN GEN DENTRO DEL GENOMA DE UN ORGANISMO DE DOS MANERAS: 
 se puede ADICIONAR DE MANERA HOMÓLOGA y en este caso el gen que se quiera 
introducir en el organismo deberá hacer una recombinación homóloga en un gen 
previamente existente en ese genoma. Si se desea introducir un “gen C” por 
recombinación homóloga en un organismo que contiene el gen A y B → se deberá 
reemplazar, por ejemplo, el gen B por el gen C que es el que se desea introducir; en 
este caso no se estará adicionando un gen sino reemplazando uno por otro. 
 
 la otra forma de incorporación de un transgen al genoma de un organismo es por 
RECOMBINACIÓN NO HOMÓLOGA → en este caso, el gen que se busca incorporar al 
organismo no reemplazará ningún gen previamente existente en el genoma; sino que 
será insertado en una región del ADN donde no perturbe a ningún otro gen del 
genoma → probablemente se incluya dentro de una región no codificante. 
 
 
 
ADICIÓN DE UN GEN 
SE TENDRÁ EL GEN QUE SE DESEA ADICIONAR AL ORGANISMO INCORPORADO DENTRO DE UN VECTOR 
→ este vector será luego introducido en una célula (ya sea por transfección, 
electroporación por una infección viral o inyectando ese vector dentro del núcleo de la 
célula). ESTE GEN DEBE INCORPORARSE AL GENOMA DEL ORGANISMO POR RECOMBINACIÓN NO 
HOMÓLOGA. 
En general cuando se introduce un gen a un organismo y este irá por recombinación no 
homóloga → se deberá incorporarlo con un promotor ya que no se sabe en qué zona del 
genoma se incorporará el gen; y si no tiene un promotor el gen no podrá expresarse. 
 
Entonces → como debe adicionarse tanto el promotor como el gen → la estrategia 
utilizada es incorporarun PROMOTOR REGULABLE → o sea que se lo pueda hacer expresar 
cuando se quiera → que permita que a través de un estímulo el promotor se active y 
desencadene la expresión del gen de interés. 
ANIMAL TRANSGÉNICO 
Obtención de un animal transgénico → se debe 
inyectar la construcción que contiene el gen y el 
promotor regulable dentro de un ovocito que ha sido 
fecundado. En general se inyecta ese plásmido de 
expresión dentro de uno de los núcleos del ovocito 
fecundado → ese ovocito comenzará a segmentarse 
y el embrión que surja de ese ovocito será 
implantado en una rata (por ejemplo) que haya sido 
previamente hormonizada → se hormoniza al animal 
para que el organismo sienta que esta embarazado y 
se pueda implantar el ovocito fecundado que se le 
va a transferir. 
 
De todos los ovocitos que se pueden haber transfectado in vitro y que luego se implanten 
en el útero de la rata → solamente entre un 10% y un 30% de las ratas que se vayan a 
desarrollar serán transgénicas e incorporarán el ADN incorporado en todos los tejidos y las 
células germinales. De aquellas ratas que incorporaron el ADN foráneo, se trata luego de 
obtener una descendencia de manera tal de poder conservar los animales transgénicos 
en las generaciones sucesivas. 
La obtención de animales genéticamente modificados en general es utilizada para la 
investigación y no para la industria alimenticia. 
PLANTAS TRANSGÉNICAS 
La bacteria que se observa → es resistente a los insectos; un 
gen que posee esta bacteria codifica una proteína que la 
hará resistente a los insectos. Lo que se hace es clonar ese 
gen, ya sea por PCR o por tecnología de ADN recombinante, 
se obtienen grandes cantidades del vector de clonación que 
tendrá es gen que codificará la proteína que será resistente 
hacia los insectos → y con esa gran cantidad de vectores que 
contienen el ADN de interés → se recubrirán perlas o partículas 
de oro con esos vectores recombinantes → luego estas 
partículas de oro recubiertas por el vector recombinante se 
empaquetaran dentro de balas de teflón que cargaran una pistola con la cual se 
dispararán células embrionarias de la planta de interés que interesa transfectar y que 
estará en cultivo. 
LAS PLANTAS SON MUY FÁCILMENTE TRANSFORMABLES Y TRANSFECTABLES → adquieren 
rápidamente el plásmido y lo expresan. Una vez que el plásmido llegó al genoma de la 
planta, en general se hace crecer a las plantas en un medio de selección, se selecciona a 
aquellas plantas que han sido transformadas → y luego esos plantines que crecen en 
medio de cultivo se transfieren a la tierra para que se desarrollen las plantas 
genéticamente modificadas → y esas plantas genéticamente modificadas transferirán a 
su descendencia el gen adicionado → SE PODRÁ OBTENER A PARTIR DE ELLA, SEMILLAS QUE 
TENDRÁN EL GEN YA ADICIONADO A SU GENOMA. 
ESTE TIPO DE TECNOLOGÍA SE UTILIZA EN LA TERAPIA GÉNICA 
 
deleción o silenciamiento de un gen 
Los organismos genéticamente modificados, cuando se dileciona o se silencia un gen → 
PERMITEN ESTUDIAR FUNDAMENTALMENTE CUAL ERA LA FUNCIÓN DE ESE GEN. O sea → si se tiene 
un gen de hormona de crecimiento y se lo silencia (no se deja expresar) se verá lo que le 
pasa al organismo → nunca crecerá y terminara muriendo pequeño. 
Entonces → si se quiere estudiar para qué sirve un gen → debe hacerse una deleción del 
mismo. 
 
Para estudiar la función del gen se puede: 
 NOQUEAR EL ADN → para lo cual se debe obtener un organismo transgénico 
genéticamente modificado en el cual, en lugar de introducir un gen, lo que se hará es 
interrumpir la expresión del gen. 
 
 NOQUEAR EL ARNM → de esta manera se induce la degradación del ARNm en las 
células de manera que se impida que se exprese la proteína → se observa que le pasa 
a la célula cuando esa proteína no está. 
 
 INHIBIR LA FUNCIÓN DE LA PROTEÍNA MEDIANTE INHIBIDORES FARMACOLÓGICOS. 
 
En los organismos genéticamente modificados se realiza una construcción que se 
introduce en el genoma por recombinación homóloga → se reemplazará el gen que se 
quiere silenciar por una construcción que no contenga el gen → y por lo tanto el 
organismo no expresará el gen y se podrá ver que le ocurre al organismo en ausencia del 
mismo. 
En general, la construcción con la que se reemplazará al gen que se quiere estudiar → 
será un ADN que contenga la secuencia de una enzima que degrade antibiótico. 
 
Si se quiere reemplazar el gen A en el genoma → se debe obtener un cADN que codifique 
para una enzima que degrade antibiótico → pero este cADN tendrá que tener secuencias 
en ambos extremos del gen para que se pueda intercambiar el gen A por el gen que 
contiene la enzima que contiene a la enzima que degrada antibiótico por 
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA. 
 
SE DEBE OBTENER POR TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE → una construcción interruptora que 
contendrá la secuencia de la enzima que degrada antibiótico; y en los extremos de esta 
secuencia tendrá secuencias que se encuentran en los extremos del gen que se quiere 
reemplazar. En general el antibiótico de elección es NEOMICINA. 
EL GEN DEBE CONTENER: 
 la secuencia de la enzima que degrade al antibiótico. 
 las secuencias que flanquean a la secuencia iguales a las del gen. 
 secuencia de la tirosina quinasa del virus de estomatitis humana. 
 
PROTEÍNA TIMIDINACINASA → va a añadir un fosfato a un compuesto que se llama 
ganciclovir → este adquirirá un fosfato, luego trifosfato y se transformara en un análogo de 
timidina trifosfato.Por lo tanto, cuando se este replicando el ADN para que la célula se 
divida → en lugar de introducir timidina trifosfato, introducirá ganciclovir trifosfato → y 
cuando esto ocurra se detendrá la síntesis de ADN → YA QUE ES UN ANALOGO DE BASE QUE 
BLOQUEALA SINTESIS DE ADN → y cuando esto ocurra, se dejarán de dividir las células y 
morirán. 
Entonces → se tiene la construcción que estará en un vector de expresión que contendrá 
el cADN que tiene la secuencia de la enzima que degrada antibiótico flanqueada por los 
extremos del gen que se quiere reemplazar; y a su vez se tiene la secuencia de la enzima 
timidinaquinasa del virus de la estomatitis humana. Con la construcción se transforman 
células madre embrionarias de ratón (ejemplo) → dentro de esas células madre 
embrionarias pueden ocurrir dos cosas: 
 que ocurra una RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA DE LA CONSTRUCCIÓN QUE SE INTRODUJO 
CON EL GEN X QUE SE DESEA REEMPLAZAR. Si se inserta en el lugar que se quiere que el gen 
se inserte → se reemplazará el gen x por el gen que tiene la enzima que degrada 
antibiótico → y por lo tanto, si se la cultiva en un medio que tiene neomicina → las 
células sobrevivirán. Aquellas células que han incorporado en forma de 
recombinación homóloga a la construcción introducida → no habrán incorporado la 
secuencia de la timidinaquinasa y serán resistentes al antibiótico ganciclovir ya que 
este no se transformara en gaciclovir trifosfato y no podrá impedir la síntesis de ADN. 
 
 que ocurra una RECOMBINACIÓN NO 
HOMÓLOGA → o sea que la construcción se 
inserte en cualquier lugar del genoma 
excepto en aquel lugar en donde se lo 
busca reemplazar. Si el gen se inserta de 
manera no homóloga también se expresará 
la enzima que degrada a la neomicina → 
pero además de esta, expresa a la enzima 
que transforma al ganciclovir en un 
ganciclovir trifosfato y que impedirá que las 
células sigan proliferando → con lo cual se 
van a morir. 
 
DE ESTA MANERA SE PUEDE SELECCIONAR TANTO CON NEOMICINA COMO GANCICLOVIR CUÁLES 
SON LAS CÉLULAS QUE HAN SIDO TRANSFORMADAS POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA DE MANERA 
EXITOSA. 
Una vez que se pudo seleccionar cuales son las células (marrones en esquema) → esas 
células, que ya se sabe que fueron transformadas en forma exitosa con la construcción, 
son inoculadas en un embrión temprano de ratón → el embrión temprano será introducido 
en el útero de una rata previamentehormonizado. Dentro de la cría del ratón habrá 
ratones que van a tener dos tipos de células → las que provienen de las células 
transformadas y las que provienen de las que no estaban transformadas → a este tipo de 
individuos se los denomina QUIMERA O MOSAICOS ya que se tienen células que provienen 
de un origen distinto al de otras células. 
LA CONSTRUCCIÓN CON LA QUE SE TRANSFECTÓ A LAS CÉLULAS PARA GENERAR A ESTOS RATONES → 
además de reemplazar el gen que se quiere mutar con la enzima que degrada 
antibiótico; tendrá algún gen que indique algún color en el pelaje de manera que ese 
color se pueda expresar en los descendientes de la rata. Se podrá detectar a partir de la 
aparición de cambios en el pelaje cuales son los ratones que han incorporado algunas de 
las células a su organismo y cuáles no. Y luego se procede a hacer cría entre los ratones 
que tienen cambios en el pelaje y liego de muchas generaciones se obtiene un ratón 
donde todas sus células provienen de las células donde el gen ha sido sustituido por el gen 
diana → se observa ya que el ratón cambia completamente el color del pelaje; sin 
embargo a todas las descendencias de estos ratones se les debe hacer un análisis 
genético para ver si el gen se expresa o no. SE ESTARÁ EN PRESENCIA DE UN RATÓN 
TRANSGÉNICO KNOCK OUT CUANDO EN LOS DOS ALELOS DEL GENOMA SE HAYA PODIDO DELETAR EL 
GEN → EN GENERAL EL MUTANTE ES HOMOCIGOTA PARA ESA DELECIÓN, CON LO CUAL NO SE 
EXPRESARÁ EN EL ORGANISMO. 
 
SILENCIAMIENTO DE GEN A TRAVÉS DE MICROARN 
Además de deletar el gen → SE PUEDE 
SILENCIAR EL ARN → existen ARN codificados 
por genes denominados microARN → éstos, 
una vez que son procesados por enzimas 
dentro y fuera del núcleo, se convierten en 
una hebra → primero son dúplex de ARN 
complementarios y luego serán separados 
en una sola hebra de ARN molde que 
tendrá la capacidad de aparearse con un 
ARN citoplasmático → si este ARN molde se 
aparea con un ARN citoplasmático, éste 
último será completamente degradado y por lo tanto, ese gen que se expresó en el ARN 
es silenciado → ya que ese producto de expresión ya no puede formar parte de un 
ribosoma o ser traducido a una proteína.