FISH - Dariel Isai Soria Cordova

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FISH
Hibridación fluorescente in situ
Hibridaciones in situ 
(ISH)
Técnicas o métodos histoquímicos que
permiten la localización precisa de
fragmentos de ácidos nucleicos, resultando
en la identificación de componentes
tisulares que pueden verse bajo microscopio.
Hibridaciones in situ 
(ISH)
No se requiere la extracción de ácidos
nucleicos (como en Southern y Northern Blot),
ya que la detección e hibridación se realizan
en el mismo tejido mediante la aplicación de
cadenas complementarias que tienen unidas
moléculas informadoras (sondas).
Método molecular.
Detección de: número, tamaño y
ubicación de segmentos de ác.
nucleicos.
Dentro de células individuales en una
muestra de tejido. 
Basada en capacidad del DNA para
hibridar con su cad. complementaria.
Utilización de sondas con marcadores
fluorescentes que confieren
estabilidad, seguridad y facilitan la
detección.
 
Características de FISH
Metodología
Previos: Preparación y fijación
de tejido
En el proceso más usado se hace una fijación con
formalina seguido de una inclusión con parafina.
Adherir segmentos de tejido al portaobjetos.
Usualmente con polilisina o Vectabond.
Pretratamiento con HCl y proteinasa K.
Posfijación con paraformaldehído.
 
Sondas y marcadores
Segmentos de DNA o RNA
complementarios a región de interés. 
Tan cortas como un oligonucleótido o tan
largas como un cromosoma.
Radiactivas: Isótopos de 32P, 35S, 3H.
No radiactivas: digoxigenina, biotina,
tintes fluorescentes.
 
1.-Preparación de sondas
Marcaje
directo
Se crea una copia
fluorescente de la
secuencia de la
sonda.
Nucleótidos
modificados para
tener fluoróforos.
Marcaje
indirecto
Se crea copia
modificada que
puede volverse
fluorescente.
Nucleótidos
modificados para
tener haptenos.
Preparación de sondas
Tratar con
endonucleasas y ligasas.
Amplificar por PCR.
2.-Desnaturalización de sondas y
especímenes
Se puede realizar
por calor o por
productos
químicos.
 
Desnaturalización de sondas y
especímenes
El DNA puede desnaturalizarse con una solución
de formamida-2XSSC al 70 % a 68–70 °C durante
2 min. Deshidratarse y secarse. 
 También se puede realizar desnaturalización
con baños de agua a 75°C por 5 min. 
 
O directamente en un ThermoBrite
3.-Hibridación
Se combinan la sonda y el
objetivo. Se forman puentes de
hidrógeno entre ellos.
Marcaje indirecto
 
Marcaje directo
 
Hibridación
La mezcla que contiene la sonda se agrega al
portaobjetos, se coloca un cubreobjetos y se incuba a
37°C de 6-12 h.
 
Sondas de marcaje indirecto
Seleccionar sistema de detección, generalmente,
se usa avidina/estreptavidina para biotina y anti-
digoxigenina para digoxigenina.
Se coloca solución de bloqueo, seguida de una
de detección.
Incubando de 15-25 °C después de cada una. 
 
4.-Detección (lavado y visualización)
Se lava el tejido con agua destilada y se añade una
solución antidecoloración o con ayuda de un buffer de
lavado con colorantes que tiñen los cromosomas.
Posteriormente se observa el portaobjetos con
microscopía de fluorescencia.
La técnica en acción
Aplicaciones
Identificación de microorganismos.
Clínica.
Ambientes acuáticos.
Tratamiento de aguas.
Para biorremediación.
En relaciones simbióticas.
Mapeo cromosómico.
Estudio y detección de:
Traslocaciones
Alteraciones cromosómicas.
Expresión de genes
Infecciones virales en tejidos.
1.
2.
3.
Inconvenientes
Autofluorescencia producida por
microorganismos.
Especificidad de la sonda.
Fluorocromos con pérdida de la
fluorescencia.
Dificultad de acceso de la sonda a
la región diana.
1.
2.
3.
4.
Diversidad de la técnica
8. Chromosome Orientation and
Direction (COD)-FISH
9. Combinatorial Oligonucleotide
(COMBO)-FISH
10. Comet-FISH
11. Cryo-FISH
12. Double Fusion FISH (D-FISH)
13. DNA Breakage Detection FISH
(DBD-FISH)
14. e-FISH
Centromere-FISH (ACM-FISH)
armFISH
Catalyzed Reporter
Deposition-FISH (CARD-FISH)
Cellular Compartment Analysis
of Temporal (Cat) Activity by
Fish (catFISH)
Cytochalasin B (CB-FISH)
Chromosome Orientation
(CO)-FISH
Combined Binary Ratio
(COBRA)-FISH
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Diversidad de la técnica
24. Premature Chromosome
Condensation (PCC)-FISH
25. Peptide Nucleic Acid (PNA)-
FISH
26. Quantitative-FISH (Q-FISH)
27. Quantum Dot (QD)-FISH
28. Rainbow-FISH
29. Raman-FISH
30. Replicative Detargeting FISH
(ReD-FISH)
15. Fiber-FISH
16. Flow-FISH
17. Fusion-Signal FISH
18. Halo-FISH
19. Harlequin-FISH
20.Immuno-FISH
21. Locked Nucleic Acids (LNAs)-
FISH
22. Multiplex (M)-FISH
23.Multilocus or ML-FISH
Multiplex (M)-FISH
Marcar todos los cromosomas
del genoma con fluoróforos
espectralmente distintos.
Visualización microscópica
usando diferentes filtros.
Superposión de imágenes.
ACM-FISH: ensayo FISH multicolor para la
detección de anomalías cromosómicas en los
espermatozoides. Ayudó a explicar infertilidad en
algunos hombres. 
1
ARM-FISH: permite la detección de anomalías
cromosómicas en los brazos p y q de los 24
cromosomas humanos, excepto el brazo p de los
cromosomas Y y acrocéntricos.
2
Comet-FISH: Detectar daños en el DNA específicos de
la región del genoma. Implica la unión de DNA en un
portaobjetos recubierto de agarosa antes de la
hibridación in situ.
4
Flow-FISH: las fibras de ADN o las fibras de cromatina
se liberan de los núcleos celulares mediante
extracción con sal o disolvente y se estiran en un
portaobjetos de microscopio antes de la hibridación.
3
Variaciones
comunes de
FISH
Referencias
O'Connor, C. (2008) Fluorescence in situ hybridization (FISH). Nature Education 1(1):171
 (2005). Fluorescence in situ hybridization. , 2(3), 237–238. doi:10.1038/nmeth0305-237 
Rodríguez Martínez, Raúl, & Suescún Otero, Gina. (2013). Aplicaciones e inconvenientes de la
técnica Hibridación in situ Fluorescente (FISH) en la identificación de microorganismos. Revista
Salud Uninorte , 29 (2), 327-340. Recuperado el 21 de marzo de 2022, de
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-
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Salazar-Montes, A.-M., Sandoval-Rodriguez, A.-S., & Arméndariz-Borunda, J.-S. (2022). Biología
Molecular. Fundamentos Y Aplicaciones En Ciencias (1.a ed.). MCGRAW HILL EDDUCATION.
Shakoori AR (2017). Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) y sus Aplicaciones. Estructura
cromosómica y aberraciones , 343–367. https://doi.org/10.1007/978-81-322-3673-3_16
Bonifacino, Juan S.; Dasso, María; Harford, Joe B.; Lippincott-Schwartz, Jennifer; Yamada, Kenneth
M. (2001). Protocolos Actuales en Biología Celular || Hibridación Fluorescente In Situ (FISH). , (), –.
doi:10.1002/0471143030.cb2204s23