Técnicas de Análise Genética

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Técnica ¿Para que la utilizo? ¿Que necesito para llevarla a
cabo?
¿Cómo es el método?
Southern Blot Detección de alguna
anomalía genética, sea
inserción, selección,
duplicación.
1. Enzimas de
restriccion
2. Gel de agarosa
3. Membrana de
nitrocelulosa
4. Sondas marcadas
5. Adn a examinar
Primeramente utilizo enzimas de restricción,
origen proteico y bacteriano, las cuales cortan
secuencias de ADN específicas se producen
fragmentos de restricción.
Introduzco estos fragmentos en un gel de agarosa,
almidón y poliacrilamida, en donde migran de
acuerdo a su peso molecular ( los más pequeños
más rápido )
Una vez que tengo estos fragmentos bien
definidos los traspaso por capilaridad a una
membrana de nitrocelulosa (donde se
desnaturaliza el ADN por la exposición a una
temperatura adecuada) y posteriormente agrego
sondas, fragmentos de ADN monocatenario las
cuales se hibridan con una secuencia específica,
marcado con un elemento radioactivo ( p32) y
observo el resultado con rayos.
Reacción en cadena
polimerasa ( PCR)
Replicación de una
secuencia de ADN
especifica mediante el
uso de cambios de
temperaturas.
Detección de pequeñas
mutaciones y de
expansión por tripletes.
1. Enzima capaz de
soportar cambios de
temperaturas
2. Nucleótidos libres
3. 2 cebadores
4. ADN del individuó
Se desnaturaliza el ADN por el aumento de
temperatura.
Se enfría y se coloca los cebadores que se hibridan
con secuencias específicas.
Al aumentar nuevamente la temperatura
comienza una nueva replicación de 2 cadenas
nuevas debido a los nucleótidos libres,
extendiéndose desde la región donde se
encuentra el cebador.
Se repite el ciclo.
1. Requiere menos tiempo
2. Fácil de usar con poco ADN
3. Pueden utilizarse sustancias menos nocivas
Importante:
Se requiere conocer la secuencia de ADN
adyacente al ADN en cuestión.
No es útil para detectar deleciones grandes en ese
caso se utilizara Southern
Secuenciación de ADN Determinar secuencia
real del ADN que
compone un gen.
Detección de
mutaciones puntuales,
deleciones, inserciones
y reordenamientos.
1. Didesoxinucleotidos (
falta de grupo
hidroxilo)
2. Desoxinucleotidos
3. ADN polimerasa
4. Cebadores
5. Nucleótidos libres
6. ADN a examinar
7. Elementos de
laboratorio
Se ubican en 4 tubos diferentes ( 1 con cada
didesoxinucleotido) la enzima, los cebedores, el
ADN a examinar, nucleótidos libres.
El cebador se hibrida con una secuencia específica
y la enzima polimerasa comienza a sintetizar una
cadena nueva.
En un punto el didesoxinucleotido se añade y
termina la replicación se obtienen
fragmentos que terminan con un
didesoxinucleotido.
Los fragmentos de cada reacción son utilizados en
una electroforesis para así leer luego la secuencia
en un estudio de rayos por ejemplo.
Casi siempre se utiliza esta técnica marcando con
un fluorocromo distinto cada uno de los 4
nucleótido, estos se someten a electroforesis y
son vistos con un láser de luz cuya luz es captada
por una cámara digital para la traducción
electrónica. Cada nucleótido aparece como un
pico de cada color.
Transferencia Western Estudio de la proteínas
codificadas por
un gen normal o
mutante de interés.
Alteración la proteína
codificada
1. Secuencia a examinar
2. Anticuerpos
marcados con
radiación
3. Elementos de
laboratorio.
Las proteinas aisladas en un determinado tipo de
celulas son separadas en función de su tamaño o
su carga mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida,
Se transfieren a una membrana de nitrocelulosa.
Se incuba después con anticuerpos que reconocen
específicamente la proteína que va a ser
analizada.
Un segundo anticuerpo dirigido contra el primero,
y marcado con una sustancia que se puede
detectar por medios histoquimicos, fluorescentes
o
radioactivos, puede poner en evidencia después la
interaccion especifi ca entre el primer anticuerpo
y la proteina objetivo.
FISH Visualización de
alteraciones
Cromosómicas
1. ADN del cromosoma
en metafase
2. Sondas
3. Elementos de
laboratorio
El ADN de los cromosomas en metafase es fijado
en el portaobjeto y desnaturalizado allí
mismo (de aqui la denominacion ≪in situ≫) para
exponer las dos cadenas de DNA
Una sonda marcada se hibrida con el DNA
cromosomico.
La sonda hibridada emite fluorescencia cuando los
cromosomas son visualizados con una luz cuya
longitud de onda estimula el colorante
fluorescente.
A continuación, la localización de la señal de
hibridación, la localización del segmento de DNA
con
el que la sonda presenta hibridación, se determina
al microscopio.
Cualquier cromosoma humano puede ser
marcado con una sonda que emite fluorescencia
con su propia combinación característica de
longitudes de onda luminosas. Después, se
pueden combinar las 24 sondas correspondientes
a los cromosomas humanos para aplicarlas en la
FISH de los cromosomas
en metafase, una técnica que se denomina
cariotipado
espectral (SKY, spectral karyotyping; v. fi g. 5-B,
láminas en color).
Dado que cada sonda especifica de cromosoma
emite
su propia combinacion de longitudes de onda de
fluorescencia, con la SKY es fácil detectar los
cromosomas anómalos constituidos por
fragmentos de cromosomas diferentes, y también
se pueden identificar fácilmente los cromosomas
implicados en el reordenamiento