Técnicas Moleculares- PCR, Southern blot y northern blot

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TECNICAS MOLECULARES:
PCR, Southern blot y northern blot.
OBJETIVOS
Polymerase Chain Reaction
Reacción en cadena de la polimerasa 
Amplificación
Para disponer de cantidad suficiente como para utilizarlo, con fines diversos
Detección
Para poder detectarlo en muestras con pequeñas cantidades del DNA diana
Es un requisito imprescindible que se conozca la secuencia de una parte de la región de DNA o RNA que se quiere amplificar.
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (pp. 201-202) (2a. Ed). Barcelona: Elsevier.
Aplicaciones de la PCR
Clonación acelular de fragmentos de DNA
Detección de células tumorales
Diagnóstico de enfermedades genéticas (dx prenatal)
Preparación de muestras para secuenciación de ácidos nucleicos
Determinación de secuencias específicas de DNA relacionadas con situaciones patológicas definidad
Detección de microorganismos infecciosos
-Son numerosas y muy variadas-
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (pp. 201-202) (2a. Ed). Barcelona: Elsevier.
Principios del método
Es una metodología resultante de la aplicación práctica de tres conceptos:
Desnaturalización: del DNA para dar moléculas monocatenarias
Hibridación: específica de la molécula monocatenaria con un oligonucleótido. Esta es la etapa que justifica por que se debe conocer parte de la secuencia. 
Replicación: de la molécula monocatenaria mediante una DNA polimerasa que emplea el oligonucleótido anterior como cebador
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (pp. 201-202) (2a. Ed). Barcelona: Elsevier.
En la práctica…
Cuatro dNTP
Como sustratos para la síntesis de las innumerables copias de DNA, que deben ir acompañados de Mg2+ para ser reconocidos por la polimerasa.
Se precisan en la mezcla de reacción los siguientes "reactivos": 
Dos oligonucleótidos monocatenarios
De 18 a 30 nt., sus secuencias han de ser complementarias, de modo que los oligos puedan ejercer de cebadores para la replicación de las 2 hebras en la región diana. Por esta razón no puede amplificarse una región de DNA si no se conoce la secuencia de sus dos extremos.
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (pp. 201-202) (2a. Ed). Barcelona: Elsevier.
DNA Polimerasa termoestable 
Enzimáticamente activa a temp. Relativamente altas (75°C).
La replicación a estas temperaturas impide la formación de híbridos contribuyendo así a la especificidad y rendimiento del proceso.
DNA Polimerasa a 95°C
Permite que se recupere su actividad al enfriarse de nuevo y evita así la necesidad de reponer la enzima en sucesivos ciclos. 
Es la enzima más empleada, procede de la bacteria Thermus aquaticus.
Carece de la actividad correctora de pruebas, a pesar de ello es suficiente para los propósitos de la técnica.
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (pp. 201-202) (2a. Ed). Barcelona: Elsevier.
ETAPAS 
enfriamiento rápido de forma que se permite el emparejamiento con los oligos cebadores 
calentamiento para la separación de las dos hebras del DNA
Desnaturalización 
Hibridación
Elongación
en la que la
DNA polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales.
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
ETAPAS 
Sirve principalmente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra
Etapa previa 
Etapa final
consiste en una prolongación
de la última elongación, para permitir que se completen todos los fragmentos.
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
CARACTERÍSTICAS
Rendimiento
la capacidad de copiar secuencias con precisión, sin introducir mutaciones
Sensibilidad
Especificidad
Duración
Fidelidad
la duración de cada una de las tres etapas de cada ciclo y el número de ciclos deben optimizarse
Está determinada especialmente por la secuencia de los dos cebadores utilizados y por las condiciones de hibridación.
los productos de cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulación de copias es exponencial en vez de lineal
la PCR puede permitir detectar una única molécula de DNA en casi cualquier tipo de muestra clínica
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
VARIANTES 
mide la velocidad a la que se va amplificando el DNA.
se trata de una amplificación de RNA a través de la síntesis previa de su cDNA
Su objetivo es superar los límites de la PCR convencional para amplificar con fidelidad regiones diana de gran tamaño
sirve para aumentar el factor de amplificación conseguido, al suponer dos rondas de amplificación.
PCR en tiempo real
RT-PCR
PCR "larga"
PCR "anidada"
consiste en privar a la mezcla de reacción de alguno de sus componentes hasta que se haya alcanzado una temperatura superior a la de hibridación
Esta variante se emplea para clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posición vecinal a secuencias diana conocidas.
PCR con "comienzo en caliente"
PCR inversa
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.VARIANTES 
También puede amplificarse una región de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de restricción unos adaptadores
PCR con adaptadores
se trata de generar copias monocatenarias de un DNA
PCR asimétrica
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
Técnica RT-PCR
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
PCR "anidada"
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
La técnica de transferencia Southern permite la detección y el análisis de un subconjunto de fragmentos de DNA
Es el método estándar para analizar fragmentos de DNA generados a través de la digestión con enzimas de restricción
Southern Blot
Edwin Southern
1975
Bueno Topete M, & González Cuevas J (2013). Técnicas de hibridación. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. McGraw Hill. https://accessmedicina.mhmedical.com/Content.aspx?bookid=1473&sectionid=102743956
 
 Aislamiento de ADN
Digestión con enzimas de restricción
Colocación del ADN sobre un gel de agarosa y aplicación de electroforesis
PROCEDIMIENTO 
Bueno Topete M, & González Cuevas J (2013). Técnicas de hibridación. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. McGraw Hill. https://accessmedicina.mhmedical.com/Content.aspx?bookid=1473&sectionid=102743956
Las moléculas de DNA, son transferidas desde el gel a un trozo de papel de filtro por transferencia y capilaridad
Exposición de la membrana en una placa de rayos X
Bueno Topete M, & González Cuevas J (2013). Técnicas de hibridación. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. McGraw Hill. https://accessmedicina.mhmedical.com/Content.aspx?bookid=1473&sectionid=102743956
Northern Blot
Northern Blot
Técnica de biología molecular utilizada para el estudio de la expresión génica mediante la detección de ARN específico en una mezcla compleja de ARN.
Permite la identificación de ARN en tejidos y organismos en diferentes etapas de diferenciación y morfogénesis
Está basada en el proceso de hibridación en el que el ARN aislado se separa mediante electroforesis en gel, se transfiere a una membrana y se detecta mediante hibridación con una sonda
Cheriyedath, S. (2018, August 23). Northern Blot / RNA Blot. News Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Northern-Blot-RNA-Blot.aspx
Aplicaciones
Aplicaciones
Permite observar un patrón particular de expresión génica entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos.
En estudios de expresión génica para observar la sobreexpresión de oncogenes.
Para la detección de microARN virales
Para cribar recombinantes, detectando el ARNm formado por el transgén.
Cheriyedath, S. (2018, August 23). Northern Blot / RNA Blot. News Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Northern-Blot-RNA-Blot.aspx
 Visualización de uno o pocos genes a la vez.
Requiere una gran cantidad de secuencia de muestra de ARN diana mientras que las técnicas más nuevas, como la RT-PCR no.
DESVENTAJAS
VENTAJAS
Capacidad de definir el tamaño de la cadena de ARN
 La calidad y la cantidad se pueden almacenar y volver a probar años después 
El uso de una sonda quimio luminiscente hace que la técnica sea más rápida
Cheriyedath, S. (2018, August 23). Northern Blot / RNA Blot. News Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Northern-Blot-RNA-Blot.aspx
Northern Blot
Northern Blot
 BE KIND 
 BIBLIOGRAFIA
Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética: Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud (2a. ed.--.). Barcelona: Elsevier.
Bueno Topete M, & González Cuevas J (2013). Técnicas de hibridación. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. McGraw Hill. https://accessmedicina.mhmedical.com/Content.aspx?bookid=1473&sectionid=102743956
Cheriyedath, S. (2018, August 23). Northern Blot / RNA Blot. News Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Northern-Blot-RNA-Blot.aspx
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