evaluacion de la lipasa

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA LIPASA PARA REMOVER MAQUILLAJES
Morales Adelfo
Universidad de La Guajira. Facultad de Ciencias Básicas Y Aplicadas. Programa de Biología. Estudiantes de Bioquímica. 2020
Resumen
Palabras claves: lipasas, hidrolisis, remoción, maquillaje. 
 
Introducción 
Uno de los avances más importantes en la industria de la cosmetología ha sido el uso de enzimas para tratamientos de bellezas no invasivas como la como hialuronidasa, colagenasa y lipasa entres sus propiedades está en que su utilización requieren pequeñas cantidades altamente purificadas ya que son proteínas extrañas al cuerpo pueden provocar una respuesta inmunitaria además pueden obtenerse rápidamente una o varias proteínas, en grandes cantidades y con alta pureza.
La lipasa (glicerol éster hidrolasas), son un grupo de enzima que cataliza la hidrolisis reversibles de los triglicéridos generando como productos glicerol y ácidos grasos libres, las más utilizadas son aquellas extraídas de organismo microbianos o hongos debido a su potencial biotecnológico y su estabilidad en solventes orgánicos, no requieren cofactores y tienen una amplia especificidad en diferentes sustratos, en la industria se han utilizado en diferentes productos ya sea como detergentes o para realzar el sabor u olor, en alimentos, cosméticos tratamientos ambientales y otros campos como la medicina (Fierro et al., 2017). 
Las enzimas son proteína que acelera la velocidad de una reacción química, promoviendo la transformación de diferentes moléculas en producto específicos, la alta especificidad con la que llevan dichas transformaciones y el volumen reducido de desechos que generan en dicho procesos y las condiciones poco agresiva han permitido que esto biocatalizadores ocupen un lugar importante en la industria por lo que la biotecnología a experimentados de manera significativa grandes avances, en este campo , debido a que estas catalizadoras presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores no biológicos. La lipasa está recibiendo día a día gran interés debido a su potencial biotecnológico. Siendo así, esta investigación un propulsor de la implementación de lipasa para la degradación de productos desmaquillantés (Segura et al., 2004; Dandavate et al., 2009)
 La actividad de las enzimas, depende de la concentración de las mismas, de los sustratos, de la disponibilidad de cofactores, de otras enzimas (coenzimas) y de dos aspectos que son la temperatura y el pH por lo que sí estos parámetro están fueras de los parámetro con lo que funciona la enzima se altera, produciéndose un cambio en el estado de ionización de grupos del sitio activo, que ya no es funcional, el pH y la temperatura de cada solución enzimática, donde es diferente (Espinel & López, 2009). 
Marco Teórico
Genero Aspergillus: Los Aspergillus Son de crecimiento rápido, aterciopeladas, algodonosas, lanosas, polvorosas, en blanco, verde, café o negro. Se encuentran ampliamente distribuidos en toda la naturaleza gracias a la facilidad de dispersión y a su pequeño tamaño que este hongo posee, estos pueden permanecer un largo periodo de tiempo en el ambiente. La importancia de la identificación de las especies de los aspergillus consiste en que algunos de estos hongos son virulentos (Abarca et., al 2000).
Aspergillius niger: El Aspergillus niger, es un hongo que ha sido grandemente estudiado por la rama de la biotecnología para producir enzimas y ácido cítrico. Asimismo, para biotransformaciones de residuos y sus tratamientos, pero en los últimos años se ha utilizado para producir enzimas que ayuden a la conservación de los alimentos siento este, importante para la industria. A. niger, es un hongo filamentoso y por el cual, debe tratarse con cuidado para evitar la formación de polvo y esporas. A. niger, se destaca por provocar infecciones pulmonares (Schuster et., al 2002).
Lipasa: La lipasa, es producida por microorganismos y hongos como A. niger que son utilizados para fines comerciales. La lipasa hidroliza triglicéridos a ácidos grasos y glicerol, algunas de estas enzimas son capaces de catalizar reacciones de transesterificacion e hidrolisis e enantioselectivas. Estas enzimas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y forman parte de los procesos metabólicos degradativos. El gran interés por estas enzimas es debido a las diversas propiedades catalíticas que posee, debido a esto es utilizado para producir aditivos en la formulación de detergentes, en la industria alimenticia para la elaboración de productos dietéticos con bajo nivel de grasas y colesterol (Coca et., al 2001).
Maquillaje: En la composición del maquillaje intervienen una multitud de sustancias como; pigmentos, sustancias lipófilas, colorantes. La afinidad que este compuesto tiene en la piel es gracias a los pigmentos con diversas sustancias que este posee, como aminoácidos, lisina, y derivados de la seda (Alcaldea & Pozoa, 2003).
Lápiz labial: Los componentes principales que el lápiz labial posee son la cera que le proporciona consistencia, aceites como base, pigmentos, y humectantes. Los aceites que son generalmente utilizados son el aceite de oliva, manteca de coco, minerales como lanolina o petrolato (Alcaldea & Pozoa, 2003).
Base liquida: Es una mezcla de agua con aceite, silicón o algún otro emoliente, que le da su consistencia líquida. Aquellas con acabado mate usan la arcilla como ingrediente, mientras que las que son a base de silicón usan dimeticona y polisiloxano. También, pueden contener óxido de titanio, óxido de zinc, aceites minerales y/o alcohol.
Objetivos 
Objetivo General 
Evaluar la actividad enzimática de la lipasa para la remoción de maquillajes. 
Objetivos Específicos 
· Aislar y purificar enzimas lipasas a partir de cultivos in vitro de Aspergillus nigar.
· Identificar la presencia de lipasas a través de pruebas de espectrofotometría implementando sustratos específicos ricos en grasas. 
· Analizar la acción enzimática de la lipasa como re movedora de maquillajes.
 Metodología
Aislamiento y Purificación 
Para obtener la materia prima de este proceso, se realizó en primera instancia un medio de cultivo solido de aspergillus nigar, siguiendo la metodología propuesto por (Sanchez, Torreblanca, colom, Martinez.,2018), con algunas modificaciones. 
Inicialmente se pesaron 18g de agar de levadura, disolviendo el compuesto en 500ml de agua destilada, en un el Meyer de 500ml. Posteriormente, la solución fue calentada a 350°c en un calentadora hasta llegar a su punto de ebullición, agitando la solución de vez en cuando, para asegurar una completa disolución del agar. Seguidamente, la solución obtenida fue añadida a 12 cajas de Petri, esperando entre 20 a 30 minutos, que el medio de cultivo se enfriara y semi-solidificara, dejando las cajas Petri expuesta al medio. Al cabo del tiempo trascurrido, las cajas Petri se taparon y se envolvieron en papel azúcar, llevando las a la autoclave, durante 1 hora para esterilizar la disolución. Posteriormente de la esterilización, las cajas fueron sacadas y secadas. En segundo lugar, se implementó la técnica de aislamiento, por dimensión en la superficie de un medio solido en la placa Petri propuesta por (Anónimo, 2019, p. 5). En primer lugar, se prendió un mechero bunse, calentando una pinza ansa al rojo vivo y enfriando cerca del mismo. Seguidamente, se tomó una muestra del cultivo de hongo aspergillus nigar en estado de reproducción, extendiéndose la pinza ansa sobre la superficie 
de la placa sin realizarle presión ni trazos al medio, para evitar daños en el agar. Posteriormente a la incubación de esporas, las cajas de Petri se taparon y se enrollaron en papel trasparente. Este proceso de flamear y enfriar la pinza ansa se repitió sucesivamente antes de la toma de la espora, para cada caja de Petri.
Cabe resaltar, que este proceso fue realizado en el laboratorio de microbiología, tomando las precauciones de seguridad necesarias para la manipulación del material biológico y así mismo, se tuvieron en cuentan los parámetrosnecesarios para el crecimiento del hongo como luz, temperatura y pH. 
Para la obtención de enzimas lipasas, se implementó la metodología propuestas por (Sánchez, 2016). Con algunas modificaciones. 
En primer lugar, se encendió un mechero bunse, calentando una pinza ansa al rojo vivo y enfriando cerca del mismo; realizando un raspado suave a un cultivo de aspergillus nigar añadiéndose 2,5 microlitro (ul)las muestras liquidas obtenidas a varios tubos de ensayo. Por otra parte, se preparó un buffer de potasio Hidrógenofosfato de potasio (KH2PO4) a una contracción de 1M, el cual fue medido por un pHmetro. Para determinar un pH de 7,23. Así mismo, a lo tubos de ensayo con muestras de aspergillus nigar, se les añadió 6ml de buffer; llevando los tubos de ensayo a centrifugación con 500 rpm durante 10 minutos, repitiéndose este paso un total de dos veces. 
Evaluación de actividad enzimática de la lipasa en aceite (Pruebas de espectrofotometría) 
Las muestras obtenidas a partir de la centrifugación de los tubos de ensayo, se filtró en papel filtro, llevando la solución de la enzima adquirida sin residuos al espectrofotómetro, en un tubo de ensayo tapado, para medir su absorbancia. Por otra parte, se preparó el sustrato, a partir de la disolución de 1 ml de aceite de oliva en 15 ml de benceno, trasladando el sustrato al espectrofotómetro en un tubo de ensayo, para observar su absorbancia. Seguidamente a un tubo de ensayo limpio y sin rayas, se le adiciono 1ml de sustrato y 4ml de enzima lipasa, llevando y dejando el tubo tapado en el espectrofotómetro, registrando la absorbancia de la muestra en un intervalo de 2 minutos. cabe resaltar, que este proceso se realizó diversas veces hasta completar el registro de la absorbancia de 5 tubos de ensayo, cumpliendo un total de 100 minutos en la prueba de espectrofotometría. 
Prueba casera de la actividad enzimática de la lipasa en la remoción de maquillaje 
Al culminar los anteriores procesos de la manera más meticulosa, entramos a la fase de prueba. Que consistió, en realizar un cultivo casero de hongo utilizando una rebanada de pan, en el cual, se le agregó aceite y se dejó en ambiente húmedo, cuales osn las condiciones óptimas para la proliferación del hongo A. niger. Al cabo de 20 días ya se podían apreciar las colonias de hongos en el pan y posteriormente se realizó el raspado del cultivo de hongo para colectar cantidades apreciables, en donde se recolectó aproximadamente 1g de A. niger y con una jeringa, se le añadió 1ml de agua potable que equivale a la misma cantidad de A. niger colectado. Todo esto se introdujo en una maquina licuadora por un periodo de 2 minutos, después del tiempo trascurrido, se coló la solución con un colador de tela para evitar el paso de residuos de mayor tamaño en la muestra a utilizar. cabe resaltar que se esperó un periodo 
de tiempo hasta visualizar el precipitado de la muestra, con la finalidad de utilizar el sobrenadante.
Finalmente, se utilizó un Cannis lupus como sujeto de prueba que correspondía al morfo tipo pincher cual se encontraba en etapa adulta; al cual se le untó base de maquillaje y el labial en la parte del muslo cerca de la rodilla. Con una mota de algodón se unto el sobrenadante de la muestra y luego se aplica movimientos singulares en la zona del maquillaje con la finalidad de comprobar la remoción de maquillaje a partir de las lipasas presentes en la muestra. por último, se esperó por un periodo de 20min para verificar que el hongo no haya causado algún efecto de irritación en la piel. 
Resultados y Análisis 
Aislamiento y Purificación de la enzima lipasa.
 
Fig. 1. Instrumentos y materia prima para la purificación y asilamiento de enzimas lipasas. 
Aspergillus nigar presenta altos niveles de producción de lipasas lo cual facilita el aislamiento de estas enzimas. Así mismo, las lipasas microbianas presentan mayor actividad de hidrolisis de grasa como lo describe en su investigación Aceves & Castañeda (2012); a diferencia de las lipasas presentes en la leche materna, insectos, crustáceos y hígado de mamíferos, que su protocolo de aislamiento requiere más procesos de laboratorio. 
Por otra parte, el buffer Hidrógenofosfato de potasio (KH2PO4) a un pH de 7, 25 y una temperatura ambiente constante fueron parámetros que influyeron para la estabilidad de la enzima en este proceso. Debido, a que el buffer a un pH óptico y una temperatura constante activan la enzima y evita la desnaturalización de la misma; lo cual es muy fundamental para analizar la actividad enzimática como le explica Bacerio et al (2015). 
Identificación de lipasa a través de pruebas de espectrofotometría
La actividad enzimática es medida por el grado de hidrolisis; este proceso biológico es el indicador principal para la identificación de la enzima en la muestra. Aunque existen factores fisicoquímicos que influyen en la acción enzimática, el factor más importante que va determinar el grado de hidrólisis de la lipasa es su selectividad frente a los sustratos (Riveira,2010). 
Tabla 1. Datos de absorbancias obtenidos a partir de la degradación del aceite por la lipasa en diferentes intervalos de tiempo.
	Tiempo (min)
	0
	2
	4
	8
	10
	Absorbancia 
	0,84
	0,76
	0,72
	0,69
	0,22
Fuente: Propia del autor. 
Grafica 1. Análisis de la actividad específica de la lipasa. 
Fuente: Propia del autor.
Tabla 2. Promedio del tiempo y absorbancias obtenidos a partir de la actividad enzimática de la lipasa.
	
	Promedio
	Tiempo (min)
	3,5
	Absorbancia 
	0,75
	Fuente: Propia del autor. 
Las lipasas microbianas implementadas presentaron una alta selectividad frente al aceite de oliva, generándose una fuerte relación enzima-sustrato. El estudio realizo por Castañeda y Aceves (2012) describen que esa afinidad de la lipasa por dicho sustrato es debido a los triglicéridos del aceite de oliva, estos en solución acuosa exhiben un grado de ordenamiento elevado por la gran flexibilidad de sus cadenas de ácidos grasos; produciendo este efecto implicaciones favorables para el reconocimiento enzima-sustrato. Esta gran afinidad de la lipasa y el aceite genero a mayor escala la hidrolisis de las moléculas lipídicas. Esta acción enzimática se evidencio a través del declive los datos de absorbancia con respecto al tiempo 
como lo demuestra la gráfica 1, comprobándose a su vez la presencia de las lipasas en las muestras. 
De acuerdo a la investigación descrita por Bacerio et al., (2015) este proceso de hidrolisis es debido a un mecanismo de acción muy singular, que presentan estas enzimas. El centro activo de la lipasa está escondido por una cadena poli peptídica que forma la llamada tapa “lid”, bajo esta forma la enzima se dice que está inactiva, sim embargo, cuando la enzima se encuentra en una interface lípido-agua o en una sustancia que presente micelas microscópicas, estas desplazan la cadena poli peptídica, dejando el centro activo expuestos para la reacción de hidrolisis de grasas. Cabe resaltar, que la región C-terminal de las lipasas es un sitio catalítico mínimo de la enzima, este puede ser responsable de la actividad enzimática frente a sustratos hidrosolubles como los ésteres del p-nitrofeno y grasas simples, características por la cual se hace referencia que las lipasas microbianas presentan mayor capacidad de hidrolisis de grasas que otras lipasas (Riveira, 2010). 
En esta actividad degradativa o hidrolisis, la triolina que son triglicéridos y el componente principal del aceite de oliva entra al centro o sitio activo de la lipasa, formándose el complejo enzima sustrato en el cual los enlaces éster de los triglicéridos se rompe, liberando la lipasa moléculas de glicerol y acido grasos libres como lo describe el estudio de Bacerio et al (2015). Cumpliendo se la ruta de triolina (triglicéridos) a glicerol y ácidos grasos libres. 
Así mismo, los datos del tiempo y absorbancia promediados indicaron que por cada 3,5 minutos transcurrido las lipasas hidrolizaban los triglicéridos y los convertían en glicerol y ácidos grasos permitiendocada vez el paso de los espectros de luz por la muestra, disminuyéndose 0,75 la absorbancia por los minutos promediado (Tabla 2). 
Aunque la acción enzimática depende de diversos parámetros fisicoquímicos como el buffer, pH, temperatura y sustrato; esta actividad hidrolítica de la enzima puede ser inhiba o afectada por iones metálicos, organofosforados, cloroformo y n-hexanoles debido a que pueden desestabilizar la estructura de las enzimas en solución (Arroyo,2007). Sin embargo, las lipasas microbianas de la experimentación no presentaron ninguna inhibición pese a la presencia del benceno en las muestras, que es un disolvente orgánico como el cloroformo y el n-hexano que carece de las propiedades químicas para inhibir la actividad enzimática de las lipasas. 
Cabe destacar, que la actividad enzimática tiene un tiempo y este depende la concentración del sustrato y enzima. Entre mayor sea la cantidad de enzima y menor concentración micelar, el tiempo de degradación será menor, pero entre menor la concentración de la enzima y mayor la del sustrato más lenta será la degradación del sustrato. 
Actividad enzimática de la lipasa en la remoción de maquillaje. 
A nivel industrial las lipasas son implementadas para la remoción de grasas debido a sus propiedades químicas (Aceves & Castañeda, 2012). Estas enzimas por las características que confiere presenta la capacidad de remover productos de maquillaje, ya que los ingredientes principales de estos cosméticos son el agua, los emulsionantes, conservantes, espesantes, 
hidratantes, pigmentos y fragancias; es decir que es su mayoría están compuestos por grasas y agua (Diaz,2017). Sin embargo, los productos de tipo base y labial en su composición presentan mayor contenido de grasas y agua a diferencia de otros cosméticos (Fig.2).
Fuente: Propia del autor. 
Fig.2. Pruebas para determinar el contenido de grasas en diferentes productos de maquillaje. 
Fuente: Propia del autor
Fig.3. Pruebas de remoción de maquillaje a partir de las lipasas en canino.
Pese a la eficacia que se les tribuye a las lipasas para remover grasas, estas enzimas en el estudio evidenciaron poca capacidad para remover maquillajes (Fig.3), es decir que la actividad enzimática de la lipasa frente a estos sustratos fue baja. No obstante, estos resultados pueden estar arraigados a diferentes factores como la ausencia de un buffer en las muestras de enzimas utilizadas en esta fase, la presencia de sustancias en los productos que inhiban a la enzima, carencia de técnicas de laboratorio o incluso por el tipo de grasas que presentan estos cosméticos cuales no son altamente selectivos para la lipasa. Sin embargo, estos resultados no cierran la posibilidad de implementar la lipasa como fuente para la remoción de maquillaje; lo cual sería una gran alternativa para las personas que presentan pieles sensibles frente a los removedores de maquillaje convencionales. 
Cabe resaltar, que las pruebas de remoción fueron aplicadas sobre la piel de un canino debido a las enfermedades cutáneas que produce Aspergillus nigar sobre la piel humana. Sin embargo, estas enzimas microbianas pueden llegar a ser implementadas en la piel humana si 
Conclusión 
· De acuerdo con los datos obtenidos en las pruebas de espectrofotometría, se pudo deducir que la ruta más eficaz para la obtención de lipasa es mediante el hongo Aspergilium nigga; demostrándose así mismo que las técnicas de aislamiento y purificación implementadas en el estudio fueron adecuadas para la obtención de la enzima.
· Se logró inferir mediante los datos de absorbancia que las lipasas microbianas son altamente selectivas frente al aceite de oliva, produciendo a gran escala el hidrolisis de triglicéridos de este sustrato.
· Las pruebas de remoción de maquillaje indicaron baja actividad enzimática de la lipasa frente a sustratos de tipo labial y base, resultados que puede estar arraigados a diversos factores tales como selectividad, inhibición e incluso por la carencia de técnicas de laboratorio en estas fases. 
· Pese a estos resultados en fase de remoción, estos no cierran la posibilidad de implementar lipasas para la remoción de maquillaje, cual puedes ser una gran alternativa como fuente removedora de maquillajes para las personas que presenta sensibilidad en su piel frente a los removedores tradicionales. 
Recomendaciones 
· Utilizar implementos de bioseguridad para realizar el respectivo cultivo de aspergillus niga, tales como (guantes, tapaboca, gorro y bata).
· Al realizar el raspado del cultivo para las fases de laboratorio es indispensable tener encendido el mechero bunsen para evitar el esparcimiento de esporas.
· Medir el pH de todas las sustancias implementadas para las pruebas de espectofotometrias para evitar la desnaturalización e inactivación de la enzima. 
· Revisar minuciosamente que los tubos de ensayo implementados para las pruebas de espectrofotometría no estén rayados para evitar márgenes de error en los datos de absorbancia. 
· Verificar que la temperatura ambiente sea la adecuada y constante durante los días del desarrollo de este estudio. 
· Observar las fechas de vencimiento de los productos de maquillajes implementados en la prueba de remoción, para evitar malos resultados. 
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