Metodologias e Técnicas de Estudo de Vírus

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METODOLOGIAS Y TECNICAS DE LAB PARA EL ESTUDIO DE VIRUS, INFECCIONES VIRALES Y ENFERMEDADES DE ETIOLOGIA VIRAL
nos vamoas a referir a metodologias y técnicas utilizadas en el lab para estudiar los virus, inf virales y eventualmente las enfermedades de etiologia viral, ya sea en el diagnostico, desarrollo de agentes terapeuticos antivirales o en el desarrollo de vacunasl
INTRODUCCION: 
Los virus son paracitos intracel obligados por lo tanto deben ser multiplicados en hospederos que ofrescan las condiciones de suceptibilidad hy permisibilidad a la infeccion y replicacion viral y que puedan ser manipulados en cond de lab. Hay tres sist de multiplicacion que se puede usar para este propocito: 
	los animales de experimentacion.
	Huevos embrionarios.
	Cultivos celulares.
En relacion a los animales, que se pueden utilizar como hospedero para la manipulacion de virus para experimentos e iinclusive con propo de diagnostico. La selección de un modelo animal para amplificar virus en el lab va depender de una serie de factores. En principio el animal tiene que ser suceptible a la infeccion con el virus que queremos manipular. No todos son suceptibles a los mismo virus, en gral lo virus tienen una alta especificidad de hospederos, pueden infectar a unos pocos hospederos animales dif. No todos hay algunos virus que son mas prosmicuos, pero tienen a tener una elevada especificidad. Cuando esta especificidad se rompe pueden ocurrir eventos como una pandemia a partir del paaje de un virus de un hosp animal a otros, como sucede con el covid19.
Pero hay animamles que digamos tienen un mayor espectro de virus que pueden infectarlos, es decir a los cuales son suceptibles y por lo tanto son modelos utiles para diversas inf virales, por ejemplos ratones, conejos, cobayos. Para virus humanos, primates.
La suceptibilidad a la infecion no solo depende ddel modelo animal sino que varia con la via de infeccion, edad del animal y el sexo. Un animal puede ser suceptible por ejemplo cuando el virus es inoculado por via intracerebral, pero puedeser resistente cuando es suministrado por via nasal u oral. La via que seleccionemos tiene que ser una via a través la cual el animal que usemos sea suceptible.
Por otro lado la suceptibilidad varia con la edad, esto depende del virus de que se trate y del animal utilizado. Hay modelos animales que para un det virus solo son suceptibles los animales jobenes por ejemplo los neonatos y los adultos no lo son, o viceversa y el sexo o genero del animal también es importante y también se relaciona con la via de infeccion, por ejemplo hay virus para los cuales los rratones hembras son suceptible por via intraperitoneal y no lo son los machos por la misma via.
Cuando seleccionamos el modelo tenemos que tener en cuenta que se trate de un animal suceptible por una cia suceptible, a una edad a la cual el animal resulte suceptible por esa via, y el sexo del animal también sea suceptible
para que e utilizan los animales de lab en virologia. Son muy utilizados para relizar estudios de patogenesis, es decir como es que se desencadena los fenomenos que conducen que una inf viral se trasnforme en una enfermedad viral. Trambien para hacer estudios de resp inmune a las infecciones y por supuesto, son muy utilizados para la realizacion de estudios preclinicos , osea clinicos pero realizados en animales para el desarrollo de vacunas y terapeuticos antivirales.
Los modelos animals mas utilizados son los primaties no humanos, como chimpancez, tieneen la ventaja que en muchos aspectos se parecen en el punto anatomico, fisiologico funcional se parecen a los humanos. El gran problema de este tipo de modelos es el costo de los animales y la necesidad de mantener el resguardo etico en relacion a la manipulacion de este tipo de animales, alojamiento infeccion que tienen que realizarce bajo condiciones que respeten el bienestar de estos animales dentro de las posibilidades que otorga el objetivo experimental. 
Los monos también son modelos muy utiles, los cerdos utiles en muchos sentiidos son muy parecidos a sres humanos, conejos, ratas, ratones, estos ultimos son muy utiles y tienen la ventaja que uno pude tranajar con poblaciones numerosas a un costo reducido, lo cual permite la realizacion de estudios en los cuales uno necesita tener resultados con una alta significacion estadisticas.
HUEVOS EMBRIONARIOS:
historicamente los huevos emb ahn sido muy utiles en el desarrollo de la biologia como ciencia experimental, refiriendonos al huevo de gallina, especialmente el huevo embrionario aquel que contiene el pollito en gestacion, es un modelo que progresivamente ha sido reemplazado por los cultivos de células animales, pero que todavia es muy utilizado para algunos propositos concreto, uno en particular que es la produccion de vacunas antigripales. La mayoría de las vacunas antigripales son producidas a través de la propagacion del virus de la influeza en huevos de gallinas embrionados. 
En la diapo se puede ver un esquema de un huevo enbrionado con sus dif compartimientos: el saco aereo, el comp de liquido arantoide, la llema , la albumina y en el interior el embrion (pollito en gestacion sumergido en liq admiotico) cada uno de estos compartimientos asi como la membrana que separan presentan dif suceptibilidad a dif virus y uno pued inocular el huevo en dist membranas o distos compart para propagar dif virus. Es un procedimiento engorroso para el cual se exige un entrenamiento especial, hay gente que ah sido entrenada para esto, se ocupa especificamente de inocular con gran precicion el huevo, por ejemplo en la magnufactura del virus de la influenza para la prod de vacunas, en instalaciones que deben inocular miles de huevos para producir la cantidad de vacunas que se requiere para vacunar a la población.
Cultivos de células animales:
el tercer sist de propagacion viral es el de uso mas corriente en la mayoría de los lab y es el que utiliza el cultivo de cel animales. Hay tres tipos dee cultivos 
En que consiste un cultivo primario, como se obtiene:
el cultivo primario se obtiene a partir de un organo o tejido obtenido directamente de un hoispedero animal o de teidos u organos humanos inclusive obtenidos a partir de biopsias o necropsias tempranas . A partir de ese organo o tejido de origen animal que debe ser tomado en condiciones de esterilidad por procedimientos clinicos, enzimaticos y mecanicos, se aislan células, se disgrega ese org o tejido para obtener células separadas y se ponen a cultivar en un medio liquido apropiado como se observa en la sig diapo
Creo que el profe salta una diapositiva
en esta diapo se objerva, que se obtienen las células, se disgregan los tejidos, por ejemplo utilizando una enzima que pueden ser tripsina que corta los enlaces peptidicos que mantienen junidas a las células en los tejidos. Esas cel disgregadas se introducen en una botellas (frascos T), echas de material plastico, se caracterizan por tener caras paralelas y perfectamente transparentes para ppoder observarse con un microscopico invertido. Enonces una vez que las cel son inoculadas en el medio de cultivo, si este medio es apropiado y tiee todos los nutrientes necesarios, y uno le ofrece a esa cel cond fcoqcas como tempeeraturas, ph osmolaridad, etc apropiadas para que las células sobrevivan y se multipliquen , estas se vana multiplicar adeeridas sobre la sup interna de la borella, el interior de la botella esta aislado del medio externo para que no se contamine y el cultivo se mantenga en condiciones acepticas. Si todo esto se cumple, las cel adheridas a la cara interna de la botella (la cara balñada por el medio de cultivo) las cel se van a multiplicar hata que ocupen toda la superficie de la botellla, a esto s denomina un cultivo confluente. 
La historia del cultivo no termina aca porque uno puede subcultivar, haceer un pasaje de es cultivo procediendo a la disgregacion de ese cultivo confluente mediante el tto con una enzima, por ejemplo, otra vez tripsina, entonces uno va a volver a separar estas células de lasuperficie de esta botella, las va a diluir en medio de cultivo fresco y va a trasladar esa dil a una nueva botella para hacer un sub cultivo y asi en esta nueva botella stas células se van a aderir nuevametne sobre la cara interna de la botella y se van a multiplicar hata volver a formar un cultivo confluente que nuevamente voy a poder subcultivar.
En algún momento yo puedo no tener necesidad de seguir subcultivando, lo que se puede hacer es crioperservar (-70°c) en un medio de cultivo especial, uno puede preservar estos cultivos para luego descongelarlo en el momento que los vuelva a necesitar.
El sub cultivo repetido de uno primario da origen a una linea celular.
Linea celular:
Es un sub cultivo repetido de uno primario. Es decir, cuando nosotros hacemos el primer subcultivo de un cultivo primario, ya obtenemos una libnea celular constituida inicialmente por células que son identicas a la células que provinene del cultivo primario, es decir son células euploides, tienen un numero normal de cromosomas, si el organo o tejido a partir del cual obtuvimos el cultivo primario esta formado por células diploides, la linea celular también va a sr diploide. Estas lineas celulares se pueden subcultivar repetidamente , hasta cuando, eso depende, si esa linea celular evoluciona de tal manera que se producen cambios geneticos en algunas células de la linea que eventualmente conduzcan a la inmortalizacion de esa linea celular, es decir que esas cellulas han evolucionado a una condicion en la cual se pueden subcultvar indefinidamente invitro, se dice que se ha stablecido una linea celular o que se ha obtenido una Linea celular establecida. Esto ocurre cuando algunas de las células de la linea sufren cambios geneticos que le permiten a esas células subcultivarse repetidamente invitro. Estto ocurre cuando esas células sufren cambios geneticos profundos, por ejemplo perdida o ganancia de cromo completos, o de partes de cromos que conducen a un estado celular especial que es el de la transformacion celular. Una cel transformada es una cel que ha sufrido cambios geneticos que conducen a cambios fenotipicos profundos que muchas veces hacen que esas células adquieran las caracteristicas de células tumorales. 
Entonces, las lineas cel establecidas stan constituidas or clulas transformadas que han adquirido la capacidad de ser replicadas, de ser subcultivadas indefinidamente invitro. Una linea cel establecida puede ser obtenida por evolucion de una linea cel o directament a partir de células obtenidas de tumores. Una de las lineas cel establecifdas mas conocidas es la linea celular HeLa que es una linea cel establecida a partir de un cultivo cel del utero de una pacte con un tumor de cuello uterino, es decir, es una linea cel de origen humana de células de cuello uterino cancerosas. Las lineas cel establecidas en gral son altamente homogeneas, osea estan constituidas por una pobl cel altamente homogeneas. En principio todas las cel son identicas entre si pq provienen de un clon celular. Un clon es una población cel que provienen de un ancestro común unico. En gral estas cel que componen las lineas cel establecidas son aneuplodides, osea tienen un numero anormal de cromosomas respecto a las células originales, las que fueron optenidas del cultivo primario, ecepto si este cultivo primario era tumoral.
En gral estas lineas cel establecidas tienen prop tumorigenicas, si yo tomo células de este cultivo y si las inoculo en un raton, es posible que este desarrolle un tumor a partir de ese implante.
En esta diapo, se puede ver como es el procedimiento que se debe seguir para obtener un cultivo primario, como a partir de ese cultivo primario se obtiene una linea celular, esta linea cel si no evoluciona a una linea cel establecidad, es decir si las cel de esta linea no sufren una transformacion que las inmortalicen, se van a poder subcultivar durante un num limitado de subcultivos, de tal manera que va a llegar un momento que este cultivo se va a extingruir, y esa es la dif entre una lia cel acecas y una linea cel establecida, esta ultima se puede replicar o subcultivar invitro de maneera indefinida.
EFECTOS CITOPATICOS
como podemos utilizar un cultivo de cel animales in vitro en el estudio de los virus y de las infecciones virales. 
El efecto citopatico es todo cambio celular que esta provocado por una infeccion viral, osea cuando tenemos un cultivo cel y le agregamos un inoculo de un virus para el cual ese cultivo cel es suceptible; esa infeccion viral se va a traducir en cambios en la cel infectada, estos cambios pueden ser de diversas naturaleza desde el punto de vista de lo que podemos observar, pueden ser visible por microscopia de bajo aumento. Los efectos visibles que podemos observar en cel infectada con un virus son: redondeamiento de la cel, que la cel qu usualmente estan adheridas sobre la sup de la botella se empiezan a levantar, osea vamos a observar huecos en la monocapa de cel, vamos a observar sincicions, estos son especies de cel gigantes multinucleadass, vamos a obs la aparicion de anomalias en el interior de las cel visibles como inclusiones.
Estos son los efectos citopaticos visibles mas frecuentes, pero tb en oportunidades vamos a necesitar recurrir a microscopios de mayor aumentos como el electronico de mayor resolucion para poder observar efectos visibles, y en ocaciones, hay infecciones que no se traducen en cambios visibles.
En la parte superior podemos ver un cultivo de cel d95 a sin infectar y en la inferior podemos ver que es lo uqe pasa con este cultivo despues de una infeccion con el virus del sarampio. Se producen huecos en la monocapa celular como aparecen sicicios, osea cel cgigante smultinucleeadas, este efecto citopatico es bien visible y bien manifestado.
En esta imagen (cel infectadas con Adenovirus) se ve un cultivo de cel infectadas con adenovirus, es un cultivo teñido con H-E, donde se obseerva la aparicion de inclusiones PURAS? Y el levantamiento de las células de la monocapa.
Este es un cultivo de cel infectadas con virus respiratorio sinicial, uno de los patogenos respiratorios mas relevantes, especialmente en la primera infancia que las infecciones por este virus como lo indica su nombre, se caracteriza porque producen sincicios, que son los cúmulos que se señalan con el punterro (buscar bien el puntero jaja) en el centro de la fotografia.
Lo que se observa aca es un cultivo de una linea cel llamada a549, donde se puede ver en la periferia de la fotografia el estado normal de esta linea cel del cultivo, como se puede ver es un aspecto homogeneo, y en el centro se puede ver el efecto citopatico producido por la infeccion del virus herpes simple, donde se observa que hay una parte de la monocapa celular que se ah perdido, osea estas células se han lisado y desprendido y también se observan llas células infectadas redondeadas, tipicas del efecto citopatico asociado a la infeccion de este virus.
Eso desdesde el punto de vista cualitativo, ahora vamos a tenr que introducir una deficion cuantitativa que es la definicion de multiplicidad de infeccion
MULTIPLICIDAD DE INFECCION (MOI)
cuando uno infecta un cultivo celular con un virus, uno agrega una determinada cantidad de virus, que nosotros vamos a conocer porque podemos cuantificar como vamos a ver luego con algunos de los métodos de cuantificacion que se dispone.
Si uno conoce cual es la concentración de virus que hay en el inoculo viral que uno esta agregando a ese cultivo, y inocula un vol conocido de ese inoculo viral, y sabe que cantidad de células hay en ese cultivo y por lo tanto que cantidad de cel van a estar expuestas a la infeccion. Se define a la multiplicidad de infeccion como al cociente entre la cant de virus o la cant de viriones que estoy agregando al cultivo y la cant de células que hay en ese cultivo.
Ahora cuando yo agrego ese inoculo viral a ese cultivo celular, como se va a distrribuir esas part virales entre las células del cultivo. La distribución de las partículas virales en un cultivo cel infectadoesta sujeta a una distribución regida por la formula de POISSON esta permite describir como es la distribución de partículas virales entre las células infectadas de tal manera de que nos va a permitir estimar que proporcion de las cel de ese cultivo fueron infectadas y que proporcion de cel no resultaron infectadas, y entre las células que resultaron infectadas, que proporcion de cel resultaron infectadas con un vivrion que , que proporcion resultaron infectadas con dos viriones y que proporcion de cel resultaron infectadas con n viriones. Esto es asi porque cuando uno agrega un inoculo viral sobre un cultivo cel, las partículas virales no se va n a distribuir homogeneamente entre las cel de ese cultivo, sino que al azar; y esa dist al azar hace que debamos recurrir a la formula de poisson para estimar como se han distribuido.
Poison: la formila dice que P(k), donde p de k es la fraccion de cel infectadas por cada particula virales, k es un num que puede irr entre cero y n; osea son las partículas virales que infectaron esa proporcion de cel, es decir si nosotros hacemos que k adopte un valor cero, p de cero va a ser la proporcio de cel que no resultaron infectadas, si hacemos que k adopte el valor de 1; p de 1 nos va a dar la estimacion de la proporcion de cel que resultaron infectada por una particula viral.
e basse del log neperiano
			
m: es el valor de la multiplicidad de infeccion (MOI)
k en este caso es 1.
k!: numeral de K, donde el numeral de K es el producto sucesivo de todos los numeros entre 1 y k, por ejemplo si k es igual a uno !k es 1; si k es 3, el !k seria 1x2x3=6. El numeral de cero es 1 
saber para que sirve la dist de poisson nos va a permitir entender como funcionan los métodos de cuantificacion viral que vamos a explicar a continuacion.
METODOLOGIA II
MÉTODOS DE CUANTIFICACION DE VIRUS
Hay dos tipos de métodos:
	Métodos indirectos
	Inhibicion de la proliferacion celulares
	Lisis celulares
	Métodos directos
los métodos indirectos nos permiten estimar la cantidad de virus en funcion del efecto que ese virus esta produciendo sobre un cultivo celular, en el cual observamos por ejemplo la inhibicion de la proliferacion de ese cultivo o la lisis. Estos métodos en general menos utiles y se recurre a ellos ante la inexitencia de un método directo.
Métodos directos:
dentro de estos métodos directos hay dos tipos, los que cuantifican a los virus por partículas, y los que lo hacen en funcion de su act infeccionsa.
Los de cuantificacion de partículas se basan en la cuantificacion de viriones, por ejempllo por microscop electronico, o de algunos componentes del virion como pueden ser proteínas, una det prot que sepamos que sea del virion y que podamos cuantificar de alguna maneera, esta nos puede dar una estimacion de la conc de virus que tenemos.
O alguna act asociada al virion, por ejemplo hay agunos que tienen actividad hemoaglutinantes, porque en su envoltura tiene una glucoprot capaz de aglutinar hematies. Entonces cuantificamos esa act hemoaglutinante y nos permite estimar de esa manera la cant de part virales, de viriones que hay en una determinada muesta.
* Y por otro lado tenemos los métodos de cuantificacion de act infecciosa. Que estan basados en la capacidad de los virus de infectar hospederos y provocar un efecto que en este caso vamos a tomar como una respuesta. Osea los métodos de cuantificacion de act infecciosa estan basados en la medicion de una respuesta que nosotros vamos a expresar como unidades infecciosas por unidad de vol para darle una forma cuantitativa a esa estimaion
Unidad infecciosa: es la menor cantidad de virus capaz de provocar un efecto biologico detectablee
Efecto biol detectable: en un animal de experimentacion puede ser la muerte del animal como consecuencia de la inoculacion de un virus determinado, o puede ser la enfermedad provocada por la inoculacion de ese virus.
En un cultivo cel el efecto biolog detectable puede ser un efecto citopatico visible como la obs de lisis cel o redondeamiento, formación de sincicios o la aparicion de inclusiones.
La cuestion es tener un efecto biologico que uno pueda de alguna manera estimar o determinar su cantidad y en funcion de eso definir una unidad de medida de ese efecto que nosotros estamos observando y midiendo.
Los métodos de cuantificacion de particual estan basados en la observacion del virion como tal o de algunos de sus compoentes sobre una actividad. Para observar como tal un virion se debe tener un met.
Para la cuantificacion de partículas virales de viriones con un met, esto se realiza de forma revelativa, se cuantifica por un lado un patron por observacion, ese patron se prepara con partículas de latex que tienen que tener un tamaño similar o aproximadamente similar al tamaño del virion que queremos cuantificar, se construye una curva de calibrado con dif diluciones de esas partículas de latex; y luego se hace un recuento de la muestra que queremos cunatificar, y con este entramos a la curva y en funcion de eso estimamos la concentración de partículas virales en la muestra por comparación con el patron.
Por otro lado, se puede cuantificar algún componente del virion por ejemplo, como mencionamos antes un polipeptido, o ahora mucho mas simple hacer la cuantificacion de acido nucleico viral utilizando una tecnica cuantitativa dee amplificacion de ac nucleicos que vemos mas adelante.
Nos vamos a centrar en aquellos métodos de cuantificacion de act infecciosa que son los mas utilizados y que son los mas utiles porque estan basados en la act biologica del virus. Cuando hacemos una cuantificacion de partículas virales no podemos determinar que proporcion de esas partículas son activas biologicamente, es decir tienen capacidad infecciosa. Entonces para la mayoría de los propocito lo que nos intereza es cuantificar la actividad infecciosa. Y para ello tenemos que ocurrir a los métodos emnumerativos por un lado y los cuentales por otro. Estos ultimos estan basados en la medicionde resp del tipo todo o nada, mientras que los emnumerativos estan basados en el recuento de focos discretos de infecciones, como lo dice su nombre estan basados en la enumeraciond e esoss focos discretos, cuyos numeros pueden variar entre cero y infinito. Mientra que lo scuantales admiten dos estados, positivos (aparicion de efecto citopatico) o negativo (la no aparicion de efectos citopaticos) en un cultivo celular, y si trabajamos con un sist de cuantificacion que utiliza animales de experimentacion, el estado prositivo puede ser la muerte o enfermedad del animal, mientras que el negativo puede ser la suupervivencia o la no enfermedad del animal.
Para los métodos cuantales siempre se prefiere utilizar un método de discriminacion que sea lo mas objetivo posible, vamos a poner el ejemplo de la utilizacion de un animal de experimentacion.
La muerte o la supervivencia del animal inoculado es un criterio total mente objetivo, es decir o esta muerto o sobrevivio. En cambio, la identificacion del estado de enfermedad es un criterio bastante sujebtivo, no solo depende de la sujebtividad en relacion para el observador que para algunos un animal con determinada caracteristicas puede considerarloo enfermo y para otro puede ser considerado sano. Sino que también dependen de criteriios no facilmente determinables en relacion a la suceptibilidad idividual de cada animal frente a la infeccion. Entonces, como criterio de cuantificacion para la definicion de una unidad infecciosa que no admita duda, lo mejor en el caso de los animales de experimentacion es utilizar la muerte o supervivencia como criterio de discriminacion. 
En el caso de cultivos de células animales hay que recurrir a la observaciond e eefecto citopaticos que deberian ser lo mas claro posible para poder hacer una discriminacion lo mas objetiva posible entre un cultivo infectado que tenga efectos citopaticos (infectado)y un cultivo que no lo presente.
Cuando decimos un cultivo que presente efectos cetopaticos y en conocimiento de que estos métodos pesenten dosestadosuno posi y uno negativo. Un cultivo que presente un estado avanzado de efecto citopatico por ej el 80% o el 100% de las cel de ese cuktivo presenten un efecto citopatico visible; por ejemplo el 80% de las cel redondeadas o con inclusiones. 
Desde el punto de vista de utilizacion de este método, ese cultivo con alto nivel interno de efeecto citopatico va a ser tan positivo, es decir va a valer lo mismo que aquel cultivo en el que halla una sola célula que podamosobservar con efecto citopatico. A eso nos referimos con que el método solo admite dos estado. Un poquito positivo o todo positivo es lo mismo y se cuenta como positivo.
Este es el método por exelencia para la cuantificacion viral. Una placa de lisis (es lo que dice ahi jaja) esa infeccion tiene que ser una infeccion litica, es decir, la célula infectada por ese virus tiene que morirse como consecuencia de la infeccion (destruirse). Pero para poder transformar esa infeccion litica en un método de cuantific viral nesecito que esa infeccion se lleve a cabo bajo condiciones de diseminacion viral limitada; porque yo voy a necesitar que la infeccion original de una célula de origen a una progenie viral, porque cuando esa cel se infecte con el virus que estoy agregando, este se va a multiplicar y lisa esa célula, va a pasar al medio circundante, yo nesecito que ese virus que pasa al medio circundante NO se disemine libremente por el medio, sino que se transmita a las células vecinas. Si yo csigo que esa infeccion viral quede limitada a la vecindad de la célula que se infecto originalmente.. si yo consigo que esa infeccion original quede limitada a la vecindad de la cel que se infecto originalmnete. Yo no puedo hacer que esa infeccion vecinal se pueda repetir siucesivamente, yo voy a amplificar ese foco dee infeccion hasta que este adquiera un tamaño que resulte visible, dee tal manera que voy a obtener una placa de infeccion de lisis aislada rodeada por zonas del cultivo no liticas. Ese foco de infeccion que estoy observando es el producto de la infeccion de una célula original que yo amplifique luego pero esa célula se infecto originalmente bajo det condiciones con un virion de tal manera que yo al final del proceso voy a tener tanta placas de lisis como viriones tenia originalmente el inoculo con el cual yo infecte ese cultivo celular.
Supongamos que la fig de la izq es un cultivo celular donde cada circulo celeste es una célula no infectada. Ahora yo agrego un inoculo viral formado por dos viriones (imagen der) estos viriones, como saemos que la infeccion de un cultivo celular con un inoculo viral esta regido por una dist al azar que describe la formula de pison se vana distribuir azarosamente en el cultivo y infectar muy probablemente dos cel dif una con cada virion. Ahora ese virus se va a replicar en cada una de estas células y va a producir una progenie viral, osea dentro de cada una de la cel infectada el virus se va a multiplicar y producir decenas, cientos o miles de viriones identicos al virus parental, y ese virus se va a liberar de esa célula cuando se lise y va a pasar al medio. Si no limito la diseminacion de esa progenie viral, se va a ldiseminar libremente en el cultivo e infectar células en el resto del cuultivo en cualquier sitio de ese cultivo.
 De tal manera que al cabo de un tiempo voy a tener cel infectada en todo el cultivo
y si este cultivo continua, al cabo de un tiempo yo voy a tener todas las células del cultivo lisadas. Y lo que voy a observar es una isis completa de ese cultivo qu fue inoculado inicialmente con dos viriones.
Y si yo ubiese agregado solo un virion, el efecto final seria el mismo, lo mismo si hubiera agregado 10 o 1000 viriones, es decir en una condicion de diseminacion no limitada desde el punto de vista cuantitativo el efecto no se relaciona con la cant de virus que agregue inicialmente. La respuesta final es la misma independiente del inoculo que use. Por eso es que este sistema no me sirve para cuantificar.
Cuando la infeccion se lleva a cabo bajo condiciones de diseminacion no limitada, la respuesta final no es proporcional a la cantidad de células infectadas originalmente, y tampoco a la cantidad de virus inoculado en el cultivo.
Supongamos que ahora nosotros infectamos ese mismo cultivo otra vez con un inoculo que contiene dos viriones, pero por un procedimiento tecnico evitamos que la progenie viral que se produce en las primeras cel infectadas se lisen y diseminen liberen libremente, y en cambio pasen a infectar solo las cel vecinas de tal manera que la lisis se va a a concentrar en algunas zonas del cultivo que si yo dejo pasar un tiempo determinado voy a observar como zonas de lisis discreetas o placas de lisis como son las que estan pintadas de color rojo en la diapo
 Para hacer esto hay dos condiciones, 1) baja moi, para que la curva de probabilidades se corra a la izquierda, para que tenga una proporcion baja tirando a inexistente de cel que se infectaron con multiples partículas viral, porque mee interenzan dos poblaciones, las infectadas con 1 part viral y las que no se infectaron. 
En este caso yo agregue dos viriones y obtuve dos placas de lisis, si yo hubiera agregado 1 virion hubiera obtenido una placa de lisis, 10 viriones hubiera obtenido 10 placas de lisis. En este caso la respuesta es directamente proporcional a la magnitud de la cantidad de viriones que yo agregue inicialmente osea, la respuesta es proporcional a la actividad infecciosa del inoculo. 
Ahora yo para poder cuantificar las palcas tengo que conseguir que estas placas esten suficientemente separadas como para discriminar que son diferentes. Si yo observo en un microsc invertido, tengo que observar estas placas separadas. Osea que tengo que agregar una cant limitadas de viriones para obtener una cant limitadas de placas.
Como hago para obtener esa cant limitada de placas, tengo que iinfectar a una multiplicidad de infeccion suficientemente baja para que la cantidad de células que se infecta originalmente sea limitada y esten suficientemente separadas como para poder dsdiscriminarla como dif a las placas generadas. Pero ademas, la infeccion a una MOI baja tiene como consecuencia que yo voy a obtener una condicion que también es necesaria para hacer la cuantificacion por este método, y es que cada placa tiene que derivar de la infeccion de una cel con una particula viral. Porque si una placa es el producto de la infeccion con dos part virales, supongamos que yo al cultivo originalmente le agregue una cant de virus que de acuerdo a la dist de poisson hace que algunas células resulten infectadas con una part viral, pero una proporcion de cel se infecta con dos part virales, al final yo voy a obtener una cant discretas de placas, pero algunas son el prod de infeccion de una cel con una part viral yy otra con dos part virales, entonces ahi la cant de placa s que tengo no va a ser igual a la cant de part virales que agregue orriginalmente, entonces no voy a poder estimar con el numero de placas cual era el numero de viriones infectantes que agrege.
La condicion para poder utilizar este método de cuantificacion es que nosotros tenemos que infectar a una MOI suficientemente baja como para que luego de la infeccion en es cultivo solo tengamos dos tipos de cel, las que no se infectan y la que lo hacen con una part viral, si infectamos en esas condiciones, ademas si podemos lograr que la progenie viral no se disemine libremente por el cultivo, la cant de placas que obtendremos sera igual a la cantidad de viriones infectantes que agregue originalmente. 
Como hacemos para que la población de virus de la progenie no se disemine libremente por el cultivo, esto se puede lograr agregando luego de la infeccion en lugar de un medio liquido un medio semiliqido agarizado que impida la libre difusion de los viriones por el cultivo, de tal manera que las células que se van a infectar con la progenie de la primer cel son las células vecinas. De esa manera me aseguro que el resultado final sea la formación de placas discretas donde cadaplaca es el prod de la infeccion de una célula original con un unico virion.
UNIDAD INFECCIOSA: Es la unidad formadoras de placas. Una unidad form de pacas es la minima cant dde virus capaz de generar una placa de lisis en un cultivo celular.
De tal manera, que la estimacion de la actividad infeecciosa que hagamos utilizando esta metodologia la vamos a expresar en unidades formadoras de placa por unidad de volulmen.
Vamos a tomar la muestra que queremos cuantificar y utilizando una bateria de tubos con medios de cultivo o SF, vamos a realizar una serie de diluciones decimales sucesivas de la muestra que queremos titular. 
 En algunas de las dil vamos a tener la MOI necesaria para que infecten 1 cel con una particula viral 
Tenemos una bateria de ependorf a los cuales les agregamos a cada uno 0,9 mL de medio o SF, al primer tubito le agregamos 0,1 mL del inoculo viral, y ahi tenemos una dil de 10 a la menos 1, mezclamos bien, cambiamos el tip de la microp; tomamos 100 micros o 0,1 ml de esa primer dil y la pasamos al segundo tubo y ahi vamos a tener una dil 10 a la menos 2 y asi sucesivamente vamos a obteners una serie de dilusiones decimales sucesivas de la muestra a titular.
Luego con cada una de esa serie de diluciones, vamos a infectar una serie de cultivos celulares en monocapa que deben ser todos identicos entre si. Si tenemos una bateria de 20 cultivos en botella o placas, tomamos dos de esos cultivos y los inoculamos con un vol determinado de la muestra sin diluir, por ej 0,1 ml, hacemos dos replicas de cada infeccion. Luego tomamos el tubo donde tenemos la dil 10 a la menos 1 y infectamos dos cultivos también con el mismo volumen asi sucesivamente hasta la dil que creamos conveniente, vamos a tener que dejar reservado cultivos que solo lo inoculamos con SF o con cultivo que vamos a utilizar como control negativo.
Luego de la infeccion dejamos en absorcion el inoculo viral durante un tiempo limitado media hs o hasta 1 hs, luego eliminamos el vol sobrenadante de ese cultivo y cubrimos lo cultivos con un cultivo semisolidos para limitar la diseminacion. Luego incubamos a la tem que corresponda, si es un virus humano lo hacemos a 35-37 grados, durante un tiempo determinado que se necesite para la formación de la placa de lisis, para algunos se lleva a cabo en 24 o 48 hs, otros mas lentos, una semana. Uno lo va observando diariamente al microscopio, y cuando puede observar las palacas deiscretas, y antes que estas confluyan se hace el revelado.
Se sacan los cultivos de la estufa de incuv y se le agrega un colorante uqe permita diferenciar las zonas lisadas de las zonas donde permanece el cultivo sin lisar. Alguna coloracion puede ser virtal y otras no , algunas discriminan cel viables de células no viables, mientras que otras solo discriminan zonas en donde hay cel (independientemente que sean viablees o no) de zonas donde no hay células.
Y lo que uno observa es esto, en diluciones crecientes, uno observa desde aquellas diluciones mas concentradas, por ejque es lo que se obtiene cuando se inoculaun cultivo sin diluir la muesta (primer placa izq) donde hay una gran confluencia de infeccion. Luego en la dil siguiente (2) ya uno puede ver placas de lisis mas separadas y en la siguiente (3) uno ya observa muy pocas placas de lisis.
Entonces, uno que es lo que hace para poder estimar la cantidad de virus que hay en esta muestra, selecciona una dilusion para hacer el recuento de placa. Vamos a seleccionar una dil en la cula no tengams palacas confluentes pero que tampoco el numero de placas sea tan escaso como para que el error del recuento sea tan influyente sobre el error final de todo el proceso de cuantificacion. En este caso podriamos seleccionar la dil del medio. Aca falta el control negativo, este no tiene que presentar placas de lisisi, si estas aparecieran, significa que el procedimiento estuvo mal realizado y se descarta todo.
Entonces, aca lo que tenemos es una tabla donde podemos ver que para cada dil cuales son los recuentos correspondientes para una y otra replica. Y al costado los promedios calculados, en gral se elije como dil para hacer el recuento aquella en la cual podamos contrar entre 10 y 100 placas de lisis que este caso seria la dil 10 a la menos 3.
entonces, vamos a calcular eel promedio para esa dilucion que es la que vamos a utilizar para estimar el titulo de esta cuantficacion.
Al titulo lo calculamos haciendo el cociente entre el numero de placas en la dil que seleccionamos en este caso 47 por el producto del volumen con el que inoculamos originalmente los cultivos para la cuantificacion por la dilucion, en est caso, la dil que utilizamos fue 10 a la menos 3. entonces el titulo final para esta muestra por este método es de 4,7 x10 a la 5 unidades formadora de placas por ml de inoculo original.
METODOLOGIA III
CUANTIFICACION POR MÉTODOS CUANTALES 
https://www.youtube.com/watch?v=PIK-Tjt1H7A&feature=youtu.be 
Vamos a ver los métodos cuantales que reciben el nombre de método de titulacion por dil limite y punto final. Estos fueron sistematizados por Reed-Muench a finales de la decada de 1930.
el objetivo de estos métodos es allar cual es la dil de una muestra de virus, que en un vol determinado que nosotros fijamos, es capas de prod un efecto verificable que va a depender del sist de titulacion que utilizamos; si se trata de animales por ejemplo ratones, ese efecto verificable puede ser la muerte, si son cultivos cel seran efectos citopaticos. En defitiva se trata de encontrar el valor de la dil capas de producir ese efecto que nosotros definimos en un porcentaje det, usualmente el 50% de todas las unidades de prueba que son infectada en la titulacion. Unidades de pruebas son, en el caso que usemos animales, cada uno de los ratones que vamos a inocular, si se trata de cultivos cel va a ser cada uno de los cultivos que inoculemos para la titulacion. El efecto que se determina en el caso de los métodos cuantales, es un efecto del tipo todo o nada, estos efecto admiten dos estados, positivos o negativos, si utilizamos animales y nuestros efecto es la muerte, las unidades positivas seran los que murieron, y los negativos los que sobrevivieron. En el caso de los cultivos cel, los positivos seran aqullos que muestren efectos citopaticos, sin importar la magnitud, con una cel basta; mientras que un efecto negativo sera aquel que no presente efectos citopaticos. Tener en cuenta que un cultivo celular en una placa de 96 posiillos tiene alrededor de cienmil o 200mil cel , de estas basta que el observador encuentre una cel con efecto citopatico para definir que todo ese cultivo es positivo.
Entonces, la unidad dee medida de este tipo de método la definimos como unidad de medida a la dosis infectiva para cultivos celulares 50. y como se define la dosis infectiva para cultivos celulares 50, como a aquella dil que es capas de infectar al 50 % de todas las unidades de pruebas infectada en la titulacion. Entonces decimos que en esa dil en el vol con el que vamos a infectar las unidades de prueba vamos a tener una dosis infectiva 50%. en la unidad de volumen de la muestra sin diluir, por regla de tres vamos a determinar cual es el titulo de esa muestra.
COMO ES EL PROCEDIMIENTO que se debe seguir para hacer una titulacion por este método.
 Supongamos que tenemos una muestra de virus, un stok viral aca arriba a la izq , vamos a hacer una serie de dil decimales sucesivas de la muestra, de tal maneral nos va a quedal la muestra sin diluir. Y vamos a tener un control al cuall vamos a inocular solo con el liq de dilucion.
Con cada una de las dil o la muestra sin dil vamos a infectar una serie de cultivos celulares, en este caso no vamos a infectar dos replicas, sino una cantidad mayor de cultivos (si trabajamos con ratas serian ratas). Usualmente se infectan entre 5 y 8 unidades de prueba de cada dilucion. En este caso por ejemplo en la columna 1 vamos a infectar los posillos 1a – 1H cada uno con por ejemplo 50 microlitros de la dil 10 a -1 ; con la columna dos vamos a hacer lo mismo conla dil 10 a la -2 y asi sucecivamente. 
En este caso luego de la dilucion agregamos medio de cultivo liquido NO ES NECESARIO LIMITAR LA DISEMINACION, al contrario queremos hacer que el efecto citopatico sea bien amplio para observarlo con mayor claridad. En la columna control inoculamos loss posillos con identico volumen de SF o medio de cultivo y vamos a llevar a incubar durante un tiempo determinado que va a depender de la rapidez con la que se replique el virus y se provoque efecto citopatico. Alcabo de la incubavion vamos a llevar la placa con los cultivos al microscopio invertido y vamos a observar cada cultivo (posillo) y vamos a determinar si hay efecto citopatico en cada cultivo y vamos a registrar como positivo o negativo por cada cultivo de acuerdo a lo que observamos. Se puede ver en la grafica que a medida que la dil se hace mayor, la proporcion de cultivos con efecto citopatico va disminuyendo y viceversa.
En el grafico representamos cual es el porcentaje de unidades de pruevas positivas, por ejemplo la columna uno todos fueron positivos y registramos el 100%. y en la columna dos tenemos aprox el 90%. es decir en la dil 10 a la -2 vamos a tener un efecto del 90%; y asi sucesiivamente. 
Este tipo de curvas dosis-respuestas, se caracteriza porq tiene una zona central que sta alrededor del 50 % de efecto en el cual la curva se comporta de manera lineal, y ademas tiene la máxima pendiente, lo que implica que en esta xzona la sensibilidad de la cuantificacion es mayor, esto quiere decir que con el menor cambio en la dil que yo hago a la muestra obtengo el máximo cambio en el efecto, por eso es que elegimos como puntoo final de esta metodologia el 50 % porque nos permite treab en una zona lineal en el cual la sensibilidad es máxima.
En la tabla de observacion son resultados hipoteticos
Recordar que un positivo esta definido por cualquier magnitut del efeecto citopatico que observemos en el posillo sin mportar si es el 100% o el 1% de la célula. 
Luego de la tabla de observacion pasamos a una tabla de procesamiento de los resultados; en la primer columna a la izq vamos a poner el log de la dilucion viral, nosotros teniamos la muestra sin diluir y 4 diluciones osea vamos a terner desde 0 a -4 . entonces, en la columna siguiente hacia la derecha vamos a volcar la cantidad de cultivos positivos que le corresponde a cada dilucion. Osea en la dilucion cero, teniamos 5 positivos, y esto es lo que volcamos aquí, en la dil 10 a la menos 1 teniamos 4 positivos y asi sucesivamente. En la columna siguientes vamos a volcar la cantidad total de negativos que registramos para cada dil. En la dil 10 a la cero osea la muestra sin diluir todos los cultivos eran positivos, osea vamos a tener 0 cultivos negativos, en la de 10 a -1 vamos a tener 1 negativo y asi sucesivamente. Si no tuvimos que descartar ningun posillo por contaminacion la suma entre los positivos y negativos nos tiene que dar el total de unidades de prueba.
Luego tenemos que calcular cual es el acumulado de cultivos positivos para cada dilucion, que es la suma de los cultivos positivos de esa dil mas todos los que se acumulan de las dil mas bajas 
En la columna A/(A+B) calculamos la proporcion de cultivos acumulados positivos sobre acumulados totales, lo aacumulado totales son la suma de los acumulados positivos y acumulados negativos.
Si observamos la ultima columna la del procentaje de cultivos infectados, hay dos numeros en rojo porque son los que corresponde a la dil que tiene un efecto proporcional acumulado positivo que esta inmediatamente por encima del 50%, mientras que la dil siguiente estimamos un efecto acumulado positivo respecto al total de 42,9 %, esto es la primer dil que tiene un efectoo inmediatamente inferior al 50%. esto quiere decir que la dil que contiene una dosis infectiva 50 se encuentra entre la dil 10 a la -1 y 10 a la -2; estre estas dos ser encuentra aquella dil de la muestra de virus que contiene la cantidad de virus suficiente para infectar y producir un efecto de infeccion verificable en el 50% de las unidades de pruebas infectadas.
Como nosotros sabemos que en el entorno al 50 % la curva dosis respuesta se comporta de manera lineal, enotnces nosotros podemos trabajar en el entorno de estas dos diluciones como si la curva se comportara como una recta, de tal manera que podemos adoptar la ecuación de la recta para calcular exactamente cual es esa dil porque nosotros tenemos en esa recta dos punto perfectamente determinados que son el log de la dil 10 a la -1; osea -1 que le corresponde un efecto de 87,5%; y a la dil 10 a la -2, ose -2, le corresponde un efecto de 42,9%. osea tenemos una recta perfectamente definida por dos puntos para los cuales sabemos cuales son los valores de x e y, una vez que hallamos la ecuación de la recta, entramos con el valor de 50% de efecto, y de esa manera podemos determinar cual es la dil en la cual exxiste la cantidad de virus que es capas de producir la infeccion del 50% de las unidades de prueva, que es lo que se muestra en la curva de hoy (B).
OJO ES UN ANTILOGARITMO NO UN EXPONENCIAL!!!!!!!!!!!!
Entonces, lo que vamos a decir que en esta dil (1,44x10--2) de la muestra original, nosotros tenemos una dosis infectiva 50% en el volumen de muestra o dil que nosotros utilizamos para infectar cada una de las unidades de prueba.
Entonces, aplicando regla de tres, y refiriendo esto a la unidad de volumen que en este caso va a ser el mL, el titulo va a estar dado por la inversa del prod dee la dil que contiene una dosis infectiva 50% que en este caso es 1,44x10 a la -2; por el volumen que nosotros utilizamos para inocular cada una de las unidades de prueba. 
DIC: dosis infectiva para cultivos 50% por mL.
Recordar que los titulos calculados por este método se expresan en esta unidad