EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (6)

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PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS Y MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL
FACULTAD DE BIOQUÍMICA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS
Santa Fe, Argentina
Proteínas conjugadas
HOLO proteína = APO proteína + grupo prostético
Holo proteína: estructura funcional Apo proteína: polipéptido
Grupo prostético: parte no proteica. Estructura orgánica o inorgánica compleja, unida fuertemente por interacciones no covalentes o mediante enlaces covalentes.
Grupo hemo (grupo prostético)
Mioglobina (holo proteína)
Existe una estrecha relación entre la estructura y la función de una proteína
Plegamiento (folding), desplegamiento (unfolding) y estabilidad de proteínas
Las proteínas cumplen diferentes funciones celulares
La estructura de una proteína está estrechamente relacionada a su función
La variedad estructural de las proteínas refleja la sofisticación y
diversificación de sus roles biológicos
La síntesis de un polipéptido con actividad biológica requiere que se pliegue en forma adecuada y que adopte una conformación 3D específica
Durante el proceso de traducción se pueden producir
modificaciones post-traduccionales
Ciertas enfermedades son el resultado del plegamiento incorrecto de una (o varias) proteínas. Ejemplo: en ciertos casos, la enfermedad de Alzheimer se debe a la acumulación de proteínas mal plegadas (β-amiloide y tau)
https://www.youtube.com/watch?v=yZ2aY5lxEGE
Proteínas intrínsecamente desordenadas
Son proteínas que carecen de una estructura 3D fija u ordenada
Cubren un espectro de estados, desde completamente desordenadas a parcialmente ordenadas
Su descubrimiento desafía el paradigma de la relación
estructura/función
La dinámica de proteínas es crucial para estos sistemas. La técnica de RMN juega un rol fundamental para su estudio.
Las proteínas intrínsecamente desordenadas pueden adoptar una forma fija luego de unirse a otra macromolécula
Conformational flexibility in SUMO-1 protein (PDB: 1A5R). The central part shows relatively ordered structure. Conversely, the N- and C-terminal regions (left and right, respectively) show ‘intrinsic disorder’, although a short helical region persists in the N-terminal tail. Ten alternative NMR modeles were morphed. Secondary structure elements: -helices (red), -strands (blue arrows).
El problema del plegamiento
Particularmente importante durante la expresión de proteínas recombinantes, tanto en organismos homólogos como heterólogos
La síntesis debe transcurrir en el medio adecuado y a la velocidad adecuada para un plegamiento correcto
La estabilidad conformacional depende de las características fisicoquímicas del medio y de distintas variables, tales como pH y temperatura
El plegamiento puede ser correcto (traducción, modificación y plegamiento inmediato) o incorrecto (agregación, cuerpos de inclusión y/o proteólisis)
Experimento de Anfinsen con la RNasa
La estructura primaria de una proteína condiciona el plegamiento y la estructura 3D de la misma
El proceso puede ser reversible y esa es una de las razones por la que se supone al estado nativo como el de mínima energía en determinadas condiciones
La elaboración de la teoría sobre la relación entre estructura primaria y conformación 3D de una proteína fueron la base para el Premio Nobel en Química otorgado a Anfinsen en 1972
Los puentes disulfuro ayudan a estabilizar la estructura, pero no condicionan el plegamiento
La conformación nativa de una proteína se encuentra termodinámicamente favorecida
El número de combinaciones de ángulos φ (phi) y Ψ (psi) que determinan las posibles conformaciones de una proteína pequeña es increíblemente vasta
Las proteínas son guiadas por la termodinámica a través de un vasto laberinto de posibles conformaciones
La conformación biológicamente más relevante (o nativa) generalmente es la que se encuentra más favorecida energéticamente
La estructura de la conformación nativa se encuentra especificada en la secuencia primaria
Si el polipéptido debiera explorar al azar todas las posibles conformaciones hasta encontrar la estructura nativa, el proceso de plegamiento demoraría miles de millones de años para completarse
Obviamente, el proceso dentro de las células sigue un procedimiento más ordenado
Termodinámica del proceso de plegamiento
En general, la diferencia de energía libre entre el estado nativo y el desnaturalizado es pequeña
A esa variación de energía libre (ΔG) contribuyen términos entálpicos (ΔH) y entrópicos (ΔS)
https://www.youtube.com/watch?v=Qq4T7-UrIvE
Etapas del proceso de plegamiento
Episodios iniciales
Formación de estructuras secundarias 5 ms después de iniciado el proceso, lo que se conoce como fase de estallido (proceso muy rápido)
En proteínas globulares (núcleo hidrofóbico compacto), la fuerza conductora del
plegamiento es el colapso hidrofóbico (expulsión de las moléculas de agua)
Formación del glóbulo fundido, una especie similar a la proteína nativa pero sus cadenas laterales están muy desordenadas, su estructura fluctúa más que la del estado nativo y sólo tiene estabilidad termodinámica marginal
Episodios intermedios
Estabilización de las estructuras secundarias
Formación de la estructura terciaria
Proceso relativamente lento (5-1000 ms)
Episodios finales
La proteína adopta la forma nativa
El polipéptido realiza una serie de movimientos complejos para lograr un empaquetamiento óptimo, formación de puentes H y expulsión de las moléculas de agua remanentes
Proceso lento (varios segundos)
Citocromo b562. (a) Glóbulo
fundido y (b) estado nativo
Estructura nativa
Glóbulo fundido
Teoría clásica del plegamiento protéico
Las proteínas se pliegan mediante una serie de intermediarios bien
definidos
Formación al azar de tramos cortos de estructura secundaria (hélices α y giros β) que actúan como núcleos para la estabilización de regiones ordenadas adicionales
Crecimiento de los núcleos por difusión, colisión al azar y adhesión de dos o más de estos núcleos
La estabilidad de las regiones ordenadas aumenta con el tamaño, es decir, luego de alcanzar cierto tamaño estas regiones crecen de manera cooperativa hasta formar un dominio similar al nativo
Mediante una serie de ajustes relativamente pequeños, el dominio se rearregla a la estructura terciaria más compacta de la conformación nativa
Teoría del paisaje del plegamiento proteico
El plegamiento se produce sobre una superficie de energía o un paisaje que representa los estados de energía conformacional disponibles para un dado polipéptido
Las coordenadas horizontales de cada punto sobre esta superficie representa una conformación particular del polipéptido, es decir, los valores de ángulos φ (phi) y Ψ (psi) para cada aminoácido y los ángulos de torsión de sus cadenas laterales
La coordenada vertical de un dado punto en dicha superficie representa la energía libre interna del polipéptido en esa conformación particular
La superficie de energía tiene forma de embudo
El vértice representa el estado nativo (mínimo de energía libre total)
El ancho en cualquier altura por encima del estado nativo indica el número de estados conformacionales con una determinada energía libre, es decir, la entropía del polipéptido
Teoría del paisaje del plegamiento proteico
Los polipéptidos se pliegan por medio de una serie de ajustes conformacionales que reducen su energía libre y su entropía, hasta alcanzar el estado nativo
La superficie de energía de una proteína que se pliega según la visión clásica del plegamiento debería mostrar un surco radial profundo con una pendiente hacia el vértice
Esto significa que el plegamiento es relativamente rápido, pero la búsqueda de dicho surco demandaría	mucho tiempo, lo que implica que el inicio del proceso demandaría varios segundos
No existe una única vía	(o un conjunto de vías relacionadas) que
deba seguir un polipéptido al plegarse a su conformación nativa
Esto implica que la superficie de energía no es lisa sino que presenta una topografía rugosa, con mínimos y máximosde energías locales
El proceso de plegado in vivo es bastante ineficiente
Una estimación reciente sugiere que el 30% de las proteínas sintetizadas nunca adquiere su conformación correcta
El plegado en el RE es la etapa limitante en la biogénesis de
numerosas proteínas de secreción
Las proteínas que no se pliegan correctamente son degradadas
Además de las chaperonas, otros compuestos pueden colaborar en el correcto plegamiento (glicerol y trehalosa, entre otros)
Saccharomyces cerevisiae contiene aproximadamente 200.000 ribosomas y como un tercio de las proteínas pasa por el RE, éste debe procesar unas 10.000 proteínas/min
El plegamiento es ineficiente
Proteínas que intervienen en el proceso de plegamiento
Peptidilprolil cis-trans isomerasa
Las uniones peptídicas X-Pro (donde X es cualquier aminoácido) se sintetizan en configuración trans. Sin embargo, de las uniones X-Pro encontradas en proteínas maduras
~6% están en configuración cis.
Proteína disulfuro isomerasa
Es una enzima presente en el RE de los eucariotas que cataliza la formación y ruptura de puentes disulfuro entre cisteínas dentro de una proteína mientras esta se está plegando.
Chaperonas
Chaperón, na: persona que acompaña a una pareja o a una joven
para vigilar su comportamiento
Chaperonas: proteínas que participan en el plegamiento de las proteínas, previenen la agregación y colaboran en el replegamiento
En Escherichia coli y otras bacterias:
Chaperona hsp70 (DnaK) y co-chaperona hsp40 (DnaJ)
Chaperoninas hsp60 (GroEL) y hsp10 (GroES)
Bolsillo para la unión de sustrato de hsp70
Vista superior del complejo GroEL/GroES
Estructura nativa
Estado conformacional funcional estable, de mínima energía en un
rango de temperatura y condiciones específicas del medio
Funciones específicas
Interacción con otras proteínas
Interacción con ácidos nucleicos
Interacción con ligandos pequeños
Distintas características como macroión
Propiedades fisicoquímicas
Forma, tamaño, propiedades hidrodinámicas
Carga superficial (movilidad electroforética)
Hidrofobicidad-hidrofilia
Solubilidad
Propiedades espectroscópicas (absorción UV, absorción/emisión de fluorescencia, difracción de rayos X, dicroísmo circular, RMN)
Proceso de desnaturalización proteica
Estado nativo (N). Estado conformacional funcional estable, de mínima
energía en un rango de temperatura y condiciones específicas del medio
Estado desnaturalizado (D). Estado desplegado donde se pierde la funcionalidad, cambian su forma y los parámetros fisicoquímicos dependientes de la forma (hidrodinámicos), hidratación y propiedades espectroscópicas.
Es un proceso cooperativo y generalmente se puede estudiar como un
equilibrio entre dos estados: D ⮀ N
Los estados intermedios, parcialmente plegados, generalmente son indetectables
El desplegamiento se produce por aumento de temperatura, cambio de pH, agregado de agentes caotrópicos (urea, cloruro de guanidinio)
El seguimiento se puede efectuar por métodos espectroscópicos, fluidodinámicos, calorimétricos
Se puede determinar la constante de equilibrio de desnaturalización y su energía libre
N ⮀ D
Keq = [D]eq / [N]eq
G0 = H0 - TS0 = -RT ln Keq Keq = (yN - y) / (y - yD)
y: parámetro utilizado para seguir el proceso de desnaturalización
Renaturalización de proteínas recombinantes
Tanto para estudios estructurales como para usos biotecnológicos (farmacéuticos, industriales) se requieren cantidades apreciables de proteínas nativas purificadas
La producción de las mismas en forma recombinante, en hospederos como Escherichia coli, en muchos caso conlleva a una elevada producción pero en forma de cuerpos de inclusión insolubles
La ventaja de los cuerpos de inclusión es que se obtiene la proteína en grandes cantidades, relativamente pura y que es menos susceptible a la degradación por proteasas
La desventaja es que está insoluble y desnaturalizada
Es necesario, por lo tanto, contar con herramientas para la solubilización y renaturalización de esos cuerpos de inclusión
El procedimiento de renaturalización puede llevarse a cabo por tres procesos principales
Dilución
Intercambio de solvente por diálisis o cromatografía de exclusión molecular
Adsorción reversible a un soporte cromatográfico (puede servir sólo para inmovilizar, aislar y permitir el cambio de condición, o puede tener un ligando específico que facilite el plegamiento)
Proporción de éxito con los distintos procedimientos de renaturalización
Componentes más utilizados solubilizar y renaturalizar proteínas
Generalmente se requieren también compuestos reductores (2-mercaptoetanol, ditiotreitol, glutatión)
urea
cloruro de guanidinio
El primer paso es obtener la proteína soluble, lo más pura posible, aunque desnaturalizada
Hay diferentes protocolos, se
muestran dos a modo de ejemplo
En general el agente solubilizante es un caotropo como la urea o el cloruro de guanidinio
Solubilidad de proteínas
Múltiples grupos ácido-base, con carga y/o polaridad, que adoptan una conformación hidratada determinada determinan las propiedades de solubilidad de la macromolécula
La solubilidad de una proteína es, consecuentemente, dependiente de la concentración de sales disueltas, de la polaridad del solvente, de la presencia de detergentes o de solventes orgánicos, del pH y de la temperatura
Los agentes caotrópicos (urea, ión guanidinio) o que afectan la estructura del agua también afectan la solubilidad y el estado conformacional nativo
Las condiciones de estabilidad son particulares de cada proteína
Para precipitar proteínas en general se usan sales con iones divalentes, tales como el sulfato de amonio
Fuerza iónica: I = ½  Ci Zi2, donde Ci = concentración molar de las
especies iónicas y Zi es la carga de las especies iónicas
En general, la solubilidad de una proteína se incrementa con el agregado de sal: salting in
Luego, a medida que las sales comienzan a competir con la
hidratación de la proteína, la solubilidad disminuye: salting out
Salting in/out para HbCO
(carboxi-hemoglobina)
Efecto del agregado de sal para diferentes proteínas
Solubilidad de la β-lactoglobulina en función del pH a distintas concentraciones de NaCl
Métodos para la cuantificación de proteínas
Kjeldahl. Método de referencia. Consiste en la mineralización del N
y la subsiguiente cuantificación del amonio liberado.
Biuret. Se basa en la formación de un complejo entre la proteína y el Cu2+ en medio alcalino y la posterior reducción a Cu+.
Lowry. Resulta de la combinación del método de Biuret más el reactivo de Folin-Ciocalteau (ácido fosfo-tungsto-molíbdico). Presenta alta sensibilidad. Paper más citado de la historia.
Reacción del ácido bicinconínico. Se basa en la reacción de Biuret.
Unión a colorantes. Ejemplo: Azul de Coomasie.
Absorbancia a 280 nm.
Cuantificación específica:
Algunas proteínas tienen propiedades espectrales características (hemoglobina)
Uso de anticuerpos: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Mas de 275 mil citas hasta enero de 2004
Absorbance spectra for protein standards in the Thermo Scientific Pierce Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay. Protein standards are 0, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 and 2000
µg/mL of bovine serum albumin, respectively. The 2000 µg/mL line is drawn thicker than the others to orient the sequence. Notice that an inverse relationship between protein concentration and absorbance occurs below 525 nm (maximum at 465 nm).